從毛蚶中分離製備一種抗腫瘤多肽化合物的方法和用途的製作方法

2023-05-13 10:33:11 2

專利名稱：從毛蚶中分離製備一種抗腫瘤多肽化合物的方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，涉及一種從海洋生物毛紺(Area subcrenataLischke)中經過一系列提取、分離、層析純化等步驟得到一個具抗腫瘤活性的多肽化合物，其內容包括分離製備方法及該化合物抗腫瘤醫藥用途。
背景技術：
毛紺(Area subcrenata Lischke)屬於軟體動物門，屬於瓣觸綱列齒目紺科,是我國資源豐富的海產生物之一。毛蚶的營養與藥用價值很高，其殼和肉皆有藥用價值，藥用歷史悠久。其貝殼為中藥瓦楞子，《神農本草經》及歷代本草均有記載，具有化痰、軟堅、止痛等功效；蚶肉是其軟體部分，在《海洋中藥》、《食療本草》、《本草拾遺》和《醫林纂要》等中藥現代和古書籍文獻中均有記載，具有補血、溫中、健胃等功效。因此，合理利用海洋資源，對毛蚶軟體部分進行深入、系統研究具有重大意義。經檢索文獻發現，在國外從毛蚶中提取活性物質的研究未見報導。而在國內對毛蚶的研究主要集中對毛蚶多糖成分的分離及其抗氧化或免疫活性方面和毛蚶水解產物活性的研究，但是對毛蚶蛋白多肽類物質的研究則很少，如:中國專利申請號98110478.9公開了 「一種能抗癌的海洋生物提取物」技術，所用的方法過於簡單，得到的物質複雜而且無法進行定量，無法對其進行藥物的開發與利用；而中國專利申請號2005100043797.4公開了 「一種毛蚶抗癌肽類提取物及其製備方法」和200610043222.7公開了一種「從毛蚶中提取小分子活性多肽的方法」，這兩個專利主要針對於分子量3000Da以下的小分子多肽活性複合組分進行了研究；此外，中國專利申請號200510043846.4公開了 「一種毛蚶糖肽類提取物及其製備方法」。上述專利文獻僅 描述了從毛蚶中提取活性粗蛋白、多肽類物質的過程，其提取產物是粗的複合成分，純度不高且活性物質基礎不明確。迄今為止，均未見從毛蚶中提取分離到純度高且物質基礎明確的抗腫瘤多肽化合物及其理化性質、結構解析的研究報導。

發明內容
本發明的目的在於藉助現代提取分離純化技術，從海洋生物中提取分離蛋白多肽類活性物質，特別是提供一種來源於毛蚶的活性多肽化合物，包括製備方法、醫藥用途和結構解析等。本發明是通過如下的技術方案來實現的:將新鮮毛蚶剝殼、取出內容物、清洗、力口入緩衝液、勻漿、提取、離心、取上清液、硫酸銨分級沉澱、取沉澱透析脫鹽，採用離子交換柱層析分離，分別收集活性峰，透析脫鹽後經疏水層析柱分離，得到純度為99%、分子量為20491.0Da的抗腫瘤活性多肽化合物，並對其結構進行解析。該多肽化合物是天然提取分離的物質，具有顯著的抗腫瘤活性，體外抗腫瘤實驗表明其抑瘤率達到了 87% ;另外，由於該成分為天然提取分離所得，未經任何化學修飾；再次，該多肽化合物尚具有毒副作用低的特點。本發明涉及經過離子交換層析法和疏水層析法分離純化得到一個多肽化合物，該多肽化合物純度高、毒性低、抗腫瘤活性顯著，適用於醫藥用途。


