均化·反應完成的判定方法以及使用該方法的溶液濃度測定方法
2023-05-14 03:23:51 3
專利名稱：均化·反應完成的判定方法以及使用該方法的溶液濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及測定溶解於被測液中的溶質例如蛋白質的濃度的溶液濃度測定方法以及溶液濃度測定裝置。更具體地說，本發明將試劑液混合到含有特定成分的被測液中，使只起因於特定成分的上述被測液的光學特性發生變化，由此測定該特定成分的濃度。特別是，將被測液與試劑液混合，使蛋白質成分凝集，通過檢測透過注入後的被測液的光的減少和/或傳導進被測液時發生的散射光強度的增加，來測定該蛋白質成分的濃度。
本發明通過使混合液的透射光強度、散射光強度與混合後的時間的關係滿足規定的條件，來判定被測液與試劑液已充分攪拌至均勻。由此可同時判定被測液與試劑液的反應已完成。這樣，通過判定均化和反應的完成，可以充分且必要地設定測定時間，縮短測定時間。特別是，在不控制被測液與試劑液的混合液的溫度時，通過充分且必要的測定時間，可以實現高可靠性，獲得實用性高的溶液濃度的測定方法。
背景技術：
傳統的溶液濃度測定方法中，是將被測液與試劑液以規定容量比混合，通過充分攪拌至均化來製備混合液。然後以規定溫度將該混合液混合，在經過了規定時間時測定該混合液的光學特性，由此確定濃度。其中，在利用酶促反應和抗原抗體反應等的生化反應來測定特定成分的濃度的方法中，大多將規定溫度設定為生物體溫度附近的37℃。並且大多將規定時間設定為反應足夠完成的時間。當然，由於反應速度與溫度和濃度等相關，因此在規定溫度下，會相對於被測樣品所顯示的濃度，設定足夠完成反應的時間。
這樣，一直以來都是在充分攪拌至均化，在反應確實充分地完成的條件下測定光學特性。即相對於均化和反應完成設定了充分的條件。
另外，傳統的溶液濃度測定裝置中，將被測液置於具有光可傳導進被測液中的結構的樣品皿中。該樣品皿為玻璃的長方體，透射面透明。因此，光可以傳導進被測樣品中。將被測液和試劑液導入樣品皿並混合時，要將樣品皿從用於測定光學特性的光學系統中取下，進行如下操作。
通常，該樣品皿的上部開放，通過滴管、安全移液管或注射器等由該上部導入規定容量的被測液。接著，將規定容量的試劑液混合，使被測液與試劑的容量比一定。然後，在樣品皿中用攪拌棒或攪拌器等進行攪拌，直至充分均化。通過恆溫水槽等使每個樣品皿保持在規定的溫度，接著經過規定時間後，將樣品皿重新設置於光學系統內，測定樣品皿中的混合液的光學特性。
但是，傳統的溶液濃度測定方法步驟數多，使得傳統的溶液濃度測定裝置的規模變大。並且還有測定時間增長的問題。因此，希望開發不使用恆溫水槽等，具有簡單構成的溶液濃度測定裝置，以及容易實施自動化的溶液濃度測定方法。
另外，經過取出、裝入樣品皿的步驟，使得光學系統的位置發生微妙變化，測定結果容易產生誤差。並且由於需要複雜的操作，還容易發生誤操作等，可靠性變差。
本發明考慮到上述問題，其目的在於提供可靠性高、容易實施自動化的溶液濃度測定方法；以及可靠性高，容易實施自動化且小型的溶液濃度測定裝置。本發明進一步提供使至均化和反應完成所必需的時間為最小限度，可縮短測定時間的溶液濃度測定方法和溶液濃度測定裝置。
發明內容
本發明涉及均化·反應完成的判定方法，其特徵在於包括下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)間斷性地多次或連續地測定混合後的上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定以後所經過的時間的關係的步驟；以及(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。步驟(1)-(4)按照所標順序進行。
在該均化·反應完成的方法中，優選上述步驟(3)是求出dS1/dt(S1為所得光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是dS1/dt在規定範圍R1內的狀態連續地持續了規定時間T1或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
還優選上述步驟(3)是求出(dS1/dt)/S1(S1為所得光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是(dS1/dt)/S1在規定範圍R2內的狀態連續地持續了規定時間T2或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合、和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
本發明還涉及均化·反應完成的判定方法，其特徵在於含有下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)連續地測定上述被測液和上述混合液的光學特性，或至少測定一次上述被測液的光學特性，且間斷性地多次測定混合後上述混合液的光學特性；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；以及(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。步驟(1)-(4)按照所標順序進行。
