菌株及其構建方法、應用與流程
2023-05-13 11:28:36 1
本發明涉及微生物領域，特別涉及菌株及其構建方法、應用。
背景技術：
：目前，甾體激素類藥物是僅次於抗生素的第二類藥物，在製備保健品、治療呼吸系統疾病、內分泌失調、淋巴白血病、風溼病以及皮膚病等方面被廣泛應用。菜油甾醇(campesterol)作為甾體激素類藥物的重要中間體，可作為合成4AD、ADD、9α-OH-AD等重要甾體中間體和黃體酮、氫化可的松等重要甾體類藥物的前體，在醫藥合成領域有重大應用。菜油甾醇的製備大多採用植物提取，但植物提取過程步驟多、收率低、副產物分離複雜，並且易對環境造成汙染，極大的限制了菜油甾醇的生產和應用。而微生物合成以低成本、高產量和產品安全性等被認為是有前途的生產方法。釀酒酵母作為公認的安全模式微生物，遺傳背景清楚、基因操作簡單、可進行大規模發酵生產。而耶氏解脂酵母是非常規酵母的一種，被認為是安全的，能用於藥物和食品生產上。其適用於高密度發酵，異源蛋白表達量高，並且能夠利用普通碳水化合物、油脂類、烷烴類物質為底物使之更適應工業化大規模生產。菜油甾醇在酵母細胞中的合成，需要將其內源生產麥角固醇的路徑截斷，同時引入外源基因進而獲得菜油甾醇。但是目前獲得的重組菌株搖瓶發酵菜油甾醇的含量較低，無法滿足工業化生產需求。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供菌株及其構建方法、應用。重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種酵母底盤菌株生產菜油甾醇的方法相對於植物提取成本低、副產物少且汙染小，為菜油甾醇的工業生產提供了一種切實可行的方法為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了高產菜油甾醇的菌株，在底盤菌株中導入外源功能基因DHCR7。在本發明的一些具體實施方案中，所述外源功能基因包括斑馬魚(Daniorerio)來源的DHCR7基因或衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)來源的DHCR7基因。在本發明的一些具體實施方案中，所述斑馬魚(Daniorerio)來源的DHCR7基因的序列如SEQIDNo.1所示。在本發明的另一些具體實施方案中，所述衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)來源的DHCR7基因的序列如SEQIDNo.2所示。在本發明的一些具體實施方案中，所述底盤菌株為酵母。在本發明的一些具體實施方案中，所述酵母包括釀酒酵母或耶氏解脂酵母。在本發明的一些具體實施方案中，所述釀酒酵母為釀酒酵母CEN.PK2-1，所述耶氏解脂酵母為耶氏解脂酵母ATCC201249。在本發明的一些具體實施方案中，所述菌株的構建方法為：以釀酒酵母CEN.PK2-1為底盤菌株，利用CRISPR技術敲除內源ERG5基因，將所述外源功能基因整合至釀酒酵母底盤菌基因組。在本發明的另一些具體實施方案中，所述菌株的構建方法為：以耶氏解脂酵母ATCC201249為底盤菌株，在不敲除ERG5的基礎上，利用整合型質粒pYLEX1在底盤菌基因組上整合所述外源功能基因。本發明還提供了所述的菌株在發酵生產菜油甾醇中的應用。本發明還提供了所述的菌株的構建方法，以釀酒酵母CEN.PK2-1為底盤菌株，利用CRISPR技術敲除內源ERG5基因，將所述外源功能基因整合至釀酒酵母底盤菌基因組。本發明還提供了所述的菌株的構建方法，以耶氏解脂酵母ATCC201249為底盤菌株，在不敲除ERG5的基礎上，利用整合型質粒pYLEX1在底盤菌基因組上整合所述外源功能基因。本發明還提供了發酵生產菜油甾醇的方法，以所述的菌株接種、發酵，收集菌液，提取獲得菜油甾醇。發酵方法：將本發明提供的菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接種於2mL一級種子培養基中，在30℃、250rpm培養24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於二級種子培養基中，在30℃、250rpm培養12h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於50mL發酵培養基中，於30℃、250rpm條件下培養，監測發酵過程中的菌體密度(OD600)，發酵72小時結束，取全部菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取42mL發酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細胞並在研缽中研磨，直到細胞被研磨成白色極細粉末，轉移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配製的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應過夜。皂化後加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對產物進行萃取，5000rpm離心10min收集有機相真空冷凍乾燥2小時，加入400μL正己烷溶解再次冷凍乾燥4小時，加入400μL色譜甲醇溶解，用2μm有機濾膜過濾後使用高效液相色譜(HPLC)檢測菜油甾醇含量，流動相為乙腈：異丙醇＝3:1，流速為1mL/min，檢測波長205nm，柱溫35℃，進樣量10μL。或將本發明提供的菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接種於5mL一級種子培養基中，在30℃、250rpm培養24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於二級種子培養基中，在30℃、250rpm培養18h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於50mL發酵培養基中，於30℃、250rpm條件下培養，監測發酵過程中的菌體密度(OD600)，發酵144小時結束，取10mL菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取10mL發酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細胞並在研缽中研磨，直到細胞被研磨成白色極細粉末，轉移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配製的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應過夜。