一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒及其製作方法
2023-05-14 05:46:01
專利名稱：一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒及其製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒及其製作方法。
背景技術：
微小核糖核酸,英文名為microRNA,簡寫作miRNA,是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子，它們在進化上高度保守，廣泛存在於動植物細胞中，近五年來在人類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑑別出數百種微小核糖核酸分子。微小核糖核酸通過識別靶mRNA的3 』端非翻譯序列，與之不完全互補，從而抑制靶mRNA的翻譯。其序列、結構、豐度和表達方式的多樣性使微小核糖核酸成為信使RNA強有力的調節因子並在基因表達調控領域中起著超乎想像的重要作用。微小核糖核酸與動物的許多正常生理活動密切相關，涉及生物個體發育、組織分化、細胞調亡以及能量代謝等生命活動的方方面面。同時，微小核糖核酸也與許多疾病的發生及發展存在千絲萬縷的聯繫，在發生某種疾病時總有一些微小核糖核酸表達量是上調的，一些是下調的。微小核糖核酸與疾病的關聯有兩個層面首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因為疾病的抑制因子以及促進因子都有可能是微小核糖核酸的靶位點，當微小核糖核酸本身先發生了紊亂表達，比如本來抑制疾病促進因子的微小核糖核酸表達量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達量升高了，其最終結果都會導致下遊一系列基因表達的變化以及某些通路的整體紊亂，進而誘發疾病發生；其次，微小核糖核酸的變化也可以是疾病的結果，這是因為當疾病(如癌症)發生時，會導致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴增，若微小核糖核酸正好位於這一變化區段內，那麼其表達量將發生極其顯著的變化。最近研究發現慢性淋巴細胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中幾種微小核糖核酸的表達水平均有不同程度的下調；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中微小核糖核酸表達時發現有若干組織特定的微小核糖核酸的表達水平相對於正常組織發生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生和發展並且與二型糖尿病等代謝性疾病有密切關聯。這些結果提示微小核糖核酸表達與疾病發生和發展之間存在必然聯繫。微小核糖核酸完全可以作為一類新的疾病標誌物，相比於傳統的病理切片或單一使用的生化指標等手段，能更加準確幫助疾病定性，診斷疾病的發展階段，判斷併發症的發生和惡性疾病復發率及疾病的預後,並判斷藥效和療效。此外,微小核糖核酸還是潛在的藥物靶點，如果抑制疾病過程中上調的微小核糖核酸和過表達下調的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發生和發展。然而，因為人和動物微小核糖核酸的研究工作才開展4年左右，目前還沒有相關的微小核糖核酸試劑盒。因此，需要我們更深入研究腫瘤，各種急慢性傳染病和急慢性疾病(如呼吸系統疾病，免疫系統疾病，心血管系統疾病， 內分泌系統疾病等)過程中微小核糖核酸的特異變化，對微小核糖核酸的進一步探索將為我們提供疾病診療新途徑。微小核糖核酸試劑盒的研發和在臨床醫學的應用將產生巨大經濟效益和社會前景。
發明內容
本發明需要解決的問題是通過研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，愛滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統疾病，免疫系統疾病，心血管系統疾病，內分泌系統疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，得到在疾病及正常生理狀態下差異表達程度大的一類血清微小核糖核酸探針，應用於疾病和病程輔助鑑定，惡性疾病復發率及預後和藥效判斷相關的試劑盒和生物晶片，以提高疾病的早期發現率以及確診的準確性和療效。實現本發明目的的一種技術方案為血清中微小核糖核酸分子的檢測方法I)收集血清樣本；2)將10 μ I血清作為buffer進行逆轉錄反應，來製備cDNA樣品；3)用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；4)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；5) EB染色後在紫外燈下觀察結果。所述步驟5)之後還包括下列步驟用螢光染料EVA GREEN檢測並比較血清樣本相對於正常血清中微小核糖核酸的量的變化。實現本發明目的的另一種技術方案為血清中微小核糖核酸分子的檢測方法I、使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清總RNA(10ml血清通常能富集約 10 μ g左右的RNA)；2、通過RNA逆轉錄反應得到cDNA ；3、用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；4、進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；5、EB染色後在紫外燈下觀察結果。所述步驟5之後還包括下列步驟用螢光染料EVA GREEN檢測並比較血清樣本相對於正常血清中微小核糖核酸的量的變化。在上述檢測方法中，我們首次使用了 RT-PCR技術來發現並證明人和動物血清中能檢測到各種微小核糖核酸，而且它們具有不同的組織來源和表達豐度。