在該均化·反應完成的方法中，優選上述步驟(3)是求出(dS1/dt)/(S1-S0)(S0為上述被測液的光學特性的測定值，S1為上述混合液的光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是(dS1/dt)/(S1-S0)在規定範圍R3內的狀態連續地持續了規定時間T3或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合、和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
本發明還涉及溶濃度測定方法，其特徵在於根據上述均化·反應完成的判定方法判定上述被測液與上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成，然後根據測定值S1或測定值S0和S1確定上述被測液中的特定成分的濃度。
優選該溶液濃度測定方法包含下述步驟在判定上述被測液與上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成，然後再將其它試劑液與上述被測液混合的步驟。
這種情況下，優選在判定上述被測液與上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成後，在經過了規定時間T4的時刻再將其它試劑液與上述被測液混合，且在經過規定時間T4以前測定上述混合液的光學特性。
本發明還涉及溶液濃度測定裝置，其特徵在於具備如下單元向被測液照射光的光源；放有上述被測液的樣品皿；檢測透射上述被測液的光的光傳感器1和/或檢測上述光傳導進上述被測液中時發生的散射光的光傳感器2；分析上述光傳感器1和上述光傳感器2的輸出信號的計算機；其中上述計算機根據上述溶液濃度測定方法，分析上述光傳感器1和/或上述光傳感器2的輸出信號，計算上述被測液的濃度。
即，上述計算機具有如下控制方法間斷性地多次或連續地測定混合被測液和試劑液而得到的上述混合液的光學特性，求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係，並根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成，根據上述測定值確定上述被測液中的特定成分的濃度。
上述計算機的控制方法可以是連續地測定上述被測液和上述混合液的光學特性，或至少測定一次上述被測液的光學特性，且間斷地多次測定混合後的上述混合液的光學特性。
進一步優選上述溶液濃度測定裝置具備通過將試劑液注入上述樣品皿的上述被測液中進行混合的注入器，通過上述計算機或上述控制方法控制上述注入器。
在該溶液濃度測定裝置中，優選使用上述光源測定上述被測液的光學特性，並測定被測液中的特定物質的濃度。
還優選通過注入試劑液而產生的力學效果進行攪拌。
在上述均化·反應完成的判定方法、溶液濃度測定方法和溶液濃度測定裝置中，進一步優選當測定開始之後在規定時間T1內未判定均化和/或反應完成時，則將該測定視為無效。
上述被測液中的上述被分析物質的濃度為可顯示的最低濃度時，設定開始測定後至通過上述均化·反應完成的判定方法判定已均化或反應已完成所經過的時間為T5，則優選上述規定時間T滿足T≥T5。
優選與上述被分析物質反應的物質是與上述被分析物質產生特異性結合反應的抗體，來自該特異性結合反應而產生的光學特性相關信號是上述混合液的濁度。
進一步優選上述被分析物質為人白蛋白。
附圖簡述
圖1是本發明的實施方案1的溶液濃度測定裝置的俯視圖。
圖2是本發明的實施方案1的溶液濃度測定裝置的局部剖開的側視圖。
圖3是表示本發明的實施方案3中光傳感器5的輸出信號隨時間變化的圖。
圖4是表示本發明的實施方案1中光傳感器5的輸出信號的微分信號的時間變化率的圖。
圖5是將圖4中縱軸0附近放大而得到的圖。
圖6是將圖4中縱軸0或以上的部分放大、且將橫軸14.5-16.5秒附近的部分放大而得到的圖。
圖7是將圖4中縱軸0附近放大、將橫軸17-20秒附近的部分放大而得到的圖。
圖8是本發明的實施方案2的溶液濃度測定裝置的俯視圖。
圖9是本發明的實施方案2的溶液濃度測定裝置的局部剖開的側視圖。
圖10是表示本發明的實施方案2中光傳感器12的輸出信號隨時間變化的圖。
圖11是表示本發明的實施方案2中光傳感器12的輸出信號的微分信號的時間變化率的圖。
圖12是將圖11中縱軸0附近的部分放大、將橫軸60-200秒附近的部分放大而得到的圖。
圖13是表示本發明的實施方案3中光傳感器12的輸出信號的微分信號除以輸出信號的值的圖。
圖14是將圖13中縱軸0附近的部分放大、將橫軸60-200秒附近的部分放大而得到的圖。
圖15是將圖12的縱軸以對數表示的圖。
圖16是表示本發明的實施方案2-3中使用的光傳感器12的輸出信號與蛋白質濃度的相關性的圖。
圖17是本發明的實施方案5的溶液濃度測定裝置的俯視圖。
圖18是表示本發明的實施方案5中的光傳感器12的輸出信號隨時間變化的圖。
實施發明的最佳方式本發明涉及溶液濃度測定方法，該方法是將含有被分析物質的被測液和含有與上述被分析物質反應的物質的試劑液混合，通過檢測來自該反應產生的光學特性相關的信號，來對上述被分析物質進行定性或定量。
本發明涉及均化·反應完成的判定方法，其特徵在於包含下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)間斷性地多次或連續地測定混合後上述混合液的光學特性的步驟，或連續地測定上述被測液和上述混合液的光學特性，或至少測定一次上述被測液的光學特性，且間斷性地多次測定混合後上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；以及(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
