磷酸激酶及其應用的製作方法

2023-05-13 16:45:16

專利名稱：磷酸激酶及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的具有抗腫瘤功能的磷酸激酶-RX218蛋白以及編碼RX218蛋白的多核苷酸。本發明還涉及此多核苷酸和蛋白質的製法和用途，以及含該RX218蛋白的組合物。
背景技術：
「高質量」的藥物靶點基因(簡稱藥靶)是新藥開發的源頭。人類基因組計劃的完成雖然為人類帶來了治療疾病的令人嚮往的前景，但除大分子蛋白藥外，基因本身並不一定是藥靶。從基因到新藥，這一鏈條仍然缺少許多必不可少的環節。其中，基因功能研究，因其可以在分子層面上揭示人類健康和疾病的奧秘，尋找出最重要的致病基因，而成為確定基因能否成為藥靶的關鍵步驟。
國外大型製藥廠已發現，單靠基因序列數據和生物信息分析雖然能夠找到大量潛在藥物靶點基因，但這類基因只能被歸類為「低質量」藥靶。藥物開發人員面對數目巨大的低質量藥靶變得無所適從，迫切需要大量的基因功能研究加以驗證，才能篩選出新藥開發可以依賴的「高質量」靶點。所以，功能基因組學研究蘊藏著巨大的應用價值和商業前景。
在目前可以作為靶點的5,000個基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公認的藥物篩選基因靶點，與磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各類受體統稱為一類靶點。磷酸激酶(kinase)將ATP或GTP位的磷酯基轉移到底物蛋白質胺基酸殘基上，催化蛋白質磷酸化。蛋白質的磷酸化和去磷酸化是蛋白質調節其功能/活性的一種重要方式。如MAPK和轉錄因子CREB，Jun等，在磷酸化狀態時具有活性，而在非磷酸化狀態時沒有活性；而轉錄因子IкBα等則相反，在磷酸化狀態時沒有活性，而在非磷酸化狀態時具有活性。
蛋白質的磷酸化-去磷酸化是細胞信號轉導過程中的重要環節。細胞信號轉導是指細胞通過位於胞膜或胞內的受體，感受細胞外信息分子的刺激，經複雜的細胞內信號轉導系統的轉換，發揮生物學效應，進而幾乎調節著生命活動的所有過程，包括細胞的增殖、發育和分化，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。人類很多疾病都與信號轉導通路密切相關，如在腫瘤壞死因子(TNF)導致的炎症(inflammation)反應中，腫瘤壞死因子通過結合受體激活一系列蛋白磷酸激酶之間的相互作用，最終激活NF-кB而引起炎症反應。生物化學家以及不少公司都在通過研究蛋白之間的相互作用來揭示信號傳遞通路的關鍵部位，並開發影響信號傳遞的藥物，以達到治療疾病的目的。信號轉導過程的順利進行有賴於多種蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、蘇氨酸殘基磷酸化及絲氨酸殘基磷酸化，而這個過程正是由磷酸激酶催化完成的。
鑑於信號轉導通路在細胞增殖、分化和多種疾病發生過程中的重要、甚至決定性的作用，以及磷酸激酶在信號轉導通路極其重要的地位，設計和開發以磷酸激酶為靶點的新藥，通過調節、控制信號轉導通路治療疾病，無疑是一種針對性強、高效的理想途徑，具有治療多種疾病的潛在前景。目前針對激酶的藥物包括PKC活性調節劑、PKA抑制劑、PTK抑制劑和受體介導的鈣通道調節劑等，其中部分已經進入臨床試驗。但現有的激酶藥物靶點尚遠遠不能滿足人類戰勝疾病、攻克腫瘤的需求，本領域仍需更特異、更有效的新的激酶作為藥靶，從而有效拓寬治療疾病的途徑，增進人類的健康。因此，開發新的磷酸激酶成為一種新藥開發的迫切需要。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的磷酸激酶-RX218蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些蛋白質的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些蛋白質的方法以及該蛋白質和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種分離的RX218蛋白，它選自下組具有SEQ ID NO2胺基酸序列的蛋白質，或其具有激酶活性的保守性變異蛋白質、活性片段、或活性衍生物。
較佳地，該蛋白質選自下組
(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個(如1-10，較佳地1-8個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，該蛋白具有SEQ ID NO2胺基酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼上述的RX218蛋白。
較佳地，所述的多核苷酸多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的蛋白質。更佳地，該多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1101位的序列。
在本發明的第三方面，提供了一種載體，它含有上述編碼RX218蛋白的多核苷酸，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了一種蛋白質的製備方法，該方法包含步驟(a)在表達條件下，培養上述的宿主細胞；(c)從培養物中分離出蛋白質，所述蛋白質含有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
在本發明的第五方面，提供了一種能與上述的RX218蛋白特異性結合的抗體。
