新穎的賴氨醯氧化酶的製作方法

2023-05-14 03:59:16

專利名稱：：新穎的賴氨醯氧化酶的製作方法
技術領域：
：本發明涉及新穎的氧化酶。
背景技術：
：賴氨醯氧化酶胺氧化酶形成了一個異質的酶家族，其催化從伯胺底物到活性醛的氧化。根據其輔因子的性質將酶分為兩組。黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是下述酶的輔因子，所述酶為單胺氧化酶A和B以及多胺氧化酶的細胞內形式(Csiszar，Progr.NuclAcResandMolBiol(2001),70，1-32)。第二組胺氧化酶含有經修飾的酪氨酸側鏈——醌用作輔因子(Wang"a/,Science(1996)273,1078-1084)。賴氨醯氧化酶(LOX)屬於該胺氧化酶亞家族。胺氧化酶催化伯胺、仲胺和叔胺成為相應醛的氧化脫氨反應，隨後將02還原為11202，如下文所示RCH2NH3++02—RCHO+NH4++H202在哺乳動物中發現的胺落入上述兩組中，黃素依賴型單胺氧化酶(MAOs)和含醌的銅胺氧化酶(CuAOs)(Duff"a/,Biochem(2003)42,15148-15157)。MAO事實上排他地存在於所有細胞類型的線粒體外膜上，並且參與伯胺、仲胺和叔胺的降解和若干神經遞質的氧化。人們相信MAO通過單電子轉移或通過協同的共價催化基質發揮作用，二者均涉及FAD輔因子(Duffe"/，Biochem(2003)42，15148-15157和其中引用的參考文獻)。含喹啉的CuAO看起來排他地涉及伯胺的氧化脫氨反應。可以根據活性位點中存在的醌輔因子的類型topa醌(TPQ)或賴氨醯酪氨醯醌(LYQ)將這些酶分為兩類。後一類酶(已知為賴氨醯氧化酶)早己知為通過催化肽基賴氨酸側鏈的決定性脫氨反應而與結締組織形成相關，所述脫氨反應起始膠原和彈性蛋白中賴氨酸殘基的交聯(Csiszar，Progr.NuclAcResandMolBiol(2001),70,1-32)。儘管尚未檢査LTQ-因子的生物合成，但是TPQ生物合成已例如使用多重捕獲的晶體結構被廣泛地研究(Duffa/，Biochem(2003)42,15148-15157)。賴氨酸殘基到TPQ的轉化僅需要脫輔基-未加工的酶(apo-u叩rocessedenzyme)、銅和分子氧。被修飾的酪氨酸存在於保守的活性位點共有序列Asn-Tyr-Asp/Glu中(Mue/a/，JBiolChem(1992)267，7979-7982)。CuAO的催化通過兵乓機制(ping-pongmechanism)進行(Wilmot"a/,Science(1999)286，1724-1728)。關鍵步驟是起始醌亞胺(quinoneimine)到醌醛亞胺(quinoaldimine)的轉化，這通過作用於廣義鹼(generalbase)的絕對保守的天冬氨酸從底物a-碳上脫去質子完成。水解引起醛產物的釋放，得到與Cu(I)-半醌平衡的Cu(n)-氨基間苯二酚，所述Cu(II)-氨基間苯二酚隨後與分子氧反應，產生11202和亞胺基醌。後者隨後被水解，釋放NHU+並將輔因子恢復為休眠狀態。含TPQ的CuAO廣泛分布於自然界中，並且已從哺乳動物、植物和微生物中純化。它們涉及許多短鏈到長鏈脂肪族單胺和二胺的氧化，包括若干芳香族胺的氧化(Duff"a/,Biochem(2003)42，15148-15157)。在微生物中，它們在利用伯胺作為氮或碳的唯一來源中具有營養學作用。高等生物中胺氧化酶的作用不清楚。針對植物和哺乳動物中的這些酶提出了若干作用，例如創傷癒合、降低毒胺濃度、細胞生長、信號轉導和粘附。已經在大範圍的動物組織和微生物中觀察到了金屬離子對金屬蛋白的誘導(Rayton&Harris,JBiolChem(1979)254,621-626)。該原則之後被Haywood和Large(BiochemJ(1981)199,187-201)使用，在含有胺作為唯一氮源的培養基上生長時幫助誘導微生物胺氧化酶的表達。它們能夠在Caw^Wa6oW'm7中誘導兩種胺氧化酶的表達。兩種胺氧化酶的存在似乎在酵母中是普遍的(Kuchar&Dooley，JInorgBiochem(2001)83,193-204)。它們純化了相應的酶並顯示其在底物特異性方面不同。所述酶被稱作甲胺氧化酶和苄胺氧化酶。隨後以相似的方式顯示酵母屍z'c/nhpwton'5也含有兩種胺氧化酶(Greene/a/,BiochemJ(1983)211，481-493)。Tur&Lerch進一步表徵了苄胺氧化酶(FEBSLetters(1988)238,74-76)。他們證明氧化酶含有醌基、銅原子並且所述酶具有廣闊的底物特異性。使用賴氨酸、模型肽、彈性蛋白和膠原作為底物時，它們顯示氧化酶具有重大的賴氨醯-氧化酶活性。根據使用/3-氨基丙腈的抑制研究，他們提出所述酶是銅賴氨醯氧化酶(E.C.1.4.3.13)。從此時起所述酶被稱作賴氨醯氧化酶。Dove""/(FEBSLetters(1996)398,231-234)顯示所述銅賴氨醯氧化酶含有TPQ作為輔因子，這使其區別於均為哺乳動物並含有LTQ作為輔因子的賴氨醯氧化酶。Kuchar&Dooley(JInorgBiochem(2001)83,193-204)將該酶克隆、測序並進一步表徵。他們能夠將細胞內酶過表達至每升10mg，使其成為被成功地過表達的第一種賴氨醯氧化酶。他們證實每個每分子存在1個銅離子並且存在TPQ輔因子。他們還將所述工作擴展至酶的底物特異性，顯示其有些類似哺乳動物氧化酶並且能夠在肽中氧化賴氨酸殘基。然而，來自屍z'c/n'apMtonJ的賴氨酸氧化酶具有與哺乳動物酶相比廣闊得多的底物特異性(Kuchar&Dooley，JInorgBiochem(2001)83，193-204)。酶顯示非常低的對其它胺氧化酶的序列同源性。與人腎二胺氧化酶具有最高的同源性(50%相似性，30%同一性)。與其它胺氧化酶的序列比較顯示僅29個殘基是絕對保守的，包括TPQ共有序列(Thr-Xxx-Xxx-Asn-Tyr-Glu/Asp-Tyr，其中Xxx是二十個天然胺基酸之任一)中的那些，和與銅原子複合的三個組氨酸。已測定了來自於五sc/zeWc/u'aco/z'(Parsons""/，Structure(1995)3,1171-1184)、P&wmsav"w附(ICumar&a/，Structure(1996)4,943-955)、^awseww/a/o/戶o—a(Lida/,Structure(1998)6,293-307)、JW/jra6ac敏g/oZnybrm^(Wilce"a/，Biochemistry(1997)36,16116-16133)和屍z'c/n.a;astonS(Duff^a/,Biochem(2003)42，15148-15157;Duff"a/,ActacrystallogrDBiolcrystallogr(2006)62,1073-1084)的五種胺氧化酶的三維結構。屍/c/^酶是唯一的賴氨醯氧化酶。它們的結構是相似的，顯示分別稱作Dl、D2、D3和D4的四種結構域。Dl-結構域僅在五co/Z酶中觀察到，但是被提出同樣存在於屍ZcA^-酶中。活性位點位於大的核心結構域D4中，較小的D3和D2結構域處於D4結構域的N-端。酶作為二聚體結晶。罕見的是在兩個D4結構域之間二聚體的內部存在大的由溶劑填充的空腔，稱作湖(lake)。每個亞基中的銅位點退回湖上，TPQ輔因子位於銅原子的遠側。長且狹窄的通道將TPQ與外部溶劑連接在一起(Duff"a/,Biochem(2003)42,15148-15157)。通向活性位點的該通道在月c/n'a酶中尤其寬闊，其中所述通道在其入口處含有酸性殘基序列Asp-Asp-Glu-Thr-Glu-Glu。認為這些殘基有助於帶電的賴氨酸氨基通過靜電相互作用進入。沿通道進一步向下變得更加疏水，促進賴氨酸基團去質子化成為中性胺形式，其可隨後在活性位點中被氧化。活性位點包含與三個組氨酸(resnr528、530和694)和與04foTPQ(resnr478)協調的銅原子。活性位點中Asp398的位置與提出的該殘基作為完全保守的催化基礎的作用一致。若干年來，來自i^/^apwto^的賴氨醯氧化酶是唯一己知的微生物賴氨醯氧化酶。然而，EP1466979描述了衍生自A^^^7/woo^e的胺氧化酶的發現，其被稱作賴氨醯氧化酶。該申請的申請人使用^w^gz7/^o^yzM的基因組篩選賴氨醯氧化酶，並且描述了對下述基因的發現，所述基因被他們表徵為與來自乃'c/n'apastor的已知基因高度同源。專利說明書未闡明什麼是被認為高度同源的。我們對來自Ac/^;7a^0n's和v4^^^7/m07zae的序列進行了序列比對，並驚人地發現僅有35%的同一性，這通常不被認為是高同源性。60%、優選地70%、更優選地80%和更高的百分比會被認為是高度同源性。另外，來自J印e/^7/z^的賴氨醯氧化酶出乎意料地在若干個重要位置上與其它賴氨醯氧化酶和胺氧化酶不同例如EP1466979中所述^p肌7^co^ae基因的經注釋的蛋白質(SEQ一IDNO:2)的164位是丙氨酸，而在所有其它所述胺氧化酶和賴氨醯氧化酶中，該位置是高度保守的脯氨酸。