本發明還提供使用該均化·反應完成的判定方法的溶液濃度測定方法和溶液濃度測定裝置。
以下參照附圖對本發明的各種實施方案進行說明。
實施方案1通過圖1和圖2對本發明的實施方案1進行如下詳述。圖1是本發明的實施方案1的溶液濃度測定裝置的俯視圖，圖2是本發明的實施方案1的溶液濃度測定裝置的局部剖開的側視圖。圖1和圖2中，樣品皿1的骨架部分由上部具有開放的開口部的長方體狀鋁製容器構成。樣品皿1的一對側面嵌入光學窗-玻璃板，形成光路，光可以透射到樣品皿1中存放的被測液(或被測液與試劑液的混合液)中。圖1中，該樣品皿1內沿光傳導方向的距離-光學窗間的距離(光路長)以A表示，與樣品皿1內的光傳導方向垂直方向的距離以B表示。本實施方案中，以A為0.8cm、B為0.4cm的情形為代表說明本發明。
如圖1所示，在樣品皿1沒有光學窗的側面端部設置有注入口2，注入口2的內徑(直徑)為0.1cm。如圖2所示，該注入口2的截面中心位於距樣品皿1的底面的距離為x，距光學窗的距離為z的位置。注入方向10與光學窗的面平行，與光的傳導方向垂直。本實施方案中，以x為0.4cm，z為0.1cm的情形為代表說明本發明。
作為光源的半導體雷射模塊3將顯示波長為780nm、強度3.0mW、光束直徑0.2cm的準直光4投射到樣品皿1內的被測液中。該準直光4的光軸與樣品皿1的底面平行，位於距底面0.4cm的位置。因此，光軸和注入口2位於距底面相同高度的位置，由注入口2的截面中心向注入方向10延伸的注入軸與準直光4的光軸在上述樣品皿1內的溶液中有交點。
光傳感器5是探測透射到被測液的光的光傳感器。泵6將試劑液由注入口2注入到樣品皿1中的被測液中。計算機7對光傳感器5的輸出信號進行分析，控制泵6。箭頭符號8示意地表示由注入口2注入試劑液時，樣品皿1內產生的漩渦的方向。另外，被測液的液面9的最底部位於距樣品皿1的底面高h的位置。本發明中，將液面定義為與液面9的最下部相接、與水平面平行的面。根據該定義，本實施方案中，注入方向與液面平行。
該樣品皿1中，內壁的角具有弧度r。即樣品皿1內的角不是精密的直角。因此h＝0.8cm時，樣品皿1內存有約0.25ml的被測液。
本實施方案中，將平均直徑為20nm的聚丙烯微粒均勻地分散於純水中，所得分散液作為被測液，將該被測液填充到樣品皿1內。該被測液整體均勻地混濁。
首先，對向該被測液注入純水時的機理進行說明。該聚丙烯微粒的比重接近於純水，粒徑也小，因此在實施本發明的方法的時間內，該微粒一旦在純水中充分均勻地分散，則不會發生分離和沉澱等現象。但是，在攪拌不足、未均勻地分散的情況下，則會發生這些現象。
向該被測液中注入純水，則聚丙烯微粒整體擴散，聚丙烯微粒的濃度降低。被測液整體的渾濁程度即濁度降低。通過光傳感器5的輸出信號測定該濁度，以此作為透射光強度。
這樣，含有微粒的液體的擴散所導致的混濁的變化並不與化學反應相關。因此，被測液整體的濁度只與聚丙烯微粒的擴散程度有關，無需去考慮反應速度。即，濁度穩定在某一值，則意味著微粒在液體整體中充分擴散、均勻分散。
由此可知將含有微粒的液體作為試劑液，與被測液混合，觀測其濁度，則可方便地用於驗證攪拌的效果。本實施方案中，只將本發明的由攪拌判定均化的結果取出，簡化本發明進行說明。
本實施方案的操作如下進行。
首先，將上述含有聚丙烯微粒的被測液導入樣品皿1。此時，導入的被測液的容量為0.25ml。使計算機7開始測定(記錄)光傳感器5的輸出信號。導入後開始測定後，光傳感器5的輸出信號隨時間的變化如圖3所示。
圖3中，將開始測定輸出信號後的經過時間表示在橫軸，將光傳感器5的輸出信號表示在橫軸。在經過10秒的時刻，計算機7控制泵6，將純水由注入口注入2秒。這樣，注入純水時光傳感器5的輸出信號的變化用圖3的實線表示。圖3中，a表示注入0.1ml的純水、b表示注入0.07ml的純水、c表示注入0.05ml的純水、d表示注入0.03ml的純水時光傳感器5的輸出信號的變化。
該圖中，由開始注入純水的時刻起，即開始記錄後經過10秒時起的2-3秒間，所注入的純水流束本身進入準直光4的光路。因此，透射光的強度和傳導方向散亂，光傳感器5的輸出信號劇烈變化。圖3中，該變化的振幅用斜影線區域表示，輸出信號在0.6-1.4V之間變化。注入的純水的體積即使相同，變化的經過也不會重現，變化的振幅以該區域表示。聚丙烯顆粒的濃度隨純水的注入量而降低，因此濁度也隨著注入量降低。
純水的注入量為0.1ml、0.07ml和0.05ml時，分別如圖3的實線a、b和c所示，表示了對應於各注入量的輸出信號，輸出信號本身也穩定。這是由於通過注入純水，被測液內產生漩渦，可使被測液和純水的混合液攪拌至充分均勻，即使目視也可確認已均化。而注入量為0.03ml時，如圖3的實線d所示，輸出信號不穩定。這是由於被測液與純水的混合液的攪拌不夠，未能攪拌至均勻，即使目視也可驗證聚丙烯微粒的濃度不均。
如上所述，實線a-c表示被測液與純水的混合液攪拌至充分均勻的情形，實線d表示上述混合液未能攪拌至均勻的情形。
其中，由光傳感器5的輸出信號測定被測液的濁度等光學特性時，原來要等待被認為光傳感器5的輸出信號充分穩定了的時間，經過該時間後再對光傳感器5的輸出信號進行分析。例如，採用開始記錄後經過60秒的時刻的光傳感器5的輸出信號。但是，如果是本發明中實線d所示的情形，由於混合液未均化，因此不能測定正確的光學特性。因此需要通過目視等另行確認是否均化。