皂化後加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對產物進行萃取，5000rpm離心10min收集有機相真空冷凍乾燥2小時，加入400μL正己烷溶解再次冷凍乾燥4小時，加入400μL衍生化試劑N-甲基-N-三甲基矽基三氟乙醯胺(MSTFA)30℃水浴2小時，用2μm有機濾膜過濾後利用GC-TOF/MS檢測菜油甾醇含量。本發明提供了高產菜油甾醇的菌株，在底盤菌株中導入外源功能基因DHCR7。實施例1實驗結果表明，發酵72小時，Sc_Dr_DHCR7的產量最高，達到24.66mg/L。由此可知，篩選最優的基因來源對於重組釀酒酵母生產菜油甾醇有積極意義。實施例2實驗結果表明，發酵144小時，在不截斷ERG5基因基礎上菌株也能夠合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的產量最高，達到73.07mg/L，而已報導的耶氏解脂酵母菜油甾醇生產最佳DHCR7基因來源Yl_Xl_DHCR7產量為16.43mg/L。由此可知，篩選最優的基因來源對於重組耶氏解脂酵母生產菜油甾醇有積極意義，並且在重組耶氏解脂酵母中斑馬魚(Daniorerio)來源DHCR7基因效果明顯好於已報導最高產量的基因來源。本發明利用重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種酵母底盤菌株生產菜油甾醇的方法相對於植物提取成本低、副產物少且汙染小，為菜油甾醇的工業生產提供了一種切實可行的方法，並為下遊孕酮、4AD等甾體激素類藥物的生物合成打下基礎，同時對其他種微生物高產菜油甾醇具有指導意義。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母合成菜油甾醇的路徑圖；圖2示釀酒酵母ERG5基因CRISPR敲除質粒構建過程圖；圖3示釀酒酵母游離多拷貝質粒構建過程圖；圖4示重組釀酒酵母菌株11種來源DHCR7基因的菜油甾醇搖瓶產量比較圖；圖5示耶氏解脂酵母整合型質粒構建過程圖；圖6示重組耶氏解脂酵母菌株6種來源DHCR7基因的菜油甾醇搖瓶產量比較圖；圖7示實施例1菜油甾醇標準曲線；圖8示實施例2菜油甾醇標準曲線。具體實施方式本發明公開了菌株及其構建方法、應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的菌株及其構建方法、應用中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1重組釀酒酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的來源篩選本發明的生產菜油甾醇的重組釀酒酵母菌株的構建方法如下：1、外源功能基因元件的獲得外源基因為用於合成菜油甾醇的關鍵酶C7位還原酶DHCR7基因：選取11種不同來源的功能基因篩選合成菜油甾醇最優的基因來源，DHCR7的基因來源包括褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)、普通狨(Callithrixjacchus)、牛(Bostaurus)、原雞(Gallusgallus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、扁藻(Tetraselmissp.GSL018)、衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)、(CandidatusProtochlamydiaamoebophilaUWE25)、斑馬魚(Daniorerio)等，依次簡寫為Sc_Rn_DHCR7、Sc_Mm_DHCR7、Sc_Hs_DHCR7、Sc_Cj_DHCR7、Sc_Bt_DHCR7、Sc_Gg_DHCR7、Sc_Xl_DHCR7、Sc_Ts_DHCR7、Sc_Wc_DHCR7、Sc_Cpa_DHCR7、Sc_Dr_DHCR7，具體基因序列見表1。上述基因均為經過釀酒酵母密碼子優化並適當規避BsaⅠ限制性內切酶酶切位點，在基因兩端額外添加5』端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通過人工合成得到。表12、敲除ERG5基因的重組釀酒酵母的構建利用CRSPR技術將實驗已有質粒pCRCT及合成的ERG5基因敲除模塊用GoldenGate方法進行構建，獲得pCRCT-ERG5質粒，採用醋酸鋰法將質粒轉化到CEN.PK2-1底盤菌株中，利用Sc-URA固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺尿嘧啶的混合胺基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養後提酵母基因組，對突變區域進行PCR及測序驗證，將驗證正確的重組菌株接入5mLYPD液體培養基中30℃、250rpm培養12h，再次轉接液體YPD中一共轉接三次，利用YPD及Sc-URA固體平板進行篩選，挑取YPD平板上生長並未在Sc-URA平板上生長的單菌落，對該重組菌株保存甘油菌並命名為SyBE_Sc00080007。3、構建生產菜油甾醇的重組釀酒酵母菌株首先，將實驗室模塊庫中pRS425K-ENO2t-PDC1p-GPM1t質粒(可在http://synbioml.org/免費獲取)及獲得的外源DHCR7基因用GoldenGate方法進行構建，獲得11種來源dhcr7的pRS425K-ENO2t-PDC1p-DHCR7-GPM1t釀酒酵母重組游離型多拷貝質粒，採用醋酸鋰法將11種質粒分別轉化到SyBE_Sc00080007底盤菌株中，採用Sc-LEU固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合胺基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養後進行菌落PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌並分別命名為SyBE_Sc00080017、SyBE_Sc00080018、SyBE_Sc00080019、SyBE_Sc00080020、SyBE_Sc00080021、SyBE_Sc00080022、SyBE_Sc00080023、SyBE_Sc00080024、SyBE_Sc00080025、SyBE_Sc00080026和SyBE_Sc00080027。