另外，該被注釋的蛋白質中第78位是甲硫氨酸，而在胺氧化酶中該位置處的亮氨酸是高度保守的。另外，EP1466979中所述蛋白質與哺乳動物和A'c/n'a賴氨醯氧化酶相比時在殘基109後含有2個胺基酸的額外插入。另外，EP1466979中所述蛋白質中的499位是蘇氨酸，儘管該位置在其它胺氧化酶中總是疏水殘基。蛋白質中保守的位置通常與酶的主要功能相關，並且不能在不改變酶催化活性的前體下改變它們。值得注意的是，在該具體的賴氨醯氧化酶中，這類保守殘基中若干被修飾，並且預計認為它們對酶活性有影響。通過在基因組中隨機插入基因，在^spwp7/wm'Jw/flw中克隆所述基因。申請人指出，也可以使用其它菌株例如^pergz7/M5w&er和Aspe^z'〃M0^加e代替Am'Jw/""j。驚人的是，EP1466979中描述了當賴氨醯氧化酶被過表達時可在一些轉化體的培養液中測量賴氨醯氧化酶活性，這與屬於胞內酶的屍Zc/zz'a/aWon's酶相反。顯然，來自^pe^z'〃wso^^ae的賴氨醯氧化酶是分泌型酶。通過活性測量確立酶的存在。為了表徵賴氨醯氧化酶(E.C.1.4.3.13)及其與賴氨酸氧化酶(E.C1.4.3.14)的差異，使用正確的底物是非常重要的。EP1466979(所述專利中的實施例11)中針對賴氨醯氧化酶所述的測定使用賴氨酸作為唯一的底物。該胺基酸具有兩個游離的氨基，一個在C"原子上，一個在C原子的賴氨酸側鏈中。賴氨酸氧化酶僅氧化後者，留下其它的基團未被修飾。這可以通過使用其中a-氨基通過例如乙醯化被封閉的賴氨酸底物確定。這類底物對於賴氨醯氧化酶的適當鑑定是關鍵性的，並且非常普遍地用於這類酶的表徵中(見例如Kuchar&Dooley，JInorgBiochem(2001)83，193-204)。因為這類底物未在EP1466979中使用，因此不可能從EP1466979中提供的數據中得出發現的酶活性事實上是賴氨醯氧化酶活性的結論。酶可以是賴氨酸氧化酶(E.C.1.4.3.14;L-賴氨酸氧2-氧化還原酶)而不是賴氨醯氧化酶(E.C.1.4.3.13，蛋白質-L-賴氨酸氧6-氧化還原酶)。另外，測量到的活性相當低，僅為未經轉化的菌株背景活性的數倍(EP1466979，實施例11)。為了闡明該問題，我們嘗試在^y/^gz7/iw中過表達SEQ—IDNO:2(EP1466979)的蛋白質(本申請的實施例1)。根據EP1466979，J5/7e^//^"^^對賴氨醯氧化酶而言是一種優選的表達生物。我們不能從測試的所有轉化體的培養液中分離或者以其它方式證明活性賴氨醯氧化酶。考慮到上文公開的爭論，與本申請實施例1和2中所述的實驗工作組合，EP1466979不太可能描述功能性賴氨醯氧化酶的鑑定。EP1466979也未描述純化酶的嘗試，而是用粗製發酵上清液進行活性測量，所述粗製發酵上清液可能含有多種未明確的酶活性。另外，並非EP1466979中所述的所有轉化體與未經轉化的菌株相比都顯示提高的活性。因此值得懷疑，EP1466979中所述的蛋白質序列是否的確正確並且編碼功能性賴氨醯氧化酶。因此在EP1466979的一些轉化體中測量的氧化酶活性可能不歸因於所述基因的過表達，而是由背景胺氧化酶活性的存在引起。驚人的是在對照菌株的培養基中添加了可觀量的精氨酸(EP1466979，實施例11)。已知可通過含胍的化合物例如精氨酸抑制胺氧化酶(Kuchar&Dooley,JInorgBiochem(2001)83,193-204)，並且精氨酸含有這類胍基。萬一空菌株會產生少量胺氧化酶活性，則可通過培養基中存在的精氨酸將其抑制。如果情況如此，則應當在不是良好對照的裝置(set-up)中測試空菌株，因為背景會被人工地降低。在該情況下，這會是報導的轉化體低活性的原因，所述轉化體低活性僅顯示為背景活性的數倍。該低活性可能是不存在精氨酸時觀察到的常規背景活性。上文所有內容表明賴氨醯氧化酶是已知的，但是從未在細胞外生產過賴氨醯氧化酶。屍z'c/n'fl賴氨醯氧化酶是細胞內酶，並且僅以10mg/ml的水平生產(Kuchar&Dooley,JInorgBiochem(2001)193-204)。另外，酶必須從細胞中釋放，這使得以工業規模加工酶複雜而且沒有吸引力。因為其它賴氨醯氧化酶也未被過量生產至經濟上感興趣的表達水平，所以對可以大量(克每升)生產的細胞外賴氨醯氧化酶仍然存在需要。從經濟學觀點來看，對下述改進手段存在明顯的需要，與乃'cA/a酶和所謂的^4^6^//^00^"e酶的差生產力相比，所述手段能以大量並以相對純淨的形式生產賴氨醯氧化酶。實現此的一個優選的方式是使用重組DNA技術過量生產這樣的賴氨醯氧化酶。實現此的一種尤其優選的方式是過量生產來自真菌的賴氨醯氧更優選的方式是在食物級別真菌例如^^^gz7/M中過量生產來自^^wg///^的分泌型賴氨醯氧化酶。最優選的是在食物級別真菌中過量生產分泌型賴氨醯氧化酶，其中賴氨醯氧化酶編碼基因的密碼子選擇已針對使用的食物級別表達宿主被優化。通常，為了能夠進行後一優化途徑，需要分泌型賴氨醯氧化酶的特有序列信息。更優選必須獲得賴氨醯氧化酶編碼基因的整個核苷酸序列。一旦編碼分泌型賴氨醯氧化酶的基因在優選的宿主中被轉化，則選擇的菌株可被用於發酵，並從發酵液中分離分泌型賴氨醯氧化酶。一旦可以大量並以相對純淨的形式獲得新穎的酶，則能夠以食物級別和經濟的方式生產具有改進的構造(texture)的食物蛋白質或水解產物。能夠催化共價蛋白質交聯物形成的酶是罕見的。一個例子是巰基氧化酶類蛋白質，其能夠催化蛋白質之間二硫鍵的形成。然而，這些酶的可應用性根本上是有限的，因為蛋白質中游離巰基的存在有限。特別地，食物蛋白質在加工期間(例如乾燥期間)被頻繁地施加氧化條件，這常常導致可用的巰基的氧化。然而在一些應用例如麵包中，二硫鍵形成和二硫鍵再改組(reshuffling)與適當的構造形成是高度相關的。另一類公知的交聯酶蛋白質是轉穀氨醯胺酶，其能夠通過賴氨酸和穀氨醯胺殘基催化蛋白質之間共價交聯的形成。轉穀氨醯胺酶(E.C.2.3.2.13)催化醯基轉移反應，其中肽鍵合的穀氨醯胺殘基的7-氦甲醯是醯基供體。來自6^e/toveWcz7/仏mmoZ)araewse的微生物轉穀氨醯胺酶可以商品名ActivaTG(Ajinomoto,日本)商業獲得，而且來自血的轉穀氨醯胺酶也是可商業獲得的(商品名Harimex)。轉穀氨醯胺酶已被用於催化下述蛋白質的交聯乳清蛋白、大豆蛋白、小麥蛋白、牛肉肌球蛋白、酪蛋白和從機械脫骨的家禽肉精製得到的粗製肌動球蛋白(Zhuetal,ApplMicrobiolBiotechnol(1995)44，277-282)。還描述了轉穀氨醯胺酶用於魚製品、肉替代物和備選物、(經加工的)乳酪製品、米飯、麵條、酸奶和(冷凍)乳製品中的用途。轉穀氨醯胺酶應用的例子在以下專利中描述過JP09206006(米飯)、JP09154512(麵條)、JP092060031(魚)、JP08224063(蛋白質凝膠)、JP08112071(豆腐)、JP08056597(油煎後良好的脆性)、JP07184554(冰激凌)、WO9520662A(日本牡蠣)、JP06261712(螃蟹)、EP610649(酸奶)、JP06153827(米)、WO9319610(乳)、JP02131537(乳酪)。通常目的是修飾食物構造，但是其也被用於例如提高乳酪產量。(微生物)轉穀氨醯胺酶的一個缺點是其相對高的熱穩定性，這使其在常規食物加工條件例如巴氏消毒、滅菌或超高熱處理下難以完全失活。在7(TC下，酶失活需要15分鐘，在75'C下仍然需要5分鐘(產物信息表ActivaTG，Ajinomoto)。正常的巴氏消毒時間為72'C下15-30秒，這比轉穀氨醯胺酶失活所需的時間短得多。由於食物規程，轉穀氨醯胺酶的失活是必需的。對許多食物應用而言不期望在提高的溫度下長時間加熱，因為這導致由例如麥拉德反應引起的不期望的異味(offflavor)和雜色(offcolor)形成。若干其它酶種類已被描述為可用於獲得蛋白質交聯物，包括脂氧合酶、蛋白質二硫鍵異構酶、酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白質二硫鍵還原酶和酪氨酸氧化酶。蛋白質交聯酶的底物的例子包括衍生自動物或植物來源的所有蛋白質，例如明膠、乳蛋白質例如乳清和酪蛋白、大豆蛋白、小麥蛋白、谷蛋白、玉米蛋白、豌豆蛋白和膠原。有一些專利描述了賴氨醯氧化酶的用途。JP02245166和JP04094670描述了賴氨醯氧化酶修飾魚蛋白質用於魚糊劑(fishpaste)的用途。DE1940069描述了用於活性物質的交聯的蛋白質塗層的製造，其中賴氨醯氧化酶被用於獲得蛋白質交聯。JP007825描述了蛋白質片層模型材料的製備，其中賴氨醯氧化酶被描述為交聯蛋白質的可能方式。WO200307728描述了用酶交聯的真菌蛋白質製備素食者食品，其中轉穀氨醯胺酶、蛋白質二硫鍵異構酶、巰基氧化酶、若干多苯基氧化酶、賴氨醯氧化酶、過氧化物酶和脂氧合酶被描述為可能交聯酶或真菌蛋白質。WO2004105485描述了緩釋顆粒的製備，其中提到了賴氨醯氧化酶用於蛋白質交聯的可能用途。這些例子證明和支持了賴氨醯氧化酶的工業用途。