以下對本發明的方法進行說明。本發明的方法是相對於如上所述的現有技術，根據混合液的光學特性、即光傳感器5的輸出信號，對混合液是否充分攪拌、即混合液是否均勻進行判定。簡單地說，該方法通過將由開始測定至出結果的待機時間進行充分且必要的設定，可縮短測定時間。
首先，預先設定實施測定的最長時間。這相當於開始測定後，至出結果的最長待機時間，超過該最長時間，則測定無效。將該預先設定的時間作為規定時間T。
該方法中，在規定時間T以內，光傳感器5的輸出信號S1在每單位時間的變化量、即微分信號dS1/dt在規定範圍R1內，該狀態持續了規定時間T1，則判定為均化。
具體來說，在開始測定後的規定時間T(60秒)以內，dS1/dt[V/S]在式(1)-5×10-4≤dS1/dt≤5×10-4(1)所示的規定範圍R1內，該狀態持續了規定時間T1(1.5秒)或以上時，則判定混合液已均化。如果不明確設定該相當於最長待機時間的規定時間T，則即使攪拌不充分，未被均化，特別是即使純水區和微粒液區分離等時，也有可能誤判為微分信號dS1/dt在規定範圍R1內經過了規定時間T1，混合液已均化。
圖4表示光傳感器5的輸出信號的微分信號。圖3的實線a-d分別相當於圖4的實線a-c和虛線d所表示的信號強度的微分值(dS/dt)。圖4與圖3相同，開始注入純水後經過了10秒的時刻起的約2秒以上的期間，所注入的純水的流束本身進入準直光4的光路。因此透射光的強度和傳導方向散亂，光傳感器5的輸出信號的微分信號劇烈變化。圖4中，可見實線a-c重疊。其中，將圖4的縱軸0附近放大，製成圖(圖5)。由圖5可知，實線a-c逐漸接近於0，虛線d在負值一側大幅振蕩，獲得了最小值。圖5中也可見實線a-c重疊。
圖6表示將圖4中縱軸0或以上的部分放大，將橫軸14.5-16.5秒的部分放大的圖。圖6中，▲對應a，■對應b，●對應c。由圖6可知，a-c逐漸接近於0。
其中，如下發現了作為上述均化判定的條件，在開始測定後的規定時間T(60秒)以內，光傳感器5的輸出信號的微分信號dS1/dt以在式(1)所示的規定範圍R1內的狀態持續了規定時間T1(1.5秒)或以上的時段。
光傳感器5的輸出信號的微分信號dS1/dt為5×10-4[V/S]或以下時，是a經過14.79秒以後，b經過14.88秒以後，c經過14.92秒以後。這以後，a-c逐漸接近於0，因此微分信號處於式(1)所示的規定範圍R1。
因此，圖6中，如果由微分信號dS/dt進入式(1)所示的規定範圍R1內時起經過了1.5秒後的時刻在由開始測定的規定時間(T＝60秒)以內，則在經過了15秒的時刻可判定混合液已均化。具體來說，對於a可在經過了16.29秒的時刻判定已均化；對於b可在經過了16.38秒的時刻判定已均化；對於c可在經過了16.42秒的時刻判定已均化。
而圖4中，將縱軸在0附近放大，並放大經過17-20秒時的橫軸，製成圖(圖7)。如圖7所示，光傳感器5的輸出信號的微分信號dS1/dt在式(1)所示的規定範圍R1內時，是在經過了17.69秒的時刻到經過了18.71秒的時刻。這種情況下，微分信號在R1內的狀態只持續了1.02秒(＝18.71-17.69)，因此不能判定混合液已均化。由圖2可知由於在至少經過了開始測定後的規定時間(T＝60秒)時之前，微分信號未進入範圍R1內，因此判定d的混合液未均化。通過使用這樣的判定條件，可以確實判定混合液是否充分攪拌、均化。
其中，當由光傳感器5的輸出信號測定被測液的濁度等光學特性時，如上所述，只要對判定為已均化的時刻的光傳感器5的輸出信號進行分析即可。即，對於a使用經過16.29秒的時刻的光傳感器5的輸出信號，對於b使用經過16.38秒的時刻的光傳感器5的輸出信號。對於c使用經過16.42秒的時刻的光傳感器5的輸出信號即可。由此可確保精度，且可以以充分且必要的測定時間測定光學特性，可縮短測定時間。還可避免因均化不充分而產生的誤動作。
當然，均化的判定條件並不限於上述條件。即，T、T1和式(1)所示的規定範圍R1可根據微粒的大小、密度、注入速度、光學系統的配置、所要求的精度、測定時間和標準曲線等各種條件適當設定。另外，計算被測液中特定成分的濃度時，計算機7參照預先設定的標準曲線，根據判定為均化時的光傳感器5的輸出信號計算被測液的濃度。
如上所示，根據本實施方案，直接將樣品皿設置在光學系統中，即可判定混合液的攪拌程度和均勻性。並且，由於測定所需要的時間只是充分且必要的時間，因此可節省時間。由此在簡化步驟的同時，還不容易發生誤動作，其實用效果極大，可實現測定和檢查的高效和省力。
實施方案2利用圖8和9，如下詳述本發明的實施方案2。圖8和9中，符號1-10所示的構成要素與用於說明上述實施方案1的圖1和2中的符號1-10所示的構成要素相同，同樣操作。只是本實施方案中，是對投射的光在被測液或混合液內散射的光進行檢測。
通過光傳感器12檢測準直光4傳導進被測液中時所產生的散射光11。光傳感器12的輸出信號相當於散射光的11的強度，由計算機7對此進行分析。
本實施方案中，使用含有蛋白質的溶液作為被測液，使用磺基水楊酸試劑液(將硫酸鈉溶解於2-羥基-5-磺基苯甲酸水溶液中所得的試劑)作為試劑液，測定被測液中的蛋白質濃度。這種情況下，被測液與磺基水楊酸試劑液混合，則被測液中的蛋白質成分凝集，所得混合液整體渾濁。因此，通過測定混濁程度即濁度，可確定蛋白質濃度。這裡，測定濁度作為散射光強度、即作為光傳感器12的輸出信號。蛋白質濃度越高，則濁度越高，因此光傳感器12的輸出信號變大。