在本發明的第六方面，提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量(或0.001-99wt％)的上述的RX218蛋白、或其拮抗劑(如抗體)以及藥學上可接受的載體。
在本發明的第七方面，提供了一種RX218蛋白的用途，它被用作P16蛋白的抑制劑。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1顯示了RX218的PCR產物電泳圖。其中各泳道如下泳道1.DNA分子量標準品；泳道2.以人體組織混合RNA為模板，常規RT-PCR擴增產物；泳道3.以人體組織混合RNA為模板，SMART RT-PCR擴增產物；泳道4-8.分別以胎腦、Hela、混合(Hela+胎腦+淋巴)、淋巴、腎cDNA文庫為模板的擴增產物。結果表明，除不同來源的RT(包括SMART)產物外，在HELA文庫，混合文庫(Hela+胎腦+淋巴)，以及腎中有RX218條帶。
圖2顯示了RX218蛋白的結構。其中，SEQ ID NO2的第18-41位的胺基酸構成ATP結合位點，第12-272位胺基酸構成其激酶結構域。
圖3顯示了RX218的定量螢光PCR檢測結果。其中圖A是肺鱗狀細胞癌及相應正常肺組織；圖B為食管鱗狀細胞癌及相應正常食管組織。
圖4顯示了RX218與P16的免疫共沉澱結果。其中，CP表示對照蛋白。在293T細胞進行轉染和免疫共沉澱後，可以看見RX218和P16之間存在明顯的相互作用。
圖5顯示了RX218的磷酸化活性。Flag-RX218能夠自身磷酸化，而Flag-RX218的ATP結合位點突變型(RX218mut)則不能。
圖6顯示了RX218是P16的抑制劑，可影響P16引起的G1期阻滯。在U2OS細胞中轉染了P16基因後(B)可以看到明顯G1期的阻滯作用(G1期從A45.19％上升至B71.35％)，共轉RX218之後這一作用消失(E)。相反，共轉P16和RX218m(ATP結合位點突變型)(F)則對P16的G1期的阻滯作用沒有明顯影響。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，首次分離出了新的人磷酸激酶RX218的全長cDNA，其編碼含367個胺基酸的RX218蛋白。RX218蛋白含有磷酸激酶的結構域，磷酸化實驗證實RX218確是磷酸激酶。酵母雙雜交實驗和免疫共沉澱實驗結果證實了RX218和P16之間確實具有直接的相互作用。在此基礎上完成了本發明。
在本發明中，術語「磷酸激酶RX218」或「RX218蛋白」或「RX218多肽」可互換使用，都指基本上具有RX218蛋白胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白質。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的RX218蛋白。這些術語還包括含有或不含有信號肽的RX218蛋白。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和蛋白質是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白質如從天然狀態中與存在的其他物質中分開，則為分離純化。
如本文所用，「分離的RX218蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術(尤其是HPLC)分離純化出RX218蛋白。
本發明的蛋白質可以是重組蛋白質、天然蛋白質、合成蛋白質，優選重組蛋白質。本發明的蛋白質可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的蛋白質可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的蛋白質還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括RX218蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然RX218蛋白相同的生物學功能或活性的蛋白質。本發明的蛋白質片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的蛋白質，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的蛋白質，或(iii)成熟蛋白質與另一個化合物(比如延長蛋白質半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白質，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此蛋白質序列而形成的蛋白質(如前導序列或分泌序列或用來純化此蛋白質的序列或酶原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「RX218蛋白」指具有RX218蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的蛋白質。該術語還包括具有與RX218蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸殘基如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸殘基取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸殘基也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括RX218蛋白的活性片段和活性衍生物。