發明內容驚人地發現5個胺基酸基序的簡單組合能夠鑑定一類新穎的具有特有特性的分泌型微生物賴氨醯氧化酶。本發明的賴氨醯氧化酶的種類是獨特的，因為它們是分泌型的，並且因為它們對肽或蛋白質中賴氨醯殘基中的氨基具有超過低分子量底物(例如苄胺和色胺)中氨基的偏好。另外，本發明提供了(1)v45/erg7'〃wsw油/fl/w、Q7/7tococc1wweq/^mims1、屍o^s/ora禾口屍RSfln.M附gra/m'"gflrw附的賴氨醯氧化酶；(2)含有以下胺基酸基序的賴氨醯氧化酶(括號中的殘基指出該點處允許的簡併，胺基酸用單字母代碼表示)I-H-D-[NS]-L-S-G-S-M-H-D陽H-V-[IL]-N陽F-K(SEQ—IDNO:l1);(3)編碼(1)或(2)的賴氨醯氧化酶的DNA序列；(4)包含(3)的DNA序列的表達載體；(5)包含(4)的表達載體的宿主細胞；和(6)鑑定新穎構造和提高產量的酶的工藝，包括針對來自(2)的基序的存在來篩選胺基酸序列。(7)製備活性蛋白質中間產物的工藝，所述中間產物可以通過加熱步驟形成蛋白質凝膠而被失活。本發明的賴氨醯氧化酶能夠催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應，隨後將02還原為H202，並被有利地用於食物、飼料或營養藥物製品或其中間產物的製備中。因此，本發明提供了一種賴氨醯氧化酶，其能夠催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應，隨後將02還原為11202，其中所述賴氨醯氧化酶(a)顯示出針對Ac-Gly-Lys-OMe的賴氨醯氧化酶活性和針對苄胺的賴氨醯氧化酶活性之間的比例至少為1.1，優選地至少為1.3，更優選地至少為1.4，其中所述活性在37X:和7.0的pH下測定；和(b)在0和6(TC之間的溫度下具有最適活性，還提供了所述賴氨醯氧化酶在食物、詞料或營養藥物製品或其中間產物的製備中的優選用途。根據另一方面，本發明提供了能夠催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應，隨後將02還原為11202的賴氨醯氧化酶，其中所述賴氨醯氧化酶包含以下的胺基酸基序(括號中的殘基指出該點處允許的簡併，胺基酸用單字母代碼表示)隱IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK，還提供了所述賴氨醯氧化酶在食物、飼料或營養藥物製品或其中間產物的製備中的優選用途。本發明的另一方面提供了具有賴氨醯氧化酶活性的多肽，所述多肽選自由以下組成的組(a)具有下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:1到4任一項的整個胺基酸序列具有至少60%的胺基酸序列同一性；(b)由下述多核苷酸編碼的多^:，所述多核苷酸在低嚴格度條件下與(i)SEQIDNO:6的核酸序列或(ii)與SEQIDNO:6的核酸序列互補的核酸序列。賴氨醯氧化酶被有利地用於製備食物或飼料或營養藥物或用於製備下述中間產物，所述中間產物用於製備食物或詞料或營養藥物。根據本發明的又一方面，提供了用於生產賴氨醯氧化酶的下述方法，所述方法包括在適合生產賴氨醯氧化酶的條件下，培養包含下述核酸構建體的宿主細胞，以及回收賴氨醯氧化酶，所述核酸構建體包含編碼賴氨醯氧化酶的多核苷酸，所述賴氨醯氧化酶包含下述胺基酸序列-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。本發明還涉及鑑定新穎的賴氨醯氧化酶的方法，包括針對下述胺基酸序列的存在篩選胺基酸序列-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。另外，本發明提供了修飾含有蛋白質或肽的食物或詞料製品的方法，所述方法包括通過將食物或詞料製品與本發明的賴氨醯氧化酶或本發明的賴氨醯氧化酶組合物接觸來修飾所述食物或飼料製品。本文中使用的胺基酸單字母代碼是本領域普遍已知的，並可見於例如Sambrook，etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)中。本發明的一個方面是使用本發明的序列時過表達分泌型賴氨醯氧化酶。另外，我們提供了可用於鑑定和選擇來自不同真菌的活性分泌型賴氨醯氧化酶的序列基序。使用該途徑，我們能夠選擇和表達來自J^e^7/M腳/orm謹的賴氨醯氧化酶。在食物工業中常規使用的巴氏消毒過程中，本發明的賴氨醯氧化酶會被失活。巴氏消毒處理可以在至少75'C的溫度下，優選地在至少8(TC的溫度下進行。在一個實施方案中，熱處理在75。C和145'C之間的溫度下進行，在一個優選的實施方案中，熱處理在75'C和12(TC之間的溫度下進行，在一個更優選的實施方案中，熱處理在75"C和10(TC之間的溫度下進行，在一個進一步更優選的實施方案中，熱處理在8(TC和9(TC之間進行。熱處理的持續時間可以是適合達到賴氨醯氧化酶失活的任何時間。在一個實施方案中，熱處理的持續時間在1秒和30分鐘之間。在一個實施方案中，熱處理在75i:到9(TC下進行5秒到30分鐘，在另一實施方案中，熱處理在8(TC到90"C之間進行2秒到30分鐘，還在又一實施方案中，熱處理在8(TC到145'C下進行1秒到20分鐘。熱處理可通過本領域已知的任何方法進行。根據本發明的另一方面，用蛋白質孵育的本發明的酶導致蛋白質凝膠構造的修飾。該修飾在新穎的兩步過程中獲得。在第一步中，用賴氨醯氧化酶處理蛋白質。在第二步中獲得交聯，其中蛋白質被加熱到至少75°C，優選地80°C。在交聯之前，蛋白質可任選地被超濾，或在不導致大量(<1%)蛋白質交聯的溫度條件下乾燥。乾燥溫度優選地低於60°C，更優選地低於50°C，最優選地低於40°C。熱處理可與用於使酶失活的熱處理一致。得到的交聯的蛋白質可被用作食物和飼料中的成分並改進其構造。根據本發明的另一方面，本發明的酶與蛋白質孵育時導致蛋白質凝膠構造的修飾。本發明還提供了用於在蛋白質或肽中製備活性醛的工藝，所述工藝包括通過賴氨醯氧化酶將蛋白質或肽氧化脫氨，並優選地濃縮和/或乾燥含有活性醛的蛋白質或肽。另外，本發明提供了製備交聯的蛋白質或肽的方法，所述方法包括處理(優選地通過加熱處理)包含活性醛的蛋白質或肽，從而交聯蛋白質或肽。根據本發明的另一方面提供了蛋白質或肽，所述蛋白質或肽包含通過蛋白質賴氨醯胺的氧化脫氨形成的活性醛，並且優選地為乾燥的形式。發明詳述"肽"或"寡肽"在本文中定義為通過肽鍵連接的至少兩個胺基酸的鏈。術語"肽"和"寡肽"被認為是同義的(如普遍所認為的)，並且每個術語可根據上下文的需要可互換使用。"多肽"在本文中被定義為由多於30個胺基酸殘基組成的鏈。根據通常的實踐，本文中所有的(寡)肽和多肽式和序列從左到右按照氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的胺基酸的單字母代碼是本領域普遍已知的，並見於例如Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)中。乳蛋白表示乳、脫脂乳、無脂乳、酪乳、酸奶、在水中溶解至期望的蛋白質濃度的乳粉、在水中溶解至期望的蛋白質濃度的酪蛋白酸鹽(任選地含有乳清蛋白)、來自K-酪蛋白的配糖巨肽(GMP)的溶液或其組合。水解產物表示通過蛋白質的水解形成的產物(或簡單地稱作蛋白質水解產物或經水解的蛋白質)，可溶於酸的水解產物是蛋白質水解產物的可溶級分，其在本文中也被描述為含可溶肽的組合物或包含可溶肽的組合物，或是蛋白質水解產物和可溶於酸的水解產物的混合物。本文使用的術語營養藥物表示在營養和藥物應用領域二者中的有用性。因此，包含本發明組合物的新穎的營養藥物組合物可用作食物和飲料的補劑，或作為藥物配製物或藥物用於腸內或腸胃外應用，其可以是固體配製物例如膠囊或片劑，或液體配製物例如溶液、懸浮液或乳劑。用於根據本發明的交聯的合適底物為蛋白質、肽、水解產物、經修飾的蛋白質或肽和具有胺功能性的其它化合物。上文所述的交聯酶在蛋白質分子之間建立共價鍵。酶轉穀氨醯胺酶直接使用穀氨醯胺和賴氨酸殘基催化鍵形成。轉穀氨醯胺酶作用的效果通常是立即可見的，例如顯示為粘度的提高或改進的緊緻度(改進的構造)，(見例如TechnicalinformationbyAjinomoto:ActivaWM，Dasenzymmitbiss;ThoughtTNOnewletter,TNOResearchInstitute,Netherlands,No25,October1998，page3)，並且不需要進一步加工步驟來獲得交聯。例如使用巰基氧化酶或產過氧化氫酶的其它酶交聯策略也導致蛋白質交聯而不需要進一步的加工步驟。同樣也對賴氨醯氧化酶也進行了說明，所述賴氨醯氧化酶通過對蛋白質中賴氨酸殘基的作用而產生了活性醛功能，這些被修飾的蛋白質的應用描述於例如EP0988859中。