圖1為實例I中用電噴霧電離質譜測定活性多肽化合物的相對分子量圖譜。圖2、3、4、5、6、7、8為實例I中基質輔助雷射解吸附電離串聯飛行時間質譜測定多肽化合物的部分胺基酸序列圖譜。
具體實施方式
:下面結合技術方案和圖表詳細說明本發明的具體實施例。實施例1將毛蚶剝殼，取其內容物，用低溫蒸餾水清洗三次，控幹後稱重，按照1: 3的重量比例加入提取緩衝液(pH = 8.0,0.03mol/L，磷酸鈉緩衝液)，採用高速組織搗碎機，以8000rpm間隔勻漿3min至細膩無塊狀，將勻漿液置於低頻超聲儀中超聲提取40min，使用低溫高速離心機，IOOOOrpm, 4°C，離心30min，去渣，量取上清液的體積後將其置於冰浴環境中加入70%飽和度的硫酸銨，繼續攪拌鹽析lh，高速離心除去沉澱取上清液，量取體積後加入100%飽和度的硫酸銨,再繼續攪拌鹽析Ih,離心30min(10000rpm,4°C ),收集沉澱。將沉澱用少量提取液溶解後置於3000D透析袋中透析24h以除鹽，每間隔6h更換外周蒸餾水。將透析脫鹽後的活性組分使用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進行分離，用pH為6.0-8.0的0 .03mol/L的Tris-HCl緩衝液作為初始洗脫液，通過增加氯化鈉的濃度進行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰，收集0.lmol/L氯化鈉洗脫的洗脫液，透析脫鹽後，再使用Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析柱分離。首先用1.0mol/L, pH為6.0-8.0的硫酸銨磷酸緩衝液進行洗脫，然後依次用含0.5mol/L和Omol/L的硫酸銨和pH為6.0-8.0的磷酸鈉緩衝液進行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰，收集不含硫酸銨的磷酸鈉緩衝液洗脫的洗脫液，透析脫鹽後，濃縮冷凍乾燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。用RP_HPLC(反相高效液相色譜)檢測該多肽化合物的純度為99%。採用EMS-MS(電噴霧電離質譜)測定了該多肽的分子量為20491.0Da，用MALD1-T0F/T0F-MS (基質輔助雷射解吸附電離串聯飛行時間質譜)檢測了多肽化合物的部分片段胺基酸序列。實施例2採用MTT法對整個提取分離過程進行抗腫瘤活性跟蹤篩選。將處於對數生長期的腫瘤細胞(貼壁細胞需用胰酶消化)，製成含細胞3 4X103個/ml單細胞懸液(細胞密度)，分別接種於無菌96孔培養板中，100 μ I/孔，於5% CO2,37°C培養箱中培養。細胞培養12h後，設空白對照組(加等體積RPMI1640)、陽性對照(順鉬)和給藥組，每個濃度組設3個重複孔，加入藥物，每孔總反應體積為200 μ 1，細胞置培養箱中培養48h。實驗終止前4h加人ΜΤΤ20μ l(5mg/ml)繼續培養4h，棄上清液，加入DMS0200l.! I/孔，置于振蕩儀上振蕩lOmin，用酶標儀于波長570nm處測定A57tl值。以順鉬為陽性對照，使用藥理學方法計算IC5tl值(抑制率達到50%時的藥物濃度)。以順鉬為陽性對照藥，測定此多肽化合物對人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞H印G2和人結腸癌細胞HT-29的抑制作用。實驗結果如表I所示。表1.多肽化合物的體外抗腫瘤活性測試結果漢土SD, n=3)
權利要求
1.一種毛紺(Arcasubcrenata Lischke)中抗腫瘤活性多肽化合物，其分子量為20491. ODa0該多肽化合物的胺基酸片段序列包含ISMEDVEESR、KNGMHSIDVNHDGK、HRAYffADNTYLMK, CMDLPYDVLDTGGKDR、SSDKNTDLVDLFELDMVPDR、KNNECMNMIMDVIDTNTAAR 和PYYCSLDNVHDGAGLSMEDVEEDK。
2.權利要求I的毛蚶中的抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵是將新鮮毛蚶剝殼、取出內容物清洗，加入緩衝液勻漿、提取，離心，取上清液，硫酸銨分級沉澱，取沉澱透析脫鹽，採用離子交換柱層析分離，分別收集活性峰，透析脫鹽後經疏水層析柱分離，得到了純度為99 %的活性多肽化合物。
3.根據權利要求2述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於加入的緩衝液為O. 01 O. 05mol/L, pH為6. O 9. O的磷酸鈉、磷酸鉀或Tris鹼緩衝液，力口入緩衝液的體積與毛蚶的重量比為I : I I : 3，用高速組織搗碎機進行勻漿。
4.根據權利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於採用硫酸銨分級沉澱，先使提取上清液達到70%飽和度硫酸銨，離心，取上清夜，加入硫酸銨鹽析達到100%飽和度，離心，留沉澱。
5.根據權利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於將沉澱用少量緩衝液溶解後，用透析袋透析脫鹽後，用DEAE-Sephorose Fast Flow陰離子交換層析柱分離，其洗脫初始緩衝液為PH8. OTris-HCl緩衝液，O 2. Omol/L NaCl進行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰。
6.根據權利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於收集用O. lmol/L氯化鈉洗脫的洗脫液,透析脫鹽後,用Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析柱分離，其洗脫液為O. 03mol/L, pH8. O磷酸鈉緩衝液，濃度2. O Omol/L的硫酸銨進行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰。
7.根據權利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於收集用不含硫酸銨的磷酸鈉緩衝液洗脫的洗脫液，透析脫鹽後，濃縮冷凍乾燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。
8.根據權利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離製備方法，其特徵在於得到的毛蚶多肽化合物的分子量為20491. ODa0
9.權利要求I或2所述的毛蚶中抗腫瘤多肽化合物在製備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及毛蚶(Arca subcrenata Lischke)中一種活性多肽化合物的分離製備及其醫藥用途。所述製備方法包括將毛蚶剝殼、內容物清洗，加入緩衝液勻漿，提取，離心除渣，取上清液，硫酸銨分級沉澱，透析脫鹽得到抗腫瘤活性組分。將活性組分透析脫鹽、冷凍乾燥後，進行離子交換柱層析，分別收集活性峰，再經疏水柱層析實現分離純化，就得到一個純度為99％的抗腫瘤活性多肽化合物。本發明創造性地運用現代提取分離技術從毛蚶中分離得到一個物質基礎明確、分子量為20491.0Da的活性多肽化合物。該化合物具有顯著的抗腫瘤活性，體外抗腫瘤實驗表明抑瘤率達到87％，且毒副作用小，可用於新型抗腫瘤藥物的開發和應用。
文檔編號C07K14/435GK103254302SQ201310111139
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月1日 優先權日2013年4月1日
發明者於榮敏, 陳莉莉, 朱建華, 宋麗豔 申請人:於榮敏