一株具誘導大豆抗莠去津的肺炎克雷伯氏菌及應用的製作方法

2023-05-13 16:46:51 1

專利名稱：一株具誘導大豆抗莠去津的肺炎克雷伯氏菌及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物農藥技術領域，具體涉及一種誘導大豆抗阿特拉津的肺炎克雷 伯氏桿菌及應用。
背景技術：
阿特拉津是一種在世界範圍內廣泛使用的旱田除草劑，中文商品名為莠去津。阿 特拉津(Atrazine)，化學名2-氯-4-乙氨基_6_異丙氨基-1，3，5-三嗪，是選擇性三氮苯 類除草劑，1952年由瑞士 Ciba-Geigy化學公司開發。可用於玉米、高粱、甘蔗、果樹、苗圃、 林地等防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草。由於其優良的除草功效及低廉的價格，1959年 投入商業生產。可與乙革胺，甲草胺，異丙甲學胺等多種醯胺類除草劑混合，增強除草活性 和使用範圍。在旱地除草劑品種中，阿特拉津佔有重要地位。由於成本低且除草效果好，在 世界各國得到了大面積的推廣和使用，是國際上出售的除草劑中銷售量最大的重要除草劑 之一。國外使用該除草劑已有50年的使用歷史，我國從80年代初開始使用。除草劑對雙子葉和單子葉作物具有嚴格的選擇作用，除草劑大面積使用，使得作 物間套作的優良栽培措施難以實現。特別是對玉米和大豆的間套作表現更為突出。通常玉 米田要採用阿特拉津除草劑進行苗前封閉除草，而阿特拉津對大豆有較強的毒害作用，因 此，生產者多是採用清種玉米或採用人工除草。對於大豆田，除草較為困難，大豆田的除草 劑成本相對較高，使用除草劑易產生藥害。針對生產上存在這一問題，通過系統篩選獲得一株細菌，利用該菌或該菌的代謝 產物處理大豆種子，可誘導大豆在種子萌發和生長期間產生對除草劑阿特拉津的抗性，從 而解決了大豆田用阿特拉津除草的問題。