在該專利申請中，描述了賴氨醯氧化酶用於獲得蛋白質交聯的用途。作者明確地指出，經修飾的蛋白質應當在低於8(TC，優選地低於6(TC的溫度下處理。顯然，熱處理不必須獲得蛋白質連接。在相似條件下與非交聯的蛋白質相比，交聯的蛋白質的溶液通常顯示提高的粘度和提高的水結合能力。當交聯的蛋白質在從成分供應商運輸給用戶如食物加工商之前需要被進一步加工時，這是一個缺點。因為含交聯蛋白質的溶液的高粘度，交聯的蛋白質更難以處理並且更難以加工(例如過濾)；處理交聯的蛋白質時其它加工步驟例如乾燥也變得更加困難和昂貴。與未交聯的蛋白質相比，交聯的蛋白質的乾燥過程耗費更多能量，因為其具有更好的水結合能力。會感興趣的是能夠從起始蛋白質底物製備活性蛋白質中間產物，所述起始蛋白質底物在需要時在所述應用中容易交聯。這會預防在成分製造商處形成粘稠並與水高度結合的製劑，從而預防過量的操作成本和處理。活性蛋白質中間產物需要起始蛋白質底物的修飾(功能化)。在本專利申請中我們顯示，用本申請中的賴氨醯氧化酶修飾的蛋白質驚人地具有這類活性蛋白質中間產物的特徵。蛋白質例如用賴氨醯氧化酶修飾的乳清蛋白和酪蛋白不顯示提高的粘度。隨後加熱功能化的蛋白質時，活性蛋白質中間產物形成蛋白質交聯物，導致提高的蛋白質溶液粘度和提高的構造。如上所述，文獻中己描述了若干種賴氨醯氧化酶。它們中大部分來自於哺乳動物來源，並且由於其較差的溶解度特徵而未以高水平被過表達(Kuchar&Dooley,JInorgBiochem(2001)83,193-204)。另外，來自屍zc/napaeon's的賴氨醯氧化酶表達較差(IOmg/L,Kuchar&Dooley,JInorgBiochem(2001)83,193-204)，並且該酶也是細胞內生產的。EP1466979描述了一種所謂的賴氨醯氧化酶，但是我們在上文中已經爭辯了我們為何相信這不是賴氨醯氧化酶。另外，我們在實施例1中證明EP1466979中所述賴氨醯氧化酶(所述專利中的SEQ一IDNO:2)的克隆和表達不導致賴氨醯氧化酶活性的產生。我們己驚人地發現，含有胺基酸序列基序SEQ—IDNO:ll的多肽編碼活性真菌賴氨醯氧化酶，所述酶從細胞中分泌至培養基中。我們提供了這類賴氨醯氧化酶的四個例子。賴氨醯氧化酶ZGR的序列得自J^^;^7/"5(SEQJDNO1和6分別編碼編碼該蛋白質的胺基酸序列和合成基因)；賴氨醯氧化酶ZGT得自Co^tococctw"eo/oma似(SEQ—IDNO2和7分別編碼編碼該蛋白質的胺基酸序列和合成基因)；賴氨醯氧化酶GLOl得自屍twflWMmgram/"e"ram(SEQ—IDNO3和8分別編碼編碼該蛋白質的胺基酸序列和基因組DNA序列)；賴氨醯氧化酶ZGY得自戶odospora(SEQ一IDNO4和9分別編碼編碼該蛋白質的安吉縣序列和合成基因)。驚人的是，也生產了與這四種蛋白質高度同源但不含有SEQ一IDNO:ll的胺基酸序列基序的多肽，但是所述多肽未顯示期望的酶活性，這與含有SEQJDNO:ll的胺基酸序列基序的四種蛋白質相反。所述胺氧化酶GL02得自i^sanY/mgram/wean/m(SEQ—IDNO5和10分別編碼編碼該蛋白質的胺基酸序列和基因組DNA序列)。使用胺基酸序列基序SEQ一IDNO:ll鑑定的四種賴氨醯氧化酶對賴氨酸底物具有更高的偏好，缺乏SEQ一IDNO:ll的賴氨醯氧化酶具有較不優選的活性譜。顯然，用胺基酸基序SEQJDNO:ll搜索特異地鑑定了對賴氨酸底物具有更優選的活性的賴氨醯氧化酶，因此在對有用的賴氨醯氧化酶的鑑定中是重要的新穎工具。當疊加在屍/c/n'a/^to^賴氨醯氧化酶的已知蛋白質結構上時，基序SEQ_IDNO:l1位於賴氨醯氧化酶的活性中心(Duffetal.(2003)Biochemistry42，15148-15157)。該基序中的兩個組氨酸對應於屍/c/n.apwton's賴氨醯氧化酶蛋白質的H528和H530。這兩個組氨酸涉及該酶活性位點處銅原子的結合。非常容易想像，該胺基酸基序中的差異導致接近或處於酶活性中心處的改變，並因此對酶的活性或底物特異性具有影響。我們認為，本領域技術人員使用該基序能夠鑑定適用於食物和詞料應用中的活性真菌賴氨醯氧化酶。工業應用上對本發明的酶氧化肽中賴氨醯殘基的能力感興趣。進一步更有利地，本發明的酶能夠氧化蛋白質中的賴氨醯殘基。因此，與低分子量底物如游離賴氨酸或苄胺相比，對蛋白質和肽中的賴氨醯殘基具有高度偏好的賴氨醯氧化酶在工業中是優選的。該底物偏好性是選擇賴氨醯氧化酶用於工業用途的一個重要的優點和參數。我們在本發明中顯示，使用正確的序列時，事實上可能過表達具有合適的底物特異性的分泌型賴氨醯氧化酶。另外，我們提供了可被用於鑑定和選擇來自不同真菌的活性分泌型賴氨醯氧化酶的序列基序。使用該途徑，我們育巨夠選擇禾卩表達來自J5^ergz7/wswViw/aws、Fw犯n'i/mgra/w'"earw附、屍odosporaam^hwa禾tlQy_ptococcws打eq/brmcms的賴氨醯氧化酶。賴氨醯氧化酶催化蛋白質中賴氨醯基的氧化脫氨反應R廣(CH2)4-NH2+02—R廣(CH2)3-CHO+H202+NH3。在該反應中，Rt是賴氨酸殘基所處的蛋白質鏈。活性醛可以與第二賴氨酸殘基的游離氨基反應R廣(CH2)3-CHO+R2-(CH2)4-NH2—R廣(CH2)rNH-(CH2)4-R2+H20。藉此在兩個蛋白質分子之間形成共價鍵。代替與第二賴氨酸殘基的反應，活性醛也可以與除了來自蛋白質賴氨酸殘基的氨基以外的可用氨基反應形成共價鍵。蛋白質的交聯在食物構造的修飾中特別有用。食物是消費者讚賞的具有複雜結構和構造的多組分材料。現代食物技術的一個主要任務是從有限範圍的具有可接受的口味和構造特徵的成分產生新改造的結構(Dickinson,TrendsFoodScitechnol(1997)8,334-339)。蛋白質是食物技師可用於賦予半固體構造屬性的主要構建塊類別，並且蛋白質分子交聯和聚集成為三維網絡(凝膠)是用於開發具有期望機械特性的結構的最重要的機制之一。在許多傳統的食物構建中，主要基於蛋白質凝膠的是乳酪、酸乳、香腸、豆腐(大豆凝乳)和魚肉糜(surimi)(魚肉凝膠)。若干種相互作用在凝膠形成中起作用，例如疏水力、靜電相互作用、氫鍵和共價相互作用。後者在凝膠網絡中導致永久的交聯。食物凝膠的粘彈性(visco-elastic)和斷裂特性以及消費者因此感受的構造取決於凝膠穩定力(包括共價相互作用)之間的平衡。因為賴氨醯氧化酶可被用於形成分子間共價鍵，因此它們適用於修飾食物構造。我們發現與蛋白質一起孵育時，酶導致蛋白質凝膠構造的修飾。另外，對下述蛋白質交聯酶存在工業需要，所述酶在食品工業中常規使用的巴氏消毒期間被失活。我們顯示本發明的賴氨醯氧化酶滿足了熱不穩定性的標準。具有賴氨醯氧化酶活性的本發明的多肽可以是經分離的形式。如本文所定義的，經分離的多肽是內源生產的或重組的多肽，其基本不含其它非賴氨醯氧化酶的多肽，並且通過SDS-PAGE測定為典型地至少約20%純淨，優選地至少約40%純淨，更優選地至少約60%純淨，進一步更優選地至少約80%純淨，仍然更優選地約90%純淨，最優選地約95%純淨。可以通過離心和色譜方法，或本領域已知的用於從粗製溶液中獲得純淨蛋白質的任何其它技術分離多肽。應當理解，多肽可以與不影響多肽預期目的的運載體或稀釋劑混合，進而這種形式的多肽仍然會被認為是經分離的。製劑中通常會包含多肽，其中按蛋白質重量計多於20%，例如多於30%、40%、50%、80%、90%、95%或99%是本發明的多肽。優選地，本發明的多肽可得自具有下述基因的微生物，所述基因編碼具有賴氨醯氧化酶活性的酶。更優選地，本發明的多肽由所述微生物分泌。進一步更優選地，所述微生物是真菌，最好是絲狀真菌。因此優選的供體微生物是Fi/san'wm屬例如FMsan'Mmgramz.wearwm禾中，JwergH/tw屬例如^4^erg7'〃Mi1mV/w/這樣經修飾的多肽會保留其賴氨醯氧化酶活性。本發明的多肽包括上述全長多肽或其變體的片段，包括SEQ一IDNO:1中公開的序列的片段。這類片段典型地會保留作為賴氨醯氧化酶的活性。片段可以是至少50、100或200個胺基酸長，或可以是SEQ—IDNO:1中所示全長序列的該胺基酸數量的片段。如果必須的話，可以通過合成手段生產本發明的多肽，儘管通常會如下文所述重組製造本發明的多肽。可以如下修飾合成的多肽例如通過添加組氨酸殘基或T7標籤來幫助其鑑定或純化，或通過添加信號序列以促進其從細胞的分泌。因此，變體序列可包括下述序列，所述序列衍生自除從中分離了SEQ—IDNO:1多肽的菌株之外的A;^gz7/^菌株。可通過尋找賴氨醯氧化酶活性並如本文所述克隆和測序，鑑定來自其它X印erg!7/Ms菌株的變體。變體可在蛋白質序列中包含單個胺基酸或胺基酸組的缺失、修飾或添加，製藥肽保留SEQ一IDNO:1的賴氨醯氧化酶的基本生物功能性即可。可製造胺基酸取代，例如從l、2個或3個到10、20或30個取代。經修飾的多肽通常會保留作為賴氨醯氧化酶的活性。可製造保守取代；這類取代是本領域公知的。更短的多肽序列在本發明的範圍內。