該蛋白質的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與RX218DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質以及利用抗RX218蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白質。本發明還提供了其他蛋白質，如包含RX218蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質外，本發明還包括了RX218蛋白序列的可溶性片段。通常，該片段具有RX218蛋白序列的至少約10個連續胺基酸殘基，通常至少約30個連續胺基酸殘基，較佳地至少約50個連續胺基酸殘基，更佳地至少約80個連續胺基酸殘基，最佳地至少約100個連續胺基酸殘基。
發明還提供RX218蛋白的類似物。這些類似物與天然RX218蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白質包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的蛋白質並不限於上述例舉的代表性的蛋白質。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的蛋白質的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白質的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白質。這種修飾可以通過將蛋白質暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白質。
在本發明中，「RX218保守性變異蛋白質」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸殘基所替換而形成蛋自質。這些保守性變異蛋白質最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1


本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟蛋白質的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟蛋白質的多核苷酸包括只編碼成熟蛋白質的編碼序列；成熟蛋白質的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟蛋白質的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼蛋白質的多核苷酸」可以是包括編碼此蛋白質的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或蛋白質的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的蛋白質的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少60％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％同源性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的蛋白質與SEQ IDNO2所示的成熟蛋白質有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼RX218蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的蛋白質和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的RX218核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得到有關序列。也可直接通過RT-PCR的方法擴增得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白質(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白質序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或RX218蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述蛋白質的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的RX218蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼RX218蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，RX218蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含RX218蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法原生質體法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的蛋白質。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組蛋白質可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白質。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白質沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的RX218蛋白有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)用於篩選促進或對抗RX218蛋白功能的抗體、蛋白質或其它配體。用表達的重組RX218蛋白篩選蛋白質庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激RX218蛋白功能的蛋白質分子。