其次，為了研究在各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，愛滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統疾病，免疫系統疾病，心血管系統疾病，內分泌系統疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們選取再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經系統淋巴瘤、糖尿病病人血清樣品，同時用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物進行了血清微小核糖核酸的定量PCR實驗，以得到與疾病相關的差異表達的一類血清微小核糖核酸探針。我們直接用病人血清進行定量PCR實驗，用螢光染料EVA GREEN檢測並比較相對於正常血清各種疾病血清中微小核糖核酸的量的變化。一種用於血清中微小核糖核酸檢測的生物晶片，包括人血清中能正常檢測到的全部微小核糖核酸的探針。此晶片能高通量地篩選血清中穩定變化的微小核糖核酸探針，同時通過血清中微小核糖核酸的整體變化預測和診斷疾病。最後我們通過定量PCR技術和生物晶片技術篩選得到和再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經系統淋巴瘤、糖尿病等疾病相關的血清微小核糖核酸，作為輔助預測疾病以及診斷病變程度的探針，來製備PCR試劑盒。一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，通過如下方法製備得到I.通過測序的方法或定量PCR方法確定正常人血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過定量PCR方法和生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內的試劑，製備成用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。其中步驟I和步驟II中所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將10 μ I血清作為緩衝液進行逆轉錄反應，來製備cDNA 樣品，③用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料 EVAGREEN,利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉錄反應得到cDNA，③ 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應。其中，步驟②中所述的逆轉錄的反應體系包括4μ I 15XAMV buffer、2y I IOmM 每種dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor、〗μ I AMV以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混合物，反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應I小時，85°C孵育5分鐘。步驟③所述的利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應的反應條件為95°C 5分鐘進行I個循環一95°C 15秒，60°C I分鐘進行40個循環。步驟II所述的通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下I)合成步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針用晶片點樣儀SmartArray 點制在一張75X 25mm、經過化學修飾的載玻片上製得生物晶片，點制在晶片上的樣品還包括作為內標的U6、tRNA，人工製備的30個鹼基長度的外標，陽性對照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量；
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4)微小核糖核酸的分離取 50 100 μ g 總 RNA 用 Ambion』 s miRMA Isolation Kit分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的螢光標記利用T4RNA連接酶標記方法進行螢光標記，然後再用無水乙醇沉澱，吹乾後用於晶片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶於配方為15 %甲醯胺；O. 2 % SDS ；3XSSC ； 50XDenhardt’s solution的16 μ I雜交液中，於42°C雜交過夜，雜交結束後，先在42°C含 0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗4分鐘，而後在0. 2X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩幹後即可用於掃描；7)晶片掃描晶片用LuxScan 10K/A雙通道雷射掃描儀進行掃描；8)數據提取及分析採用LuxScan 3. O圖像分析軟體對晶片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數位訊號，最後用SAM分析挑選差異表達基因。一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法，包含如下步驟I.通過測序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內的試劑，製備成用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。