例如，長度至少50個胺基酸或至多100、150、200、300、400、500、600、700或800個胺基酸的肽被認為落入本發明的範圍內，只要其顯示SEQ一IDNO:1的賴氨醯氧化酶的生物學功能性即可。具體而非排他性地，本發明的這一方面包括其中蛋白質是完整蛋白質序列的片段的情況。本發明還涉及編碼具有賴氨醯氧化酶活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)編碼胺基酸SEQJDNO:l的多核苷酸序列，和(b)編碼胺基酸SEQJDNO:2的多核苷酸序列，和(c)編碼胺基酸SEQ—IDNO:3的多核苷酸序列，和(d)編碼胺基酸SEQJDNO:4的多核苷酸序列。對本發明而言，含有SEQ—IDNO:ll的賴氨醯氧化酶共有序列的多肽屬於本發明。對本發明而言，特別相關的是感興趣的蛋白質被有效分泌進培養基中。分泌型蛋白質通常最初作為前-蛋白質被合成，所述前-序列(信號序列)隨後在分泌過程期間被去除。分泌過程在原核生物和真核生物中基本是相似的被活性分泌的前-蛋白質穿過膜，信號序列被特異的信號肽酶去除，並且成熟的蛋白質被(再)-摺疊。還可識別針對信號序列的一般結構。用於分泌的信號序列位於前-蛋白質的氨基端，並且長度一般為15-30個胺基酸。氨基端優選地含有帶正電的胺基酸，並優選地不含有酸性胺基酸。認為帶正電的該區域與膜磷脂的帶負電的首基(headgroup)相互作用。該區域之後是疏水的、跨膜的核心區。該區域通常長度為10-20個胺基酸，並主要由疏水胺基酸組成。帶電的胺基酸通常不存在於該區域中。跨膜區之後是信號肽酶的識別位點。識別位點由對小-X-小具有偏好的胺基酸組成。小胺基酸可以是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或半胱氨酸。X可以是任何胺基酸。使用這類規則寫出了下述算法，所述算法能夠識別來自真核生物和原核生物的這類信號序列(Bendtsen，Nielsen,vonHeijneandBrunak.(2004)J.Mol.Biol.,340:783-795)。計算和識別蛋白質中信號序列的SignalP算法是普遍可獲得的qi加:〃www.c'bs.dfa.dk/services/SignalP/)。與本發明相關的是可從被測序基因演繹的蛋白質序列中識別信號序列。如果基因編碼使用SignalP程序預測其中有信號序列的蛋白質，則該蛋白質是分泌型的可能性較高。優選地，本發明的目的因此是提供下述新方法，所述新方法使用SEQJDNO:11的共有基序與通過SignalP程序檢測的信號序列的存在相結合，來尋找具有賴氨醯氧化酶活性的新穎蛋白質。在第二個實施方案中，本發明提供了具有賴氨醯氧化酶活性並由下述多核苷酸編碼的經分離的多肽，所述多核苷酸在低嚴格度條件下，更優選地在中嚴格度條件下，最優選地在高嚴格度條件下能夠與(i)SEQ_IDN0:6的核酸序列或(ii)包含至少一部分SEQJDNO:6的核酸片段，或(iii)具有與SEQJDNO:6鹼基不同的鹼基的核酸片段雜交；或(iv)與SEQ—IDNO:6互補的核酸鏈雜交。術語"能夠雜交"表示本發明的耙多核苷酸能夠與用作探針的核酸(例如，SEQ—IDNO:6中公開的核苷酸序列或其片段，或SEQ—IDNO:6的互補體或其片段)以顯著高於背景的水平雜交。本發明還包括編碼本發明賴氨醯氧化酶的多核苷酸，以及與其互補的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因組DNA、合成的DNA或cDNA。優選地，核苷酸序列是DNA，最優選地是合成的DNA序列。典型地，本發明的多核苷酸包含連續的核苷酸序列，所述連續的核苷酸序列能夠在選擇性條件下與SEQ—IDNO:6的編碼序列或編碼序列的互補體雜交。這類核苷酸可根據本領域公知的方法合成。本發明的多核苷酸能夠與SEQ_IDNO:6的編碼序列或編碼序列的互補體在顯著高於背景的水平上雜交。背景雜交可例如由於cDNA文庫中存在其它cDNA而發生。通過本發明的多核苷酸與SEQ一IDNO:6的編碼序列或編碼序列的互補體之間相互作用產生的信號水平強度典型地是其它多核苷酸與SEQ一IDNO:6編碼序列之間的相互作用的至少10倍，優選地至少20倍，更優選地至少50倍，進一步更優選地至少100倍。相互作用強度例如可以通過放射性標記探針來測量，例如用32P標記。選擇性雜交典型地可使用低嚴格度(0.3M氯化鈉和O.(BM檸檬酸鈉，約40。C下)、中嚴格度(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，約50。C下)或高嚴格度(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，約60。C下)條件實現。本發明的多核苷酸還包括可編碼SEQJDNO:1、SEQ一IDNO:2、SEQ—IDNO:3或SEQ—IDNO:4多肽或其變體的合成基因。有時優選使基因的密碼子選擇適應生產宿主中優選的偏好。設計和構建合成基因的技術是一般可獲f導的(即http:〃www.dnatwopointo.com/)。修飾本發明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈的。它們也可以是下述多核苷酸，其中包含合成的或經修飾的核苷酸，包括肽核酸。本領域已知對多核苷酸的大量不同類型的修飾。這些包括甲基磷酸酯和硫代硫酸酯主鏈，和在分子的3'和/或5'端加成吖啶或多聚賴氨酸鏈。就本發明的目的而言，應當理解可以通過本領域中可獲得的任何方法修飾本文所述的多核苷酸。應當理解，技術人員使用常規技術可製造不影響本發明多核苷酸編碼的多肽序列的核苷酸取代，從而反映要表達本發明多肽的任何具體宿主的密碼子選擇。可通過核苷酸取代，例如從l、2或3個到10、25,50、IOO或更多的取代修飾SEQ一IDN0:6的編碼序列。可通過一個或多個插入和/或缺失和/或通過在一端或兩端延伸，可選或額外地修飾SEQ一IDNO:6的多核苷酸。經修飾的多核苷酸通常編碼具有賴氨醯氧化酶活性的多肽。可製造簡併取代和/或可製造在經修飾的序列被翻譯後導致保守的胺基酸取代的取代，例如在下文中關於多肽所描述的。同源物能夠與SEQJDNO:6的DNA編碼序列的互補體選擇性雜交的核苷酸序列包括在本發明內，並且通常會在至少60,優選地至少100，更優選地至少200個連續核苷酸或最優選地在SEQ—IDNO:6全長的區域上，與SEQ—IDNO:6的編碼序列具有至少50%或60%,至少70%，至少80%，至少90%,至少95%，至少98%或至少99%的序列同一性。同樣，本發明也包括下述核苷酸，所述核苷酸編碼活性賴氨醯氧化酶，並且能夠與SEQ一IDNO:6的DNA編碼序列的互補體片段選擇性雜交。可使用上述同一性程度和最小尺寸的任何組合鑑定本發明的多核苷酸，優選更嚴格的組合(即在更長長度上的更高同一性)。因此，例如在60個，優選地在100個核苷酸上至少80%或90%相同的多核苷酸形成本發明的一個方面，正如同在200個核苷酸上至少90%相同的多核苷酸。可使用BLASTP和BLASTN算法計算序列同一性或比對序列(例如鑑定等同或相應的序列，例如使用其默認設定)。公眾可通過國家生物技術信息中心Oittp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得用於進行BLAST分析的軟體。該算法涉及通過鑑定查詢序列中長度為W的下述短詞來首先鑑定高評分的序列對(HSP)，所述短詞與資料庫序列中相同長度的詞比對時匹配或滿足一些正值的閾值評分T。T表示相鄰詞評分閾值(neighborhoodwordscorethreshold)。這些最初的相鄰詞擊中(hit)發揮種子的作用，起始搜索以尋找含有它們的HSP。詞擊中在兩個方向上沿著每條序列延伸，直至能夠提高累積的比對評分。下述情況下停止每個方向上的詞擊中延伸累積比對評分比達到的最大值減少數量X;由於一個或多個負分殘基比對的積累，累積評分達到零或以下；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。來自DNA-DNA比較的BLASTN程序使用11的詞長(W)、10的預期(E)和兩條鏈的比較作為默認值。用於蛋白質-蛋白質比較的BLASTP程序使用3的詞長(W)、BLOSUM62評分矩陣、11的缺口存在罰分和1的缺口延伸罰分，和IO的預期(E)作為默認值。BLAST算法在兩條序列之間進行相似性的統計學分析。BLAST算法提供的一種相似性度量是最小概率和(P(N))，其提供了兩條核苷酸或胺基酸序列之間隨機發生匹配的概率的指徵。例如，如果在第一序列與第二序列的比較中，最小概率和小於約1、優選地小於約0.1，更優選地小於約0.01，最優選地小於約0.001，則序列被認為與另一序列相似。引物和探針本發明的多核苷酸包括並可被用作引物，例如作為聚合酶鏈式反應(PCR)的引物，作為可選的擴增反應的引物，或作為用揭示性標籤標記的探針(例如通過常規手段使用放射性或非放射性標籤)，或多核苷酸可以被克隆進載體中。這類引物、探針和其它片段長度應至少為15，例如至少20、25、30或40個核苷酸。