其中，各菌株所含質粒如下SyBE_Sc00080017：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Rn_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080018：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Mm_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080019：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Hs_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080020：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cj_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080021：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Bt_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080022：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Gg_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080023：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Xl_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080024：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Ts_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080025：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Wc_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080026：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cpa_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080027：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Dr_DHCR7-GPM1t4、比較菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇搖瓶產量試驗材料：菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027試驗方法：一級、二級種子培養基：20g/L葡萄糖、6.7g/LYNB(YeastNitrogenBase)、2g/L缺亮氨酸的混合胺基酸粉末、100mg/L腺嘌呤；發酵培養基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白腖、10g/L酵母浸粉、100mg/L腺嘌呤將上述菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接種於2mL一級種子培養基中，在30℃、250rpm培養24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於二級種子培養基中，在30℃、250rpm培養12h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於50mL發酵培養基中，於30℃、250rpm條件下培養，監測發酵過程中的菌體密度(OD600)，發酵72小時結束，取全部菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取42mL發酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細胞並在研缽中研磨，直到細胞被研磨成白色極細粉末，轉移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配製的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應過夜。皂化後加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對產物進行萃取，5000rpm離心10min收集有機相真空冷凍乾燥2小時，加入400μL正己烷溶解再次冷凍乾燥4小時，加入400μL色譜甲醇溶解，用2μm有機濾膜過濾後使用高效液相色譜(HPLC)檢測菜油甾醇含量，流動相為乙腈：異丙醇＝3:1，流速為1mL/min，檢測波長205nm，柱溫35℃，進樣量10μL。試驗結果：標準曲線見圖7。由圖7及圖4菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇產量來看，發酵72小時，Sc_Dr_DHCR7的產量最高，達到24.66mg/L。由此可知，篩選最優的基因來源對於重組釀酒酵母生產菜油甾醇有積極意義。高效液相色譜(HPLC)檢測原始數據見表2。