發明內容
本發明的目的是獲得一株可誘導大豆在種子萌發和生長期間產生對除草劑阿特 拉津抗性的菌株，將菌株按常規液體發酵培養後，可以用該菌或該菌的代謝產物，開發出處 理大豆種子的種子處理劑，經過處理的大豆種子可以使大豆產生對大豆敏感的阿特拉津除 草劑的抗性。本發明篩選獲得的一株細菌菌株是肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北 京.朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期2009年11月24日；保藏登記入冊的編號 CGMCC No. 3471。肺炎克雷伯氏菌是從大量土壤細菌菌株中篩選出的一株對大豆具有強誘 導活性的細菌菌株。肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK該菌株是羅在 全於2007年7月從中國遼寧省營口市土壤細菌菌株中篩選出的一個細菌菌株。本發明通過研究發現，土壤細菌有很多株細菌都具有一定的活性，從這些細菌中 篩選出一株性狀相對較好的菌株肺炎克雷伯氏桿菌(KlebsiellapenumoniadSneb YK進行 了進一步的研究。
本發明還涉及用於誘導大豆種子的細菌代謝物，其是由本發明的細菌菌株肺炎克 雷伯氏桿菌(KlebsiellapenumoniadSneb YK經過常規的液體發酵培養後提取製備的。本發明的細菌菌株肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK是通過 試管種培養後，再經擴大發酵培養來製備，其具體方法如下1.試管種培養培養基配方為牛肉膏蛋白腖(NA)培養基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白腖10g，酵母 浸膏lg，蔗糖10g，瓊脂20g，加水至1000mL。2.液體發酵培養其中液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 腖_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、餘下為蒸餾水，pH為7-9。將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝100mL)液體培養基中，25°C 28°C下，搖 床轉速以150r mirT1 200r mirT1、發酵45-50小時，優選48h。液體發酵的菌種可以通過大型發酵罐進行規模生產，其產品為發酵液或發酵液的 製成品。本發明還涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發明所述的肺炎克雷伯氏 桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK本身或其代謝物作為有效活性成分。本發明的肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK或其代謝物具有 對大豆的誘導活性，可用於大豆的種子處理，處理後的大豆可以採用對大豆敏感的莠去津 進行除草，從而解決大豆田用阿特拉津除草的問題。
具體實施例方式為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。實施例1 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK的獲得取大豆田的土壤lg，加入無菌水100ml，取200 iil，加入冷卻至35°C以下的滅菌的 20ml NA液體培養基，25°C下培養待菌落長出後，根據菌落色澤和邊緣狀態，挑取肺炎克雷 伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae)菌落單獨保存，進行擴繁和生理生化測定，培養性狀符 合肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae)特徵的保存備用。實施例2 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK的培養首先對肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK菌株進行發酵培養， 然後對發酵培養後的代謝產物進行大豆誘導活性試驗，確定其對大豆的誘導作用。將肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK的菌體接種到試管瓊脂 培養基上，培養基配方為NA培養基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白腖10g，酵母浸膏lg，蔗糖 10g，瓊脂20g，加水至1000mL。25°C培養10d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝100mL)液體培養基中，培養基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白腖1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、餘下為蒸餾 7jC，PH為8。在25°C下培養，搖床轉速以180r mirT1、發酵48h，形成的發酵液或發酵液的 製成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以種植在噴施莠去津除草劑的 土壤中，大豆出苗時可以抵抗阿特拉津(莠去津)的藥害。實施例3 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK的發酵
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基本同實施例一，不同之處是將液體培養的菌種接種到1000L的發酵罐進行發 酵，在25°C下培養，pH為8，發酵48h。實施例4 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK的發酵基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白腖1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、餘 下為蒸餾水，PH為7。實施例5 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella penumoniae) Sneb YK發酵產品的使用將發酵液稀釋為108cfu/L，按1 50的比例處理包衣大豆種子，晾乾後，將處理過 的大豆種子正常播種，按150g/667m2噴施阿特拉津(莠去津)，大豆可以正常出苗生長。
權利要求
一株處理大豆種子後具有誘導大豆產生抗阿特拉津(莠去津)抗性的細菌菌株，其特徵在於該菌株為肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae SnebYK，已於2009年11月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3471。
2.具有誘導大豆產生抗阿特拉津(莠去津)抗性的細菌代謝物，其特徵在於，是由權利 要求1所述的細菌菌株經過液體發酵後形成的發酵液製備的，液體發酵培養基配方為以 重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白腖_2%、酵母浸膏0. 1%-0. 5%、蔗糖 1% _2%、餘下為蒸餾水，pH為7-9。
3.權利要求1所述的細菌菌株的液體發酵方法，其特徵在於液體發酵培養基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白腖_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、餘下為蒸餾水，pH為7-9，發酵溫度為25-28 °C，搖床轉速150r mirT1 200r mirT1、發酵時間 45_50h。
4.根據權利要求3所述的液體發酵方法，其特徵在於所述的發酵時間為48h.
5.具有誘導大豆產生抗阿特拉津(莠去津)抗性的細菌代謝物的製備方法，其特徵 在於是由權利要求1所述的細菌菌株經過液體發酵後形成的發酵液製備的，液體發酵 培養基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白腖1%_2%、酵母浸 膏0. _0.5%、蔗糖-2%、餘下為蒸餾水，pH為7-9，發酵溫度為25-28°C，搖床轉速 150r mirT1 200r mirT1、發酵時間 45_50h。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的發酵時間為48h.
7.一種用於發酵權利要求1所述的細菌菌株的培養基，其特徵在於發酵培養 基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白腖1%_2%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、餘下為蒸餾水。
8.權利要求7所述的培養基，其特徵在於培養基的pH為7-9。
9.一種大豆種子處理劑，其特徵在於，包含有效量的權利要求1所述的細菌菌株或權 利要求2所述的細菌代謝物作為活性成分，用於誘導大豆產生對大豆敏感的除草劑阿特拉 津(莠去津)的抗性。
10.權利要求1所述的細菌菌株或權利要求2所述的細菌代謝物在誘導大豆抗阿特拉 津(莠去津)除草劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株處理大豆種子後具誘導大豆產生對阿特拉津抗性的肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)SnebYK的培養方法及其應用，屬於微生物農藥技術領域。本發明涉及的細菌菌株SnebYK，已於2009年11月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3471。通過液體發酵培養製備，其代謝物處理大豆種子後，大豆種子萌發出苗時可以產生對阿特拉津的抗性。通過該細菌的代謝產物處理後的大豆可以與玉米等禾本科作物混種，採用統一阿特拉津除草劑除草，解決了玉米與大豆間套作的除草難題，具良好的應用開發前景。
文檔編號C12N1/20GK101831395SQ20101012410
公開日2010年9月15日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 羅在全, 陳立傑 申請人:瀋陽農業大學