它們長度通常會多達40、50、60、70、100、150、200或300個核苷酸，或甚至多達比SEQ一IDNO:6的編碼序列短數個核苷酸(例如5或10個核苷酸)。通常，引物會通過合成手段生產，所述合成手段涉及一次一個核苷酸分步製造期望的核酸序列。完成所述製造的技術和方案是本領域可容易獲得的。更長的多核苷酸通常使用重組手段生產，例如使用PCR克隆技術生產。這會涉及:製造用於擴增要克隆的賴氨醯氧化酶目的區域的一對引物(典型地約15-30個核苷酸)，使引物與得自酵母、細菌、植物、原核細胞或真菌細胞，優選地得自J5^rgz7/w5菌株的mRNA、cDNA或基因組DNA接觸，在適合擴增目的區域的條件下進行聚合酶鏈式反應，分離被擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)，並回收被擴增的DNA。引物可被設計為含有合適的限制性酶識別位點，從而可以將被擴增的DNA克隆進合適的克隆載體中。或者可構建合成的基因，所述合成的基因包含分泌型賴氨醯氧化酶或其變體的編碼區。可使用這些技術便利的設計和構建在許多位置上被改變但是仍然編碼相同蛋白質的多核苷酸。這具有下述優點密碼子選擇可適應優選的表達宿主，從而可改進蛋白質在所述宿主中的生產力。還可改變基因的多核苷酸序列，從而促進mRNA穩定性或降低周轉。這可導致目的蛋白質或其變體的改進的表達。另外，可在合成基因中改變多核苷酸序列，從而在蛋白質序列中製造下述突變，所述突變對分泌效率、穩定性、蛋白質分解易損性、溫度最適度、比活性或蛋白質工業生產和應用相關的其它特性具有積極影響。提供構建合成基因和優化密碼子選擇的服務的公司是普遍可獲得的。這類技術可被用於獲得所有或部分編碼本文所述賴氨醯氧化酶序列的多核苷酸。內含子、啟動子和尾區屬於本發明的範圍，並且也可以從來自真菌、酵母、細菌、植物或原核細胞的基因組DNA開始，以相似的方式(例如通過重組手段、PCR或克隆技術)獲得。多核苷酸或引物可帶有揭示性標籤。合適的標籤包括放射性同位素例如np或"s、螢光標籤、酶標籤或其它蛋白質標籤例如生物素。這類標籤可以被添加至本發明的多核苷酸或引物，並可使用本領域技術人員已知的技術檢測。帶有標籤或不帶有標籤的多核苷酸或引物(或其片段)可在基於核酸的測試中被用於檢測或測序真菌樣品中的賴氨醯氧化酶或其變體。這類檢測測試通常將包括，在雜交條件下使懷疑含有感興趣的DNA的真菌樣品與包含本發明多核苷酸或引物的探針接觸，並檢測探針與樣品中核酸之間形成的任何雙鏈體。可使用例如PCR的技術，或通過將探針固定在固體支持物上，去除樣品中未與探針雜交的任何核酸，然後檢測與探針雜交的任何核酸來達成檢測。或者，可將樣品核酸固定在固體支持物上，使探針雜交，並在去除任何未結合的探針後檢測與這類支持物結合的探針量。本發明的探針可以以測試試劑盒的形式被便利地包裝於合適的容器中。在這類試劑盒中，探針可與固體支持物結合，其中該設計該試劑盒的測定模式需要這類結合。試劑盒也可含有對要進行探針檢測的樣品進行處理的合適試劑，將探針與樣品中核酸雜交的合適試劑，對照試劑，說明書等等。本發明的探針和多核苷酸也可以用於微量測定中。優選地，本發明的多核苷酸可得自與多肽相同的生物，例如真菌，尤其是^p^g77/ws屬的真菌。多核苷酸的生產也可以通過大量方式獲得與SEQ—IDNO:6不具有100%同一性但是落入本發明範圍內的多核苷酸。因此，可例如通過對從多種生物製備的基因組DNA文庫進行探針標記，獲得本文所述的賴氨醯氧化酶序列的變體，所述生物例如作為本發明多肽來源被討論的那些。另外，可獲得賴氨醯氧化酶的其它真菌、植物或原核生物同源物，並且這類同源物及其片段通常會能夠與SEQJDNO:6雜交。這類序列可如下獲得在低、中到高嚴格度(如前文所述)條件下，用探針檢測來自其它物種的cDNA文庫或基因組DNA文庫，並用包括SEQ—IDNO:6全部或部分的探針檢測這類文庫。包含SEQ—IDNO:6全部或部分的核酸探針可被用於探針檢測來自其它物種的cDNA或基因組文庫，所述物種例如作為本發明多肽的來源所描述的那些。也可以使用簡併PCR獲得物種同源物，所述簡併PCR使用被設計為靶向變體和同源物中編碼保守胺基酸序列的序列。引物可含有一個或多個同源物的一種優選的方式是設計下述引物，所述引物耙向編碼SEQ—IDNO:ll中所述共有序列的序列。或者，可通過賴氨醯氧化酶序列或其變體的定點誘變獲得這類多核苷酸。當例如針對要表達多核苷酸序列的具體宿主細胞優化密碼子偏好需要對序列進行沉默密碼子改變時，這可以是有用的。可進行其它序列改變，從而引入限制性酶識別位點，或者改變多核苷酸編碼的多肽的特性或功能。本發明包括包含本發明多核苷酸及其互補體的雙鏈多核苷酸。本發明還提供了編碼上述本發明多肽的多核苷酸。因為這類多核苷酸會適合用作重組生產本發明多肽的序列，因此它們不必須能夠與SEQ一IDNO:6的序列雜交，儘管這會是通常所期望的。另外，如果需要，則可以如上文所述標記、使用和製造這類多核苷酸。重組的多核苷酸本發明還提供了包含本發明多核苷酸的載體，包括克隆和表達載體，並在另一方面中提供了例如在本發明的多肽或本發明序列編碼的多肽發生表達的條件下，將這類載體噴陽、轉化或轉染進合適宿主細胞中的方法。還提供了包含本發明多核苷酸或載體的宿主細胞，其中所述多核苷酸對於宿主細胞的基因組而言是異源的。術語"異源的"(通常關於宿主細胞)表示多核苷酸不天然存在於宿主細胞的基因組中，或多肽不天然地由該細胞生產。優選地，宿主細胞是酵母細胞，例如《/M_yveram7cas、屍/c/n'a、/7a"se"w/fl或Sflcc/iflram_yces屬的酵母或絲狀真菌細胞，例如A^"g〃/us、Zh'c/zofifenna或屍wsan'w附屬。載體插入本發明表達盒的載體可以是可便利地進行重組DNA步驟的任何載體，載體的選擇通常會取決於要引入所述載體的宿主細胞。因此，載體可以是自主複製的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒，或者，載體可以是下述載體，其被引入宿主細胞中時被整合進宿主細胞基因組中，並與整合它的染色體一起複製。優選地，當本發明的多核苷酸在載體中時，其與能夠提供宿主細胞對編碼序列的表達的調節序列有效連接，即所述載體是表達載體。術語"有效連接的"是指一種並置(juxtaposition)，其中所述組分處於允許它們以期望的方式發揮作用的關係中。與編碼序列"有效連接"的調節序列例如啟動子、增強子或其它表達調節信號以下述方式放置，所述方式使得在生產條件下達成編碼序列的表達。例如在質粒、粘粒、病毒或噬菌體載體的情況下，可提供下述載體，所述載體帶有複製起點，任選地帶有用於表達多核苷酸的啟動子和任選地帶有啟動子的增強子和/或調節子。可存在終止子序列，例如可以是多聚腺苷酸化序列。載體可含有一種或多種可選擇標記物基因，例如在細菌質粒的情況下為氨苄西林抗性基因，或對哺乳動物載體而言為新黴素抗性基因。載體可體外使用，例如用於生產RNA，或可被用於轉染或轉化宿主細胞。編碼多肽的DNA序列優選地作為表達構建體的部分被引入合適的宿主細胞中，其中所述DNA序列與表達信號有效連接，所述表達信號能夠指導DNA序列在宿主細胞中的表達。為了用表達構建體轉化合適的宿主，可獲得本領域技術人員公知的轉化步驟。表達構建體可作為帶有選擇性標記物的載體的部分被用於轉化宿主細胞，或表達構建體作為獨立的分子與帶有可選擇標記物的載體一起被共轉化。載體可含有一種或多種可選擇的標記物基因。優選的可選擇標記物包括但不限於補充宿主細胞中缺陷或賦予藥物抗性的那些。它們包括例如能夠被用於轉化大部分絲狀真菌和酵母的通用標記物基因，例如乙醯胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或來自v4.mVfe/朋s、Aoo^m或A"/ger的cDNA)，或對抗生素提供抗性例如G418、潮黴素、博來黴素、卡那黴素、腐草黴素或苯菌靈抗性(benA)的基因。或者，可使用特異的選擇標記物，例如需要相應突變體宿主菌株的營養缺陷型標記物例如URA3(來自S.cwe^^或來自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA(來自J.wzViw/a/w或j.w^ger)、argB(來自j.m'dw/aws或A"/ger)或trpC。在一個優選的實施方案中，在引入表達構建體後從經轉化的宿主細胞中刪除選擇標記物從而獲得下述經轉化的宿主細胞，所述經轉化的宿主細胞能夠生產不含選擇標記物基因的多肽。其它標記物包括ATP合成酶亞基9(oliC)、乳清苷-5，-磷酸-脫羧酶(pvrA)、細菌G418抗性基因(適用於酵母，但是不適用於絲狀真菌)、氨苄西林抗性基因(Eco/z')、新黴素抗性基因(萬""7/^)和編碼葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的Eco/ZuidA基因。載體可體外使用，例如用於生產RNA或轉染或轉化宿主細胞。對大部分絲狀真菌和酵母而言，表達構建體優選地被整合進宿主細胞的基因組中，從而獲得穩定的轉化體。