計算蛋白質濃度時，預先測定已知濃度的標準液的濁度、即光傳感器12的輸出信號，由此製作標準曲線。然後測定未知濃度的被測液的濁度，參照已製作的標準曲線計算濃度。
本實施方案中，與上述實施方案1不同，其光學特性、即濁度的變化特性不僅受攪拌效果的的影響，還受反應(凝集)特性的影響。
本實施方案的操作如下進行。
將蛋白質濃度為100mg/dl的水溶液作為被測液導入樣品皿1。此時，所導入的被測液的容量為0.25ml。計算機7開始記錄光傳感器12的輸出信號。在圖10中，導入後開始記錄後，光傳感器12的輸出信號隨時間的變化用●表示。
圖10中，將開始測定輸出信號後的經過時間表示在橫軸，將光傳感器12的輸出信號表示在縱軸。在開始測定後經過了20秒的時刻，計算機7控制泵6，將0.05ml的磺基水楊酸試劑液由注入口2注入2秒鐘。
同樣地，將蛋白質濃度為30mg/dl、10mg/dl或0mg/dl的水溶液導入0.25ml樣品皿1中，圖10中，在開始測定後經過了20秒的時刻注入0.05ml磺基水楊酸試劑液，此時光傳感器12的輸出信號分別用■、×或○表示。
圖10中，●、■、×和○所示的輸出信號在注入試劑液的時刻附近變化很大，這是由於所注入的試劑液的流束本身進入準直光4的光路。為什麼會這樣呢？這是因為被測液蛋白質水溶液和試劑液磺基水楊酸水溶液的折射率不同，因局部的不均勻性導致散射光強度較大變化。並且，還由於伴隨著注入，會有氣泡等微粒進入光路中，也使散射光強度較大變化。將該較大變化的區域用斜影線表示。由開始測定至開始注入後經過了20秒的時刻，各實線和虛線全部重疊，因此只用實線表示。
測定被測液中的特定成分的濃度時，參照預先製作的標準曲線，計算機7對由該實線所示的混合了試劑液後的光傳感器5的輸出信號進行分析，計算被測液的濃度。上述中，將相同容量的試劑液以相同時間注入相同容量的被測溶液，因此由攪拌得到的均化也同步進行到同樣程度。但是，由圖10可知輸出信號這到飽和、即達到穩定所需的時間不同。這是由於因蛋白質濃度導致的反應速度不同。
這種情況下，如果是現有技術，則使用輸出信號達到穩定所需時間最長的被測液計算濃度。即，被測液具有蛋白質可表現出的最低濃度時，在認為輸出信號足夠穩定的時刻才測定輸出信號，使用該輸出信號進行被測液的濃度的計算。如果這樣設定，即使是反應速度快、短時間內即可結束測定的情形，也要延長測定時間。並且，蛋白質濃度高、反應速度快時，經過比必要時間更長的時間，則凝集的蛋白質開始沉澱，散射光強度也會變化，相反精度有可能降低。另外，反應速度也與溫度相關，因此需要在一定的溫度下進行測定。
而本實施方案中，不只根據光傳感器12的輸出信號計算濃度，還對反應的完成進行判定。下面對上述本發明的方法進行說明。根據本實施方案，可充分且必要地設定測定時間，不僅實質性地實現了測定的快速，還無需進行溫度控制，可防止因沉澱現象導致的精度變差。上述情形，是根據溶液的光學特性(光傳感器12的輸出信號)對反應是否已充分完成(輸出信號的穩定)進行判定。
首先，預先設定實施測定的最長時間。這相當於由開始測定後至出結果的最長的待機時間，超過該最長時間，則測定無效。將該預先設定的時間作為規定時間T。
該方法中，若在規定時間T以內，光傳感器12的輸出信號S1在每單位時間的變化量、即微分信號dS1/dt在規定範圍R1內，該狀態持續規定時間T1，則判定為均化。
具體來說，在開始測定後的規定時間T(200秒)以內，dS1/dt[V/S]在式(2)-1×10-4≤dS1/dt≤1×10-4(2)所示的規定範圍R1，在該狀態連續經過了規定時間T1(10秒)或以上的時刻，則判定已均化。
圖11中，將光傳感器12的輸出信號的微分信號表示在縱軸。圖11的●、■和×分別相當於圖10的●、■和×的相關的微分信號。圖11與圖10相同，開始注入試劑液，在由經過了20秒的時刻起的約2秒或以上的期間，所注入的試劑液的流束本身進入準直光4的光路。因此，散射光的強度散亂，光傳感器12的輸出信號的微分信號劇烈變化。圖11中，可見○實質上為0，因此省略。
由於難以確認圖11的細節，將圖11縱軸0附近的部分放大、橫軸60-200秒的部分放大，製成圖12的圖。由圖11和圖12可知，注入試劑液後，光傳感器12的輸出信號的微分信號立即按照●、■和×的順序增大，經過約120秒以後，它們的大小關係完全逆轉，按照×、■和●的順序增大。●、■和×全部漸漸接近於0。
由圖12發現了作為上述反應完成的判定條件，在開始測定後的規定時間T(200秒)以內，光傳感器12的輸出信號的微分信號dS1/dt以在式(2)所示的規定範圍R1內的狀態持續了規定時間T1(10秒)或以上的時段。
光傳感器12的輸出信號的微分信號dS1/dt為1×10-4[V/S]或以下時，是●經過77秒以後，■經過135秒以後，×經過166秒以後。這以後，●、■和×逐漸接近於0，因此微分信號處於式(2)所示的規定範圍R1內。
因此，圖12中，如果由微分信號dS/dt進入式(2)所示的規定範圍R1內時起經過了10秒的時刻在由開始測定起的規定時間T(200秒)以內，則可在經過了200秒的時刻判定反應完成。具體來說，對於●可在經過了87秒的時刻判定反應完成；對於■可在經過了145秒的時刻判定反應完成；對於×可在經過了176秒的時刻判定反應完成。通過使用如上例舉的判定條件，可明確地判定反應是否已經完成。