另一方面，本發明還包括對RX218編碼DNA或是其片段編碼的蛋白質具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於RX218蛋白或片段。較佳地，指那些能與RX218蛋白或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制RX218蛋白的分子，也包括那些並不影響RX218蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的RX218蛋白結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的RX218蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達RX218蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的各類抗體可以利用RX218蛋白的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用蛋白質合成儀合成。與RX218蛋白的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
利用本發明RX218蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與RX218蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。通常，建立適用於高通量篩選的分子和細胞水平篩選模型並進行高通量篩選等相關研究工作。應用E.coli或Bacula virus表達系統，克隆與表達酪氨酸磷酸酯酶活性片段，分離純化重組蛋白，並應用這些重組酶，建立適用於高通量篩選的分子水平篩選模型。通過對大量來源於傳統中草藥的粗提物和純化合物的篩選，尋找有效的活性部位或純化合物。活性指導從有效的活性部位中分離單體。應用高通量篩選獲得小分子抑制劑，檢測對RX218抑制效果，確定小分子抑制劑對RX218的特異性。並應用高通量篩選獲得的小分子抑制劑檢測細胞水平抑制效果。
本發明RX218蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、或拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明RX218蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可用於抑制p16的活性。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1納克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的蛋白質還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的RX218蛋白施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/天，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微克/天-約0.5毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
一種檢測樣品中是否存在RX218蛋白的方法是利用RX218蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與RX218蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在RX218蛋白。
本發明的主要優點在於本發明的RX218是一種新的磷酸激酶，與P16有相互作用，因此可作為藥物靶點進行小分子化合物的篩選，建立針對RX218的藥物篩選模型，尋找能調節RX218激酶活性的小分子化合物，為疾病的診斷、治療帶來新途徑。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1、RX218基因的篩選從已建立的由Genbank中的EST序列合成、沒有任何功能注釋或注釋不完全的「新」基因的cDNA文庫中，應用現代生物信息學PFAM/Profile模式對磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、單過膜受體進行優先篩選，預測到一個新的沒有任何功能注釋的基因，含有磷酸激酶結構域，命名為RX218。
實施例2、RX218基因的獲得為了獲得RX218基因的全長，合成如下引物，以常規方法抽提的人體組織混合RNA為模板，通過常規RT-PCR方法進行擴增。
上遊引物5′GGCCAATCCGGCCATGGATGACGCTGCTGTCCTCAAGC3′(SEQ ID NO3)下遊引物5′GGCCTCTAAGGCCTCACTGGGCCCGCGTCTCTGG 3′(SEQID NO4)該對引物含有SfiI穿梭克隆位點、起始密碼子和終止密碼子，在該酶切位點之間是RX218的編碼序列。
利用該對引物PCR擴增獲得了一個大小約為1100bp的條帶(圖1，泳道2和3)，將此片段回收、克隆入載體後測序得到RX218基因的全長序列，共1104bp(SEQ ID NO1)。