然而，對某些酵母而言，也可獲得合適的附加型載體，可將表達構建體整合進所述附加型載體中得到穩定和高水平的表達。其例子包括分別衍生自SaccAaraw;;c"和^:/^veromj;c^的2pm、CEN和pKDl質粒，或含有AMA序列的載體(例如來自^^e/^7/w的AMA1)。當表達構建體被整合進宿主細胞基因組中時，構建體被整合進基因組中的隨機基因座上，或者使用同源重組整合進預定的耙基因座上，在這種情況下靶基因座優選地包含高表達基因。高表達基因是例如在誘導的條件下其mRNA可佔總細胞mRNA至少0.01%(w/w)的基因，或者是其基因產物可佔總細胞蛋白質至少0.2%(w/w)的基因，或者在分泌型基因產物的情況下，可以被分泌至至少0.05g/1的水平。針對給定的宿主細胞的表達構建體通常會含有以下元件，所述元件以相對於編碼第一方面多肽的序列的編碼鏈而言從5'-端到3'-端的連續順序彼此有效連接(l)能夠指導編碼多核苷酸的DNA序列在給定的宿主細胞中轉錄的啟動子序列，(2)優選地，5'-非翻譯區(前導區)，(3)任選地，能夠指導多肽從給定的宿主細胞分泌進入培養基中的信號序列，(4)編碼多肽成熟形式，優選地編碼多肽活性形式的DNA序列，和優選地還含有(5)能夠在編碼多肽的DNA序列下遊終止轉錄的轉錄終止區(終止子)。在編碼多肽的DNA序列下遊，表達構建體優選地含有3'非翻譯區，所述3'非翻譯區含有一個或多個轉錄終止位點，也稱作終止子。終止子的來源較不重要。終止子可例如對於編碼多肽的DNA序列而言是固有的。然而，優選地在細菌宿主細胞中使用細菌終止子，在酵母宿主細胞中使用酵母終止子，在絲狀真菌宿主細胞中使用絲狀真菌終止子。更優選地，對其中表達編碼多肽的DNA序列的宿主細胞而言，終止子是內源的。也可以通過選擇異源調節區達成編碼本發明多肽的多核苷酸的增強的表達，所述異源調節區例如啟動子、信號序列和終止子區，其發揮提高表達的作用，並且需要時提高感興趣的蛋白質從選定的宿主細胞分泌的水平，和/或提供對本發明多肽表達的誘導型控制。除了對編碼本發明多肽的基因而言固有的啟動子之外，可使用其它啟動子指導本發明多肽的表達。可針對啟動子指導本發明多肽在期望的表達宿主中表達的效率選擇啟動子。可選擇啟動子/增強子和其它表達調節信號，使其與設計表達載體的宿主細胞相容。例如可使用原核啟動子，尤其是適用於五.co/z'菌株中的那些。在哺乳動物細胞中進行本發明多肽的表達時，可使用哺乳動物啟動子。也可以使用組織特異型啟動子，例如肝細胞特異型啟動子。也可使用病毒啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒長末端重複(MMLVLTR)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子、單純皰疹病毒啟動子或腺病毒啟動子。合適的酵母啟動子包括S.cerev&aeGAL4禾口ADH啟動子禾口51.pom6enmtl和adh啟動子。哺乳動物啟動子包括可響應重金屬例如鎘而被誘導的金屬硫蛋白啟動子。也可使用病毒啟動子例如SV40大T抗原啟動子或腺病毒啟動子。所有這些啟動子是本領域可容易獲得的。可使用哺乳動物啟動子例如/3-肌動蛋白啟動子。組織特異型啟動子，尤其是內皮或神經元細胞特異型啟動子(例如DDAHI和DDAHII)是特別優選的。也可使用病毒啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒長末端重複(MMLVLTR)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子、腺病毒、HSV啟動子(例如HSVIE啟動子)、或HPV啟動子，尤其是HPV上遊調節區(URR)。病毒啟動子是本領域容易獲得的。可使用能夠在本發明的宿主細胞中指導轉錄的多種啟動子。優選地，啟動子序列來自於先前定義的高表達基因。優選的高表達基因(啟動子優選地來源於其中和/或其包含在用於整合表達構建體的優選的預定靶基因座中)的例子包括但不限於，編碼糖酵解酶例如磷酸丙糖異構酶(TPI)、磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH)的基因，以及編碼澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、/3-葡萄糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白質的基因。合適的高表達基因的特異例子包括例如來自《/^yveram少c^物種的LAC4基因，分別來自//a朋e"w/a和屍/c/n'fl的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX),來自Am'gw禾卩Aawamon'的葡糖澱粉酶(glaA)基因，爿.oo^aeTAKA-澱粉酶基因，AmV/w/<msgpdA基因和7Vease/纖維二糖水解酶基因。優選地用於真菌表達宿主中的強組成型和/或誘導型啟動子的例子是可得自以下真菌基因的那些木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶亞基9(oliC)、磷酸丙糖異構酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、澱粉酶(amy)、澱粉葡萄糖苷酶(AG-來自glaA基因)、乙醯胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子。可使用的強酵母啟動子的例子包括可得自以下的那些醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯激酶、質膜ATPase(PMA1)和磷酸丙糖異構酶。可使用的強細菌啟動子的例子包括澱粉酶和SPo2啟動子，以及來自細胞外蛋白酶基因的啟動子。可使用的適用於植物細胞的啟動子包括烏頭鹼合酶(nos)、章魚鹼合酶(ocs)、甘露鹼合酶(mas)、核酮糖小亞基(rubiscossu)、組蛋白、水稻肌動蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)35S和19S和環病毒啟動子。在得到RNA的多核苷酸側翼，載體可進一步包含下述序列，所述序列包括與來自真核基因組序列、優選地來自真菌基因組序列或酵母基因組序列的序列同源的序列。這會允許通過同源重組將本發明的多核苷酸引入地，可使用下述質粒載體製備適用於將本發明多核苷酸遞送至真菌細胞的載體，所述質粒載體包含側翼為真菌序列的表達盒。使用這些真菌載體的轉化技術是本領域技術人員已知的。載體可含有朝向反義方向的本發明的多核苷酸，以提供反義RNA的生產。需要時，這可被用於降低多肽的表達水平。宿主細胞和表達在又一方面，本發明提供了製備本發明多肽的方法，所述方法包括在適合表達編碼多肽的編碼序列的載體的條件下，培養用上文所述的表達載體轉化或轉染的宿主細胞，並回收被表達的多肽。本發明的多核苷酸可被引入重組的可複製載體例如表達載體中。載體可被用於在相容的宿主細胞中複製核酸。因此在又一實施方案中，本發明提供了如下製造本發明多核苷酸的方法將本發明的多核苷酸引入可複製載體中，將所述載體引入相容的宿主細胞中，並在引起載體複製的條件下培養所述宿主細胞。合適的宿主細胞包括細菌例如五.C0/"酵母，哺乳動物細胞系和其它真核細胞系，例如昆蟲細胞例如Sf9細胞和(例如絲狀)真菌細胞。優選地，多肽作為分泌型蛋白質被生產，在這種情況下，表達構建體中編碼成熟形式多肽的DNA序列可與編碼信號序列的DNA序列有效連接。在編碼分泌型蛋白質的基因在野生型菌株中帶有信號序列的情況下，優選地使用的信號序列對編碼多肽的DNA序列而言應當是固有(同源)的。或者，信號序列對編碼多肽的DNA序列而言是外來(異源)的，在這種情況下信號序列對其中表達DNA序列的宿主細胞而言優選地是內源的。用於酵母宿主細胞的合適的信號序列是來自酵母MFalpha基因的信號序列。類似地，絲狀真菌宿主細胞的合適信號序列是例如衍生自絲狀真菌澱粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如glaA基因的信號序列。該信號序列可與澱粉葡萄糖苷酶(所謂的(葡糖)澱粉酶)啟動子自身組合使用，以及與其它啟動子組合使用。在本發明的上下文中也可以使用雜種信號序列。(glaA-18和24個胺基酸的版本，例如來自A/^gz7/w)、MFalpha基因(酵母，例如5"髒A,附戸s禾口尺/w戸rom戸s)或a-澱粉酶基因可如上文所述將載體轉化或轉染進合適的宿主細胞中，提供本發明多肽的表達。該過程可包括在適合表達多肽的條件下培養用如上所述的表達載體轉染的宿主細胞，並任選地回收被表達的多肽。因此本發明的又一方面提供了下述宿主細胞，所述宿主細胞用本發明的多核苷酸或載體轉化或轉染或含有本發明的多核苷酸或載體。優選地，多核苷酸由載體裝載，所述載體允許多核苷酸的複製和表達。