其中，當由光傳感器12的輸出信號測定被測溶液的濁度來計算蛋白質濃度時，如上所述，只要對判定為反應完成的時刻的光傳感器12的輸出信號進行分析即可。即，對於●，使用經過87秒的時刻的光傳感器12的輸出信號；對於■，使用經過145秒的時刻的光傳感器12的輸出信號；對於×，使用經過176秒的時刻的光傳感器12的輸出信號。製作標準曲線時，也可以按照與上述同樣的條件製作。
圖16中顯示了光傳感器12的輸出信號與蛋白質濃度的相關性。實線是經過了200秒的時刻的輸出信號，+是經過了90秒的時刻的輸出信號。▲是在上述條件下判定反應完成時、即對於10mg/dl是經過了176秒的時刻的輸出信號，對於30mg/dl是經過了145秒的時刻的輸出信號，對於100mg/dl是經過了87秒的時刻的輸出信號。由圖16可知，在判定▲所示的反應已完成時，對各濃度均可保持精度，但在+所示的經過了90秒的時刻的輸出信號中，濃度越低則精度越下降。
如上所述，通過本實施方案，可確保精度，且可以以充分且必要的測定時間測定濃度，可縮短測定時間。還可避免因反應未充分完成而導致的精度變差。
當然，反應完成的判定條件並不限於上述條件。即，T、T1和式(2)所示的規定範圍R1可根據試劑液的種類、注入速度、光學系統的配置、所要求的精度、測定時間和標準曲線等各種條件適當設定。另外，計算被測液中特定成分的濃度時，計算機7參照預先設定的標準曲線，根據判定反應完成時的光傳感器12的輸出信號計算被測液的濃度。製作標準曲線時，也可以在與上述同樣的條件下製作。還可以對已知濃度的各標準溶液，掌握其在相當於圖10的輸出信號隨時間變化的整體特性的基礎上，使用反應完成時的輸出信號來製作。
如上所述，根據本實施方案，直接將樣品皿設置在光學系統中，即可判定反應完成的程度。並且，由於測定所需要的時間只是充分且必要的時間，因此可節省時間。由此在簡化步驟的同時，還不容易發生誤動作，其實用效果極大，可實現測定和檢查的高效和省力。
本實施方案中，例舉了通過光傳感器12來檢測準直光4傳導到溶液中時產生的散射光，由此測定濁度的例子，測定濁度作為透射光強度(光傳感器5的輸出信號)的情形也同樣操作，同樣可實現高精度的測定。
不過，蛋白質濃度越高，則濁度越高，光傳感器5的輸出信號變小。光傳感器5的輸出信號的微分信號dS1/dt由負值逐漸接近零。這樣，使用透射光強度來判定反應完成時，只要根據試劑液的種類、注入速度、光學系統的配置、所要求的精度、測定時間和標準曲線等各種條件適當設定T、T1和式(2)所示的規定範圍R1即可。
另外，獲得輸出信號的微分信號時，可以通過模擬電路生成，也可以以適當的時間間隔多次測定，通過差分運算來生成。以上表示了輸出信號單調減少或單調增加的情形，對于振動減少或振動增加的情況，也可以同樣採用本發明的方法。
實施方案3本實施方案中，採用上述實施方案2中所使用的、具有圖8和9所示構成的裝置，但反應完成的判定方法不同。對此進行說明。與實施方案2相同，也是將圖10和圖16所示的光傳感器12的輸出信號用來計算濃度和判定。但是，本實施方案與上述實施方案2不同，採用了(dS1/dt)/S1作為評價是否在規定範圍R2的指標。
上述實施方案2中是以dS1/dt作為評價指標，但當S1相對較小時，即被測液的濃度在低區域時，dS1/dt本身變小。因此，當為低濃度被測液時，即使反應完成程度低，也會判定為反應完成。因此，本實施方案中，以dS1/dt除以輸出信號S1的值即(dS1/dt)/S1作為評價指標，判定反應的完成。
首先，預先設定實施測定的最長時間。這相當於開始測定後，至出結果的最長的待機時間，超過該最長時間，則測定無效。將該預先設定的時間作為規定時間T。
該方法中，在規定時間T以內，光傳感器12的輸出信號S1在每單位時間的變化量除以輸出信號S1的值，即(dS1/dt)/S1在規定範圍R2內，該狀態持續經過規定時間T2，則判定為均化。
具體來說，在開始測定後的規定時間T(200秒)以內，(dS1/dt)/S1[V/S]在式(3)-5×10-4≤(dS1/dt)/S1≤5×10-4(3)所示的規定範圍R2，以該狀態持續經過規定時間T2(10秒)或以上時，則判定混合液已均化。
圖13的縱軸表示光傳感器12的輸出信號的微分信號除以輸出信號的值。圖13的●、■和×分別相當於圖10的●、■和×所對應的微分信號除以輸出信號的值。圖13與圖10相同，開始注入試劑液，在經過了20秒的時刻後約2秒或以上的期間，所注入的試劑液的流束本身進入準直光4的光路。因此，散射光強度散亂，(dS1/dt)/S1劇烈變化。圖13中，可見○實質上為0，因此省略。圖13中，難以確認細節，因此將縱軸0附近和橫軸60-200秒附近放大，得到圖14。由圖13和圖14可知，注入試劑液後，光傳感器12的輸出信號的微分信號立即按照×、■和●的順序增大，它們全部逐漸接近於0。
由圖14發現了作為上述反應完成的判定條件，在開始測定後的規定時間T(200秒)以內，(dS1/dt)/S1以在式(3)所示的規定範圍R2內的狀態持續了規定時間T(10秒)或以上的時段。
(dS1/dt)/S1為5×10-4[V/S]或以下時，是●經過69秒以後，■經過148秒以後。但對於×，即使經過200秒，(dS1/dt)/S1也不為5×10-4[V/S]或以下。200秒以後，●和■逐漸接近0，進入式(3)所示的規定範圍內。因此，如果由進入式(2)所示的規定範圍內的時刻起經過10秒的時刻在由開始測定起的規定時間T(200秒)以內，則可在經過了200秒的時刻判定反應完成。
具體來說，對於●，可在79秒的時刻判定反應完成；對於■，可在158秒的時刻判定反應完成。但是對於×則未判定反應完成，該測定無效。由圖16可知，蛋白質濃度為10mg/dl時，精度低，可以使這樣的測定無效。上述實施方案2中，在這樣的低濃度區域精度差的情況下，仍判定反應完成，使測定有效，這樣使得測定的可靠性降低。但是，本實施方案會將這樣的測定視為無效，因此可確保可靠性。