實施例3、RX218序列分析和定位實施例1獲得的1104bp的序列中包含RX218基因的完整編碼區，編碼一個由367個胺基酸組成的蛋白質(SEQ ID NO2)。其中，第18～41位的胺基酸構成ATP結合位點，第12-272位胺基酸構成激酶結構域(圖2)。
根據RX218的EST信息，將其定位於人染色體5q22.3。將人RX218的編碼區與大鼠、小鼠RX218基因序列進行同源性比對，發現有較高同源性。
序列分析結果顯示RX218基因序列中僅含有一個外顯子。由於絕大多數基因都是由內含子和外顯子共同組成，為排除RT-PCR獲得的RX218基因是模板汙染的結果，進一步在胎腦、Hela、混合(Hela+胎腦+淋巴)、淋巴、腎組織的cDNA文庫中利用引物(SEQ ID NO3和4)、通過常規PCR方法進行驗證，結果如圖1中第4～8泳道所示。從圖中可以看出，在Hela、腎臟和混合cDNA文庫中均檢測到RX218基因的存在。因此，這排除了RX218是假基因的可能，克隆獲得的RX218序列確實是由一個外顯子構成的目前尚無任何功能注釋的新基因。
實施例4、RX218的組織分布實時螢光定量PCR(Q-PCR)是目前對基因進行定量分析最為靈敏、精確的技術。用常規方法構建了約300餘對腫瘤組織及其對應正常組織的冰凍組織庫，包含18種腫瘤類型。為了進一步確定RX218基因在各種腫瘤組織中的表達情況，對製備的冰凍組織庫，通過Q-PCR技術，進行定性、定量的研究。
本實施例中，採用Trizol一步法抽提各組織總RNA，並經過DNA酶消化後，作為RT的模板。隨後，設計併合成了以下引物，利用FAM-TAMRA標記的螢光探針實施Q-PCR，上遊引物5』TCAAGAAGATGCTGCGTATCCA 3』(SEQ ID NO5)下遊引物5』TGTGGTAGATGAGGTCCTTGCA 3』(SEQ ID NO6)探針序列5』FAM-CACCGCGTCAACTTCCCACGCT 3』-TAMRA(SEQ ID NO7)部分實驗結果見下表和圖3。
Q-PCR部分結果

N正常組織；MT腫瘤組織。
CT螢光信號達到閾值的PCR循環數。
從上述結果的MT/N比值可以看出，RX218基因或者在食管、肺鱗狀細胞癌的表達較之正常組織明顯增高；或者在其正常組織不表達，特異性的表達於食管、肺鱗狀細胞癌。從Q-PCR擴增曲線可以看到，腫瘤組織的擴增曲線在30個循環後有明顯的上升趨勢，而相應的正常組織無此變化。這同樣說明RX218基因在食管、肺鱗狀細胞癌中的表達增高，與相應正常組織的差異顯著(圖3)。
實施例5、篩選與RX218相互作用的蛋白在本實施例中，採用Clontech公司的Gal4酵母雙雜交系統進行篩選，確定與RX218具有相互作用的蛋白。方法如下將測序驗證的RX218基因通過SfiI克隆位點穿梭轉移到改造過的融合質粒pGBKT 7載體(購自Clontech公司，參見US6770446，US6376652)上，以此作為誘餌(bait)，先後通過轉化法(transformation)和點陣法(mating)對Hela、淋巴和胎腦文庫進行大規模的篩選。
結果，這兩種方法均獲得了P16陽性克隆。這表明，RX218與P16蛋白有相互作用。
實施例6、驗證RX218與p16的相互作用由於酵母雙雜交系統本身可能產生假陽性，因此利用免疫共沉澱技術(Coimmunoprecipitation，Co.IP)進一步在哺乳動物細胞中驗證RX218與P16的作用關係。
用常規方法在pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位點中添加SfiI位點，在分別將flag-tag和myc-tag引入SfiI位點N端，獲得分別帶有上述tag的pcDNA3.1載體。將PCR擴增的RX218(實施例2)和P16基因通過SfiI位點分別克隆入已構建好的帶有flag-tag和myc-tag的pcDNA3.1真核表達載體。然後，用上述重組載體轉染常規的293T細胞。培養24小時後，離心收集細胞，加細胞裂解液裂解後，離心收集上清上樣。分別利用anti-flag、anti-myc的單克隆抗體(購自Sigma公司)，通過Westen-blot法檢測RX218、P16蛋白的表達情況。
結果見圖4。從圖中可以看出，RX218和P16蛋白表達情況良好、表達量穩定。
然後，用anti-flag抗體和Protein G免疫沉澱後，共沉澱產物經SDS-PAGE電泳後電轉移至硝酸纖維膜上，用酶標anti-myc抗體行蛋白免疫印跡雜交。可以看見RX218和P16之間存在著相互作用(圖4，泳道2)。
由於P16基因在人類腫瘤中存在著高頻率的改變，包括缺失和突變，為了明確RX218和不同P16的突變型的關係，本發明人又克隆了p16G101W，p16A100P，p16D74N等已被報導過的P16的病理突變型，同樣在293T細胞進行轉染和免疫共沉澱後發現，RX218和多個P16的突變型都有明顯的相互作用，而且RX218和這些突變型的相互作用比野生型更強。這些結果提示，RX218可能是參與調節腫瘤的發生的一個重要基因。
實施例7、用體外磷酸化技術研究RX218的磷酸化作用為了確定RX218確實具有激酶的活性，在本實施例中進行了RX218的體外自身磷酸化實驗。
首先用常規的定點誘變法構建了RX218的ATP結合位點突變型RX218m(K41A)，即將SEQ ID NO1第41位的Lys置換為Ala，從而使SEQ ID NO2中的41位由K變為A。將RX218及其突變型RX218m都構建到帶有Flag-tag的pcDNA3.1真核表達載體，轉染293T細胞。培養24小時後，裂解細胞，收集上清。用帶有anti-flag抗體的Protein G免疫沉澱後，取一半用於Western印跡法以鑑定RX218的表達；另一半用激酶反應緩衝液(20mM Tris/HCL pH＝7.4，150mMNaCl，10mM MnCl2，50μM ATP，10mM MgCl2)平衡，然後加入10μCiγ-32P ATP，於30℃反應30min。加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩衝液，95℃變性5min後，離心將樣品加入15％ SDS-PAGE梯度膠電泳。電泳完畢，經幹膠後，壓X光片放射自顯影。