其中，步驟I所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將10 μ I血清作為緩衝液進行逆轉錄反應，來製備cDNA樣品，③用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN,利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉錄反應得到cDNA，③ 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應。步驟②中所述的逆轉錄的反應體系包括4 μ I 15 XAMV buffer>2 μ I IOmM每種 dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor>2 μ I AMV 以及 I. 5μ I 基因特異性反向引物混合物，反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應I小時，85°C孵育5分鐘。步驟③所述的利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應的反應條件為95°C 5分鐘進行I個循環一95°C 15秒，60°C I分鐘進行40個循環。步驟II所述的通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下I)合成步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針用晶片點樣儀SmartArray 點制在一張75X 25mm、經過化學修飾的載玻片上製得生物晶片，點制在晶片上的樣品還包括作為內標的U6、tRNA，人工製備的30個鹼基長度的外標，陽性對照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量；
4)微小核糖核酸的分離取 50 100 μ g 總 RNA 用 Ambion』 s miRMA Isolation Kit分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的螢光標記利用T4RNA連接酶標記方法進行螢光標記，然後再用無水乙醇沉澱，吹乾後用於晶片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶於配方為15 %甲醯胺；O. 2 % SDS ；3XSSC ； 50XDenhardt’s solution的16 μ I雜交液中，於42°C雜交過夜，雜交結束後，先在42°C含 0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗4分鐘，而後在0. 2X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩幹後即可用於掃描；7)晶片掃描晶片用LuxScan 10K/A雙通道雷射掃描儀進行掃描；8)數據提取及分析採用LuxScan 3. O圖像分析軟體對晶片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數位訊號，最後用SAM分析挑選差異表達基因。目前對疾病進行臨床診斷的生物化學及分子生物學手段還比較繁瑣和粗糙，比如對於癌症的診斷，需要將手術標本進行組織細胞學染色檢驗，過程複雜又耗時耗力。此外， 目前尚沒有一套早期預測及診斷重症疾病的簡易又精確的方法。鑑於目前疾病診斷方法的單一以及早期發現與預測的困難，我們亟待找到一種比目前現有方法都更簡單可靠同時又簡單易行的新方法來鑑定疾病的發生以及判斷病理階段。我們選取血清中的微小核糖核酸作為研究對象，希望通過檢測血清中的微小核糖核酸解決臨床早期診斷等問題。檢測血清中的微小核糖核酸有以下幾個優勢首先，血清相對組織較易獲得，甚至在平常體檢中都可以收集到；其次，血清中的微小核糖核酸反映的是整個機體的生理病理情況，其檢測結果具有指導意義；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的組織器官的病變，因此其又可以作為疾病診斷的一個參數。總之，檢測血清中的微小核糖核酸，簡單易行且效果優越，從血清中的微小核糖核酸的特異性變化這一新角度出發發現疾病並且區分程度，將建立一種更敏感更精確的用於疾病早期確診等的全新技術。本發明與原有技術相比，其優勢在於一、簡單易行，成本低廉。二、特別適用於輔助早期診斷。三、輸出的結果簡單明了且精確。
圖I正常人血清中直接檢測到的部分微小核糖核酸RT-PCR結果。圖2提取正常人血清中RNA，檢測其中微小核糖核酸的RT-PCR結果。圖3病人血清中部分微小核糖核酸相對於正常人血清中微小核糖核酸的變化量。
具體實施例方式I、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR實驗我們使用了 RT-PCR技術次發現並證明人和動物血清中不僅能檢測到各種微小核糖核酸，而且其表達量相當豐富。具體步驟為(1)收集小鼠，大鼠，正常人及某些病人的血清。⑵製備cDNA樣品。此操作有兩種方案，一種方案為將10 μ I血清作為buffer直接進行逆轉錄反應，另一種為使用Trizol試劑(Invitrogen公司)先提取血清總RNA(10ml血清通常能富集約10 μ g左右的RNA)，然後通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。逆轉錄的反應體系包括 4μ1 5 X AMV buffer>2 μ I IOmM each dNTP mixture (Takara 公司)、0· 5 μ I RNaseInhibitor (Takara公司)、2μ I AMV (Takara公司)以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混和物，反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應I小時，85°C孵育5分鐘。(3)PCR及電泳觀察。 將cDNA按1/50稀釋，取1μ I稀釋後的cDNA，加入O. 3μ I Taq酶(Takara公司)，0· 2μ I ΙΟμΜ 正向引物，O. 2μ I ΙΟμΜ通用反向引物，L 2μ I 25mM MgCl2,1. 