如上所述，根據本實施方案，可確保精確度，且可以以充分且必要的測定對間測定濃度，可縮短測定時間。還可檢測出低濃度被測液容易發生的、由相對的反應完成程度不充分而導致的精度變差，可提高可靠性。
當然，反應完成的判定條件並不限於上述條件。即，可根據試劑液的種類、注入速度、光學系統的配置、所要求的精度、測定時間和標準曲線等各種條件適當設定T、T2和式(3)所示的規定範圍R2。
實施方案4本實施方案中，採用上述實施方案3中所使用的、具有圖8和9所示構成的裝置，但反應完成的判定方法不同。對該判定方法進行說明。與上述實施方案3相同，也是將圖10和16所示的光傳感器12的輸出信號用來計算濃度和判定。但是，本實施方案與上述實施方案3不同，還利用注入試劑液前的光傳感器12的輸出信號S0。另外，為了使S0的值容易明白，圖15中顯示了將圖12的縱軸用對數表示的圖表。
具體來說，用S1-S0作為評價指標來代替實施方案2和3中使用的S1。即，使用(d(S1-S0)/dt)/(S1-S0)作為指標。不過，由於評價時使S0與時間不具相關性，因此d(S1-S0)/dt＝dS1/dt成立，由此可評價(dS1/dt)/(S1-S0)是否在規定範圍R3內。
因此這裡，在規定時間T以內，(dS1/dt)/(S1-S0)以在規定範圍R3內的狀態經過了規定時間T3時，可判定已均化和/或反應已完成。
除上述之外，均採用與實施方案3同樣的方法。由此可不受注入試劑液之前的被測液的濁度的影響，可以檢測出採用實施方案3中所述的低濃度被測溶液時所發生的精度相對變差的情況。
如上所述，根據本實施方案，可不受被測液本身的濁度影響，檢測出低濃度區的被測液可能發生的、因相對的反應完成程度不夠而導致的精度差的情況，可進一步提高可靠性。
實施方案5使用圖17對本發明的實施方案5進行詳細說明。圖17中，符號1-12所示的構成要素與圖8中符號1-12所示的構成要素相同，均同樣操作。注入口13與注入口2相同，設置於樣品皿1沒有光學窗的側面，內徑(直徑)為0.1cm。泵14將試劑液由注入口13注入到樣品皿1中的被測液中。箭頭符號15表示試劑液由注入口13注入時的注入方向。本實施方案中，注入多種試劑液。例如首先向樣品皿1中的被測液中注入緩衝液，接著注入抗體試劑液等。
本實施方案中，注入作為第1試劑液的緩衝液，然後判定本第1試劑液與被測液均化，之後測定混合液的光學特性，接著注入作為第2試劑液的抗體試劑液，反應完成後，測定混合液的光學特性，計算濃度。這裡，通過圖18對用本實施方案1-4所述的方法判定已均化，且判定反應已完成的方法進行說明。
首先，向未能檢出人血清白蛋白(濃度實質上為零)的尿中加入人血清白蛋白，製備人血清白蛋白濃度為0.1mg/dl、0.3mg/dl、1.0mg/dl和3.0mg/dl的被檢尿樣(被測液)。製備0.05M嗎啉代丙磺酸(モプス)緩衝液作為第1試劑液(R1)。接著從兔抗人白蛋白血清中純化抗體成分作為第2試劑液，製備抗體試劑液(R2)。
將0.2ml被測液導入樣品皿1中，從該時刻起，通過光傳感器12開始進行散射光強度的測定(經過0秒的時刻)。經過20秒時，以2秒鐘注入第1試劑液(R1)-緩衝液。然後採用上述任意一種實施方案所述的方法，判定第1試劑液與被測液已均化。在判定為已均化的時刻，測定混合液的光學特性，然後在從判定已均化的時刻起經過了規定時間T4的時刻，以2秒鐘注入第2試劑液-抗體試劑液。換言之，從判定已均化的時刻起，至經過了規定時間T4的期間內，測定混合液的光學特性，得到了輸出信號S0。然後採用前述的任意一種實施方案所述的方法，判定第2試劑液有關的反應完成，然後測定混合液的光學特性，得到輸出信號S1。這裡，可證實所得S0與S1的差與被測液人血清白蛋白的濃度成比例。
使用3種或以上的試劑液時也是同樣，注入各試劑液，從判定已均化或反應完成的時刻起，經過規定時間後，再注入試劑液。在每一階段，在判定已均化或反應完成的時刻以後、且注入下一試劑液之前，根據需要測定光學特性，根據該測定值計算濃度。
如上所述，根據本實施方案，注入各試劑液之後，在判定已均化和/或反應已完成之後，測定光學特性，然後再注入下一試劑液，這樣可以區分開各試劑液的影響來測定，因此可靠性高。例如，測定被測液中的特定抗原濃度時，有時會預先將被測液與緩衝混合，然後混合抗體試劑液，測定濃度。此時，可以區分被測液本身具有的濁度以及被測液與緩衝液混合後新生成的濁度、因特異性結合反應即該抗原與抗體的結合而生成的濁度進行測定。由此可只特異性地檢測特定抗原，可保證測定的可靠性。規定時間T4為0或以上，只要在該期間可測定光學特性即可。
產業實用性如上所述，本發明只需要均化、反應完成所必需的時間即可。即，測定時間只要滿足必要條件即可，可縮短測定時間，其實用效果大，可實現測定和檢查的高效和省力。並且，可以使精度低的測定無效，因此可靠性高。另外，可只特異性地檢測被測液中的特定成分、測定濃度，其實用效果極大。本發明可應用於尿檢等中。
權利要求
1.均化·反應完成的判定方法，其特徵在於包含下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)間斷性地多次或連續地測定混合後的上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；以及(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