結果顯示RX218具有激酶的活性，能夠自身磷酸化，而當將它的ATP結合位點突變之後，其激酶的活性也消失了(圖5)。
實施例8、用FACS和免疫螢光等技術研究目標基因對細胞生理的影響為了進一步明確RX218對細胞周期的作用，運用FACS技術在U2OS細胞中進一步研究RX218的過量表達是否對細胞周期有影響，並進一步明確與P16的關係。
在U2OS細胞(ATCC)中分別轉染帶有P16和RX218基因的pCDNA3.1真核表達載體，然後消化並固定細胞。當往6cm培養板的U2OS細胞中轉染P16基因0.5ug時，可以看到明顯的G1期的阻滯作用(圖6-BG1期從45.9％上升至69.7％)，共轉RX218之後這一作用消失(圖6-E)。相反，共轉P16和RX218m(ATP結合位點突變型)(圖6-F)則對p16的G1期的阻滯作用沒有明顯影響。這表明，RX218對P16活性有抑制作用，是P16的抑制劑。對應於圖6的詳細數據見下表。
RX218對P16活性的抑制作用

實施例9、兔抗RX218蛋白抗體的製備取體重為2公斤左右的雄性紐西蘭大耳兔一隻。以1mg RX218蛋白樣品(實施例6)加弗氏完全佐劑研磨成乳膠狀，在兔頸部多點注射。飼養半個月後，以1mg RX218蛋白樣品加弗氏不完全佐劑研磨成乳膠狀，再在兔頸部多點注射。一個月後，用1.5mgRX218蛋白樣品加弗氏不完全佐劑以同樣的方法加強免疫。半個月後，再用1mgRX218蛋白樣品加弗氏不完全佐劑再次加強免疫。飼養半個月後，頸動脈取血，4℃靜置過夜，2,000轉離心3分鐘。上層血清即為兔抗RX218蛋白抗體。
雜交結果顯示，抗RX218蛋白抗體可與RX218蛋白與專一性地結合。
討論本發明人成功地克隆了RX218的全長cDNA，根據其cDNA分析，RX218編碼的蛋白含有一個磷酸激酶的結構域。應用實時螢光定量PCR技術(Q-PCR)，在多種腫瘤及其對應正常組織中檢測RX218的表達情況。結果顯示，RX218基因在食管、肺的鱗狀細胞癌中表達明顯增強，而在正常組織不表達或表達量很低。這提示，RX218基因在食管、肺鱗狀細胞癌的特異性增高與這些腫瘤的發生、發展有一定相關性。
酵母雙雜交和免疫共沉澱實驗進一步證明，磷酸激酶RX218與p16確實具有直接的相互作用。
P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美國冷泉實驗室Kamb等發現的新抗癌基因，直接參予細胞周期的調控，通過抑制細胞周期蛋白質依賴激酶4、6(Cyclin dependent kinase，CDKE4和CDK6)使細胞周期阻滯於G1期，負調節細胞增殖及分裂，在細胞衰老、腫瘤發生等過程中都具有十分重要的作用。p16基因定位於染色體9P21，全長8.5kb，由2個內含子及3個外顯子組成，編碼16KD的蛋白。CDKs可能是調控細胞周期裝置的核心，CDK4與細胞周期素(Cyclin)的複合體參予細胞周期G1-S轉換的調控。p16蛋白抑制Cdk4活性，最終阻止細胞進入S期，一旦p16基因缺失、突變等導致功能喪失，則不能抑制CDK4，最終導致細胞進入惡性增殖。因此，有人把p16比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會引起細胞惡性增殖、導致惡性腫瘤發生。
目前已經在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中檢測出50％以上的p16基因純合子缺失以及無義、錯義、移碼突變，表明p16基因以缺失、突變方式廣泛參與腫瘤形成。作為細胞增殖的關鍵性負調控因子，對p16及其突變型的深入理解必將促進人類對自身健康和疾病的認識，有效拓寬治療疾病的途徑。然而迄今為止，p16的調控機制仍不清楚。它是如何調整起始轉錄的，有哪些上遊調節因子調控p16的生物學活性，這些調節因子又是通過什麼機制參與p16功能的調控，這些都成為對p16進一步研究中迫切需要解決的問題。本發明的新激酶RX218可能是信號轉導通路中的重要分子，首次證明RX218基因在食管、肺鱗狀細胞癌的mRNA表達有特異性增高，而且RX218與p16具有直接的相互作用，能夠抑制p16所引起的G1期阻滯，這是一個令人鼓舞的結果。因此，對新激酶RX218的深入研究，可能為明確P16的激活及作用機制，進而開發出嶄新的藥物靶點，為人類戰勝腫瘤、延緩衰老帶來突破性進展。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海睿星基因技術有限公司120磷酸激酶及其應用1300356941607170PatentIn version 3.121012111104212DNA213智人(Homo sapiens)4001atggatgacg ctgctgtcct caagcgacga ggctacctcc tggggataaa tttaggagag60ggctcctatg caaaagtaaa atctgcttac tctgagcgcc tgaagttcaa tgtggcgatc120aagatcatcg accgcaagaa ggcccccgca gacttcttgg agaaattcct tccccgggaa180attgagattc tggccatgtt aaaccactgc tccatcatta agacctacga gatctttgag240acatcacatg