6μ I 2. 5mM each dNTP mixture (Takara 公司)，2 μ I 10XPCR buffer, 13. 5 μ IH2O, 20 μ I 體系進行 PCR。PCR 的反應條件是95°C 5分鐘進行I個循環一950C 15秒，60°C I分鐘進行40個循環。PCR產物取10 μ I進行3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色後在紫外燈下觀察。具體實驗結果見附圖。圖I是以正常人血清為研究對象，將血清作為buffer直接進行RT-PCR的實驗結果。我們選用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進行PCR反應， 圖I為其中的12種微小核糖核酸。它們分別是血細胞特異性的微小核糖核酸miR-181a、 miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，來自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸 miR-1、miR-133a、miR-206，來自腦組織的微小核糖核酸miR_9、miR-124a,以及來自肝臟的微小核糖核酸miR_122a。從結果可以看出上述四種組織來源的微小核糖核酸在血液中都能檢測到。但是並非全部五百多個成熟體微小核糖核酸在血清中都有高豐度表達，有些微小核糖核酸是很微量的，甚至不能正常檢測到。為了進一步驗證血清中存在微小核糖核酸，我們先提取正常人血清中的RNA，然後選用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進行PCR實驗，結果如圖2所示。圖2的結果與圖I的結果很吻合，PCR產物都單一，表明這兩種實驗方法都能檢測到人血清微小核糖核酸的表達和豐度。此外，我們用同樣的方法檢測了小鼠和大鼠血清中五百多個微小核糖核酸的表達和豐度，同樣發現不同組織來源的微小核糖核酸在小、大鼠血清中有表達。2、血清中微小核糖核酸的real-time PCR實驗為了研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，愛滋病等)和急慢性疾病 (如呼吸系統疾病，免疫系統疾病，心血管系統疾病，內分泌系統疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們進行了血清微小核糖核酸的定量PCR實驗。定量PCR實驗原理及實驗步驟同RT-PCR —樣，唯一不同是在PCR的時候加入了螢光染料EVA GREEN。儀器使用的是ABI Prism7300螢光定量PCR儀，反應條件為95°C 5分鐘進行I個循環一95°C 15 秒，60°C I分鐘進行40個循環。數據處理方法為Λ Λ Ct法，Ct設為反應達到域值時的循環數，則每個微小核糖核酸相對於標準內參的表達量可以用方程2_"CT表示，其中ACt = Ct# .-Ct #。我們將病人血清樣本與正常人血清樣本直接進行逆轉錄反應，通過定量PCR反應比較其中所含微小核糖核酸的量。我們選取再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經系統淋巴瘤、糖尿病病人血清樣品，同時用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸進行PCR實驗。圖3僅是上述提及的四種組織來源的12種微小核糖核酸在正常人和病人血清中進行定量PCR的實驗結果。再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經系統淋巴瘤、糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相對於正常人的量的比值分別有上調和下調，表明血清微小核糖核酸可以作為一類新的疾病診療預測的標誌物。此外，從圖3可知，在一種疾病中不同微小核糖核酸在血清中表達水平不同，提示可能是不同疾病過程中，對不同組織來源的微小核糖核酸，血細胞免疫應答不同或細胞破裂或分泌微小核糖核酸途徑不同造成的。3、用於診斷疾病的血清微小核糖核酸晶片的製作
為了驗證通過定量PCR篩選出的與疾病相關的一類血清微小核糖核酸探針準確可靠性，我們製作了血清微小核糖核酸的生物晶片，該晶片包含了人血清中能正常檢測到的全部微小核糖核酸的探針。此外,晶片能高通量地篩選血清中穩定變化的微小核糖核酸探針，同時通過血清中微小核糖核酸的整體變化預測和診斷疾病。我們首先通過測序的方法或定量PCR方法確定血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸，然後合成這些微小核糖核酸的的反向互補探針，再把這些探針用晶片點樣儀SmartArray 點制在一張75X25mm、經過化學修飾的載玻片上。點制在晶片上的樣品還包括作為內標的U6、tRNA，人工製備的30 個鹼基長度的外標，陽性對照Hex等。整個點陣分成4個亞陣，每個亞陣有23行，21列，點間距為185 μ m，點的直徑約為130 μ m，每條探針重複三次。晶片操作流程為(I)提取血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量；⑵微小核糖核酸的分離取50-100 μ g總 RNA 用 Ambion，s miRNA Isolation Kit (Cat #· 1560)分離微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸樣品的螢光標記利用T4 RNA連接酶標記方法進行螢光標記，然後再用無水乙醇沉澱， 吹乾後用於晶片雜交；⑷雜交與清洗將RNA溶於16 μ L雜交液中(15%甲醯胺；0. 2% SDS ;3 XSSC ;50 XDenhardt』 s solution)，於 42°C雜交過夜。雜交結束後，先在 42°C左右含0. 2% SDS, 2 X SSC的液體中洗4分鐘，而後在0. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩幹後即可用於掃描；(5)晶片掃描晶片用LuxScanlOK/A雙通道雷射掃描儀進行掃描；(6)數據提取及分析採用LuxScan3. O圖像分析軟體對晶片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數位訊號，最後用SAM分析挑選差異表達基因。將定量PCR技術和生物晶片技術雙重驗證的在疾病及正常生理狀態下差異表達程度大的一類血清微小核糖核酸探針，用於製備生物晶片，方法同上。此晶片與傳統晶片相比，製作工藝和操作流程沒有很大改進，但是此晶片簡化了探針庫，由此將大大減少晶片的製作成本和生產時間，易於製備。同時也增加了晶片的疾病針對性和實用性。將此晶片投入實踐，僅僅需要病人的血清而不需要任何其它組織就可以在早期發現疾病，幫助指導診斷和治療。4、專門用於疾病診斷與預測的微小核糖核酸試劑盒的製作用於診斷預測各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，愛滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統疾病，免疫系統疾病，心血管系統疾病，內分泌系統疾病等)的微小核糖核酸試劑盒的製作工藝和操作流程是基於定量PCR技術和生物晶片技術。我們首先通過測序的方法或PCR方法確定正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸。然後通過定量PCR 技術和生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針。此試劑盒包括一批血清微小核糖核酸探針,Taq酶、dNTP等試劑。此試劑盒價值在於只需要血清而不需要其它組織樣品，通過最精簡的探針庫檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該變化趨勢預測疾病的發生可能或診斷疾病的病理階段。因此將此試劑盒投入實踐，特別對於不能活檢組織的疾病如胰腺癌等，可以增加在早期發現病變的可能，幫助指導診斷和治療。
權利要求
1. 一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特徵在於通過如下方法製備得到1.通過測序的方法或定量PCR方法確定正常人血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過定量PCR方法和生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內的試劑， 製備成用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。
2.根據權利要求I所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特徵在於步驟I和步驟II中所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將 ο μ I血清作為緩衝液進行逆轉錄反應，來製備CDNA樣品，③ 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVAGREEN， 利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉錄反應得到cDNA，③用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN，利用 ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應。
3.根據權利要求2所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特徵在於步驟②中所述的逆轉錄的反應體系包括4μ I 15XAMV buffer、2y I IOmM每種dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor、2 μ I AMV以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混合物，反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應I小時，85°C孵育5分鐘。
4.根據權利要求2所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特徵在於步驟③所述的利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應的反應條件為95°C 5分鐘進行I個循環一950C 15秒，60°C I分鐘進行40個循環。
5.根據權利要求I所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒，其特徵在於步驟II所述的通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下1)合成步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針用晶片點樣儀SmartArray 點制在一張75X25mm、經過化學修飾的載玻片上製得生物晶片， 點制在晶片上的樣品還包括作為內標的U6、tRNA，人工製備的30個鹼基長度的外標，陽性對照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量；4)微小核糖核酸的分離取50 100μ g總RNA用Ambion』 s miRMA Isolation Kit 分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的螢光標記利用T4RNA連接酶標記方法進行螢光標記，然後再用無水乙醇沉澱，吹乾後用於晶片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶於配方為15%甲醯胺；0.2% SDS ；3XSSC ；50XDenhardtJ s solution的16 μ I雜交液中，於42°C雜交過夜，雜交結束後，先在42°C含0. 2% SDS, 2 X SSC 的液體中洗4分鐘，而後在0. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩幹後即可用於掃描；7)晶片掃描晶片用LuxScan10K/A雙通道雷射掃描儀進行掃描；8)數據提取及分析採用LuxScan3. O圖像分析軟體對晶片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數位訊號，最後用SAM分析挑選差異表達基因。