2.權利要求1的均化·反應完成的判定方法，其中上述步驟(3)是求出dS1/dt(S1為所得光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是dS1/dt以在規定範圍R1內的狀態持續了規定時間T1或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
3.權利要求1的均化·反應完成的判定方法，其中上述步驟(3)是求出(dS1/dt)/S1(S1為所得光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是(dS1/dt)/S1以在規定範圍R2內的狀態持續了規定時間T2或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合、和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
4.權利要求1的均化·反應完成的判定方法，其特徵在於當未判定在開始測定後規定的時間T以內已均化和/或反應已完成時，則該測定無效。
5.均化·反應完成的判定方法，其特徵在於包含下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)連續地測定上述被測液和上述混合液的光學特性，或至少測定一次上述被測液的光學特性且間斷性地多次測定混合後上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；以及(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
6.權利要求5的均化·反應完成的判定方法，其中上述步驟(3)是求出(dS1/dt)/(S1-S0)(S0為上述被測液的光學特性的測定值，S1為上述混合液的光學特性的測定值，T為混合後開始測定後所經過的時間)的步驟；上述步驟(4)是(dS1/dt)/(S1-S0)以在規定範圍R3內的狀態持續了規定時間T3或以上時，判定上述被測液和上述試劑液已實質性均勻混合、和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟。
7.權利要求5的均化·反應完成的判定方法，其特徵在於當未判定在開始測定後規定的時間T以內已均化和/或反應已完成時，則該測定無效。
8.溶液濃度測定方法，其特徵在於包含下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)間斷性地多次或連續地測定混合後上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟；以及(5)根據上述測定值確定上述被測液中特定成分的濃度的步驟。
9.權利要求8的溶液濃度測定方法，其特徵在於包含下述步驟在判定上述被測液和上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成後，再將另一種試劑液與上述被測液混合。
10.權利要求9的溶液濃度測定方法，其特徵在於判定上述被測液與上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成後，在經過了規定時間T4的時刻，再將另一種試劑液與上述被測液混合，且在經過規定時間T4之前測定上述混合液的光學特性。
11.權利要求8的溶液濃度測定方法，其特徵在於當未判定在開始測定後規定的時間T以內已均化和/或反應已完成時，則該測定無效。
12.溶液濃度測定方法，其特徵在於包含下述步驟(1)將被測液和試劑液混合，獲得混合液的步驟；(2)連續地測定上述被測液和上述混合液的光學特性，或至少測定一次上述被測液的光學特性且間斷性地多次測定混合後上述混合液的光學特性的步驟；(3)求出所得光學特性的測定值與混合後開始測定後所經過的時間的關係的步驟；(4)根據上述關係，判定上述被測液與上述試劑液已實質性均勻混合和/或上述被測液與上述試劑液的反應已實質完成的步驟；以及(5)根據上述測定值確定上述被測液中特定成分的濃度的步驟。
13.權利要求12的溶液濃度測定方法，其特徵在於包含下述步驟在判定上述被測液和上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成後，再將另一種試劑液與上述被測液混合。
14.權利要求13的溶液濃度測定方法，其特徵在於判定上述被測液與上述試劑液的混合已均化和/或反應已實質完成後，在經過了規定時間T4的時刻，再將另一種試劑液與上述被測液混合，且在經過規定時間T4之前測定上述混合液的光學特性。
15.權利要求12的溶液濃度測定方法，其特徵在於當未判定在開始測定後規定的時間T以內已均化和/或反應已完成時，則該測定無效。
全文摘要
本發明的目的在於提供使測定時間只為充分且必要，可快速測定的均化·反應完成的判定方法以及使用該方法的溶液濃度測定方法。在均化·反應完成的判定方法以及使用該方法的溶液濃度測定方法中，根據被測液與試劑液的混合液的光學特性來判定均化和反應完成。
文檔編號G01N21/47GK1643370SQ03805920
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月12日 優先權日2002年3月13日
發明者河村達朗, 龜井明仁 申請人:松下電器產業株式會社