gcaaggtcta catcgtcatg gagctcgcgg tccagggcga cctcctcgag300ttaatcaaaa cccggggagc cctgcatgag gacgaagctc gcaagaagtt ccaccagctt360tccttggcca tcaagtactg ccacgacctg gacgtcgtcc accgggacct caagtgtgac420aaccttctcc ttgacaagga cttcaacatc aagctgtccg acttcagctt ctccaagcgc480tgcctgcggg atgacagtgg tcgaatggcc ttaagcaaga ccttctgtgg gtcaccagcg540tatgcggccc cagaggtgct gcagggcatt ccctaccagc ccaaggtgta cgacatctgg600agcctaggcg tgatcctcta catcatggtc tgcggctcca tgccctacga cgactccaac660atcaagaaga tgctgcgtat ccagaaggag caccgcgtca acttcccacg ctccaagcac720ctgacaggcg agtgcaagga cctcatctac cacatgctgc agcccgacgt caaccggcgg780ctccacatcg acgagatcct cagccactgc tggatgcagc ccaaggcacg gggatctccc840tctgtggcca tcaacaagga gggggagagt tcccggggaa ctgaaccctt gtggaccccc900gaacctggct ctgacaagaa gtctgccacc aagctggagc ctgagggaga ggcacagccc960caggcacagc ctgagacaaa acccgagggg acagcaatgc aaatgtccag gcagtcggag1020atcctgggtt tccccagcaa gccgtcgact atggagacag aggaagggcc cccccaacag1080cctccagaga cgcgggccca gtga 11042102211367212PRT213智人(Homo sapiens)4002Met Asp Asp Ala Ala Val Leu Lys Arg Arg Gly Tyr Leu Leu Gly Ile1 5 10 15Asn Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Ala Lys Val Lys Ser Ala Tyr Ser Glu20 25 30Arg Leu Lys Phe Asn Val Ala Ile Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Ala35 40 45
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221misc_feature222(1)..(38)223引物
4003ggccaatccg gccatggatg acgctgctgt cctcaagc 38210421134212DNA213人工序列220
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221misc_feature
222(1)..(22)223探針4007caccgcgtca acttcccacg ct 2權利要求
1.一種分離的蛋白質，其特徵在於，它選自下組具有SEQ ID NO2胺基酸序列的蛋白質，或其具有激酶活性的保守性變異蛋白質、活性片段、或活性衍生物。
2.如權利要求1所述的蛋白質，其特徵在於，該蛋白質選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過1-10個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的蛋白。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的蛋白質。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1101位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種蛋白質的製備方法，其特徵在於，該方法包含步驟(a)在表達條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(c)從培養物中分離出蛋白質，所述蛋白質含有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
9.一種能與權利要求1所述的蛋白質特異性結合的抗體。
10.一種組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的蛋白質以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明提供了一種新的磷酸激酶－RX218蛋白，編碼RX218蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種RX218蛋白的方法。RX218蛋白可與P16相互作用，因而可作為藥物靶點篩選新藥。
文檔編號C07K16/40GK1746300SQ200410054290
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月6日 優先權日2004年9月6日
發明者孫筱清, 束放 申請人:上海睿星基因技術有限公司