6.一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法，其特徵在於包含如下步驟I.通過測序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸;II.通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內的試劑， 製備成用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。
7.根據權利要求4所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法，其特徵在於步驟I所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將 ο μ I血清作為緩衝液進行逆轉錄反應，來製備CDNA樣品，③ 用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉錄反應得到cDNA，③用人全部五百多個成熟體微小核糖核酸設計引物，向PCR體系中加入螢光染料EVA GREEN，利用 ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應。
8.根據權利要求6所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法，其特徵在於步驟②中所述的逆轉錄的反應體系包括4 μ I 15 XAMV buffer>2 μ I IOmM每種 dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor>2 μ I AMV 以及 I. 5μ I 基因特異性反向引物混合物，反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應I小時，85°C孵育5分鐘。
9.根據權利要求6所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法，其特徵在於步驟③所述的利用ABI Prism7300螢光定量PCR儀進行定量PCR反應的反應條件為95°C 5分鐘進行I個循環一95°C 15秒，60°C I分鐘進行40個循環。
10.根據權利要求6所述的一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒的製作方法， 其特徵在於步驟II所述的通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下1)合成步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補探針用晶片點樣儀SmartArray 點制在一張75X25mm、經過化學修飾的載玻片上製得生物晶片， 點制在晶片上的樣品還包括作為內標的U6、tRNA，人工製備的30個鹼基長度的外標，陽性對照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質量；4)微小核糖核酸的分離取50 100μ g總RNA用Ambion』 s miRMA Isolation Kit 分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的螢光標記利用T4RNA連接酶標記方法進行螢光標記，然後再用無水乙醇沉澱，吹乾後用於晶片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶於配方為15%甲醯胺；0.2% SDS ；3XSSC ；50XDenhardtJ ssolution的16μ I雜交液中，於42°C雜交過夜，雜交結束後，先在42°C含O. 2% SDS, 2X SSC 的液體中洗4分鐘，而後在O. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩幹後即可用於掃描；7)晶片掃描晶片用LuxScan10K/A雙通道雷射掃描儀進行掃描；8)數據提取及分析採用LuxScan3. O圖像分析軟體對晶片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數位訊號，最後用SAM分析挑選差異表達基因。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒及其製作方法。本發明所述的試劑盒通過如下方法製備得到I.通過測序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過生物晶片技術篩選在疾病及正常生理狀態下表達量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預測是否發生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內的試劑，製備成用於血清中微小核糖核酸檢測的試劑盒。此試劑盒投入實踐，特別對於不能活檢組織的疾病，可以增加在早期發現病變的可能，幫助指導診斷和治療，把疾病的確診和治療推上一個新高度。
文檔編號C12Q1/68GK102605094SQ20121010418
公開日2012年7月25日 申請日期2007年11月2日 優先權日2007年11月2日
發明者巴一, 張峻峰, 張燕, 張紅傑, 張辰宇, 曾柯, 殷媛, 王可慧, 王進, 蔡星, 郭繼剛, 陳江寧, 陳熹 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司