表2實施例2重組耶氏解脂酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的來源篩選本發明的生產菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株的構建方法如下：1、外源功能基因元件的獲得外源基因為用於合成菜油甾醇的關鍵酶C7位還原酶DHCR7基因：選取6種不同來源的功能基因，篩選合成菜油甾醇最優的基因來源，其中含天津大學元英進課題組篩選菜油甾醇產量最高的非洲爪蟾(Xenopuslaevis)DHCR7基因，DHCR7的基因來源包括非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、人(Homosapiens)、原雞(Gallusgallus)、斑馬魚(Daniorerio)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、衣原體(Waddliachondrophila)等，依次簡寫為Yl_Xl_DHCR7、Yl_Hs_DHCR7、Yl_Gg_DHCR7、Yl_Dr_DHCR7、Yl_At_DHCR7、Yl_Wc_DHCR7，具體基因序列見表3。上述基因均為經過耶氏解脂酵母密碼子優化通過人工合成得到。表3不同來源的dhcr7基因序列編號非洲爪蟾(Xenopuslaevis)SEQIDNo.12人(Homosapiens)SEQIDNo.13原雞(Gallusgallus)SEQIDNo.14斑馬魚(Daniorerio)SEQIDNo.15擬南芥(Arabidopsisthaliana)SEQIDNo.16衣原體(Waddliachondrophila)SEQIDNo.172、構建生產菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株在不截斷ERG5基因基礎上引入外源DHCR7基因。首先，將獲得的外源DHCR7基因進行PCR擴增在基因兩端分別引入BglII、KpnⅠ兩個限制性內切酶酶切位點，經BglII、KpnⅠ雙酶切後利用In-Fusioncloningreaction重組到經BamHⅠ、KpnⅠ線性化的pYLEX1質粒上，獲得6種來源dhcr7的pYLEX1-DHCR7耶氏解脂酵母重組整合型單拷貝質粒，採用醋酸鋰法將6種質粒分別轉化到ATCC201249底盤菌株中，整合於基因組pBR322platform位置，採用Sc-LEU固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合胺基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養後提取酵母基因組進行PCR驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌並分別命名為SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008。其中，各菌株基因組基因型如下SyBE_Yl02060002：pBR322::Yl_Xl_DHCR7SyBE_Yl02060004：pBR322::Yl_Hs_DHCR7SyBE_Yl02060005：pBR322::Yl_Gg_DHCR7SyBE_Yl02060006：pBR322::Yl_Dr_DHCR7SyBE_Yl02060007：pBR322::Yl_At_DHCR7SyBE_Yl02060008：pBR322::Yl_Wc_DHCR73、比較菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇搖瓶產量試驗材料：菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008試驗方法：一級、二級種子培養基：22g/L葡萄糖、20g/L蛋白腖、10g/L酵母浸粉；發酵培養基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白腖、10g/L酵母浸粉將上述菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接種於5mL一級種子培養基中，在30℃、250rpm培養24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於二級種子培養基中，在30℃、250rpm培養18h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種於50mL發酵培養基中，於30℃、250rpm條件下培養，監測發酵過程中的菌體密度(OD600)，發酵144小時結束，取10mL菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取10mL發酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細胞並在研缽中研磨，直到細胞被研磨成白色極細粉末，轉移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配製的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應過夜。皂化後加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對產物進行萃取，5000rpm離心10min收集有機相真空冷凍乾燥2小時，加入400μL正己烷溶解再次冷凍乾燥4小時，加入400μL衍生化試劑N-甲基-N-三甲基矽基三氟乙醯胺(MSTFA)30℃水浴2小時，用2μm有機濾膜過濾後利用GC-TOF/MS檢測菜油甾醇含量。試驗結果：菜油甾醇標準曲線見圖8。由圖8及圖6菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇產量來看，發酵144小時，在不截斷ERG5基因基礎上菌株也能夠合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的產量最高，達到73.07mg/L，而已報導的耶氏解脂酵母菜油甾醇生產最佳DHCR7基因來源Yl_Xl_DHCR7產量為16.43mg/L。由此可知，篩選最優的基因來源對於重組耶氏解脂酵母生產菜油甾醇有積極意義，並且在重組耶氏解脂酵母中斑馬魚(Daniorerio)來源DHCR7基因效果明顯好於已報導最高產量的基因來源。氣質聯用(GC-TOF/MS)檢測原始數據見表4。表4本發明揭示在重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種模式菌株中，斑馬魚(Daniorerio)來源C7位還原酶(DHCR7)均具有最佳的效果，該結論同時也為其他種微生物高產菜油甾醇提供指導意義。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3