應當選擇與所述載體相容的細胞，所述細胞可以例如是原核(例如細菌)或真核的真菌、酵母或植物細胞。本發明包括通過編碼多肽的DNA序列的重組表達，生產本發明多肽的方法。為此，本發明的DNA序列可被用於基因擴增和/或表達信號(例如啟動子、分泌信號序列)的交換，從而允許多肽在合適的同源或異源宿主細胞中的經濟生產。同源宿主細胞在本文中定義為相對於DNA序列來源的物種而言，是相同物種或是相同物種中變體的宿主細胞。合適的宿主細胞優選地是原核微生物，例如細菌，或更優選地是真核生物，例如真菌，例如酵母或絲狀真菌或植物細胞。通常，酵母細胞是超過絲狀真菌細胞而被優選的，因為它們更容易操作。然而，一些蛋白質從酵母中分泌較差，或者在一些情況下不被正確加工(例如酵母中的高糖基化)。在這些情況下，應當選擇絲狀真菌宿主生物。來自屬的細菌是非常適合用作異源宿主的，這歸因於它們將蛋白質分泌進入培養基中的能力。其它適合用作宿主的細菌是來自Sfre;tow7cas和」Pyei/omo"as屬的細菌。用於表達編碼多肽的DNA序列的——禾中優選的宿主細胞是》Sacc/flram_yceiS、^/^yveram少ces、//a/we"w/a、屍z.c/n'a、Fi^raw/a或5b/^osacc/zaraw^ca屬之一。更優選地，酵母宿主細胞選自由物禾中；S"accA"ram^yce5cerev^Vze、A7w少veramj;ces/acto(也禾爾作《—verawjceswam.朋jwvar./acto)、//iawseww/flj3o/，or屍/m、屍z'c/n'a/aston、、7fl/roiWa/z》o/少rica禾口ScA/zosflccAaramycas/cw辦e糹且成的糹且。然而，為了編碼多肽的DNA序列的表達，最優選的是絲狀真菌宿主細胞。優選的絲狀真菌宿主細胞選自由屬Aspergi7/ws、7Wc/io^rma、、Z)^jporo/n'c/mm、、Jcrewow'wwi、7Vewrc^s/on2、77^;-moayct^、Afyce/Zo//tora、<§oro^7'c/ww、77'e/av/fl禾口Tb/aromjFces組成的組。最優選地，絲狀真菌宿主細胞是物種^T7wp'〃^qyzfle、As;^^7/msq/ae或j，rg飾5:wWw/a似，或是來自v4，rg〃/wsGroup(如RaperandFennell，TheGenus爿，rg/〃iw，TheWilliams&WilkinsCompany,Baltimore,pp293-344,1965所定義)的物種。這些包括但不限於A/ergz7/wm'ger、y4印erg/〃ws歸,on.、^fj/^gi〃iAs似Z/ge艦j、A/er^7/i^ya/ow.cus、yis/erg^/wso^yzae禾口^印ergz7/MS力cwwm，以及物禾中ZWcAc^erma,erms^7'5的夷卩些。本發明範圍內優選的表達宿主的例子是真菌例如A^wgz7/M物種(尤其是EP-A-184,438和EP-A-284，60中所述的那些)禾tl7Wc/io&廠mfl物種；細菌例如Sac說w物種(尤其是EP-A-134,048禾BEP-A-253,455中所述那些)，特另1是5ac^/wsswb"fc、5ac"/wsKchewz/ormls、5acz7/wsam;;/o/z々w^cz'ews、Plsewdomowos物禾中；禾口酵母例如A7wyverawz少cey物禾中(尤其是EP-A-096,430中所述那些例如《/w"erom;;cM/acto和EP-A-301,670中所述那些)和focc/wrowycas物種，例如Sacc/wramjces根據本發明的宿主細胞包括植物細胞，因此本發明擴展至含有一個或多個本發明細胞的轉基因生物，例如植物或其部分。細胞可異源地表達本發明的多肽，或異源地含有一個或多個本發明的多核苷酸。因此轉基因(或經遺傳修飾的)植物的基因組中可插入編碼本發明多肽的序列。可使用已知技術進行植物細胞的轉化，例如使用來自Jgra6a"m^m仏me/acZe^的Ti或Ri質粒進行。因此質粒(或載體)可含有轉染植物必需的序列，並蒽醌使用Ti和/或Ri質粒的衍生物。宿主細胞可過表達多肽，用於改造過表達的技術是公知的，並可在本發明中使用。宿主因此可具有兩個或更多個拷貝的多核苷酸。或者，可進行植物部分例如葉、根或莖的直接感染。在該技術中，例如如下對要被感染的植物造成創傷用刀片切割植物、用針穿刺植物或用磨蝕劑摩擦植物。然後用v4gra6fl"er^m接種傷口。然後可在合適的培養基上培養植物或植物部分，並允許其發育成為成熟的植物。可通過已知技術實現經轉化的細胞成為經遺傳修飾的植物的再生，例如通過使用抗生素選擇經轉化的枝條，並將枝條接種在含有適當營養素、植物激素等等的培養基上來實現。宿主細胞的培養和重組生產本發明還包括被修飾為表達賴氨醯氧化酶或其變體的細胞。這類細胞包括經瞬時修飾的，或優選地經穩定修飾的高級真核細胞系，例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞，低級真核細胞，例如酵母和絲狀真菌細胞，或原核細胞例如細菌細胞。還可能在細胞系或膜上，例如在杆狀病毒表達系統中瞬時表達本發明的多肽。適合表達本發明蛋白質的這類系統也包括在本發明的範圍內。根據本發明，可通過在常規的營養發酵培養基中培養微生物表達宿主實現本發明多肽的生產，所述微生物表達宿主已用一個或多個本發明的多核苷酸轉化。可使用本領域已知的步驟培養根據本發明的重組宿主細胞。對啟動子和宿主細胞的每種組合而言，可以獲得有助於編碼多肽的DNA序列表達的培養條件。達到期望的細胞密度或多肽滴度後，停止培養並使用已知的步驟回收多肽。發酵培養基可含有已知的培養基，所述培養基含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等等)、有機氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白腖等等)和無機氮源(例如磷酸鎂、磷酸鉀、磷酸鋅、磷酸鐵等等)。任選地，可包含或隨後添加誘導劑(取決於使用的表達構建體)。對合適培養基的選擇可基於表達宿主的選擇和/或基於表達構建體的調節需求來進行。合適的培養基是本領域技術人員公知的。需要時，培養基可含有額外的組分，所述額外的組分對經轉化的表達宿主的偏好優於其它可能的汙染微生物。發酵可在0.5-30天的周期上進行。發酵可以是分批、連續或補料分批的過程，在0'C和45。C之間範圍內的合適溫度下，和例如在從2到10的pH下。優選地，發酵條件包括2(TC和37。C之間範圍內的溫度禾口/或3和9之間的pH。適當的條件通常基於表達宿主的選擇和要表達的蛋白質來選擇。發酵後，如果必須的話，可通過離心或過濾從發酵液中去除細胞。發酵停止或去除細胞後，可隨後回收本發明的多肽，並且需要時通過常規手段純化和分離。本發明的賴氨醯氧化酶可從真菌菌絲體中分離，或從培養的真菌細胞將賴氨醯氧化酶釋放進其中的培養基中分離。在一個優選的實施方案中，多肽由真菌生產，更優選地由J^wp7/^生產，最優選地由生產。修飾可化學修飾，例如翻譯後修飾本發明的多肽。例如，它們可以被糖基化(一次或多次)，或包含經修飾的胺基酸殘基。也可以通過添加幫助純化組氨酸殘基，或通過添加促進從細胞中分泌的信號序列，來修飾本發明的多肽。多肽可具有氨基端或羧基端延伸，例如胺基酸甲硫氨酸殘基，至多約20-25個殘基的小連接子肽，或簡化純化的小延伸，例如多聚組氨酸束、抗原表位或結合結構域。本發明的多肽可用揭示性標籤標記。揭示性標籤可以是允許多肽被檢測的任何合適標籤。合適的標籤包括放射性同位素例如125I、35S，酶，抗體，多核苷酸或連接子例如生物素。多肽可被修飾為包含非天然存在的胺基酸或提高多肽的穩定性。當通過合成手段生產蛋白質或多肽時，可在生產期間引入這類胺基酸。蛋白質37或肽也可以在合成或重組生產後被修飾。也可以使用D-胺基酸生產本發明的多肽。在這類情況下，胺基酸應當以C到N的方向以反轉順序連接。這在生產這類蛋白質或肽的領域中是常規的。大量側鏈修飾是本領域己知的，並可對本發明的蛋白質或肽的側鏈進行所述側鏈修飾。這類修飾包括例如通過與醛反應然後用NaBH4還原的還原性烷基化修飾胺基酸，使用乙亞氨酸乙酯(methylacetimidate)的amidination或使用乙酸酐的醯化。本發明提供的序列也可被用作構建"第二代"酶的起始材料。"第二代"賴氨醯氧化酶是通過誘變技術(例如定點誘變或基因改組技術)改變的賴氨醯氧化酶，其特性與野生型賴氨醯氧化酶或例如通過本發明生產的重組賴氨醯氧化酶不同。例如，可改變它們的溫度或pH最適度、比活性、底物親和力或熱穩定性，從而更好地適用於具體的工藝。可根據本領域己知的步驟，例如定點誘變或丙胺醯掃描誘變，鑑定下述胺基酸，所述胺基酸對本發明賴氨醯氧化酶的活性是重要的，並因此優選地進行取代。在後一技術中，在分子中的每個殘基上引入突變，並測試得到的突變體分子的生物活性(例如賴氨醯氧化酶活性)，以鑑定對分子活性而言關鍵的胺基酸殘基。也可通過晶體結構分析測定酶-底物相互作用的位點，所述晶體結構通過例如核磁共振、結晶學或光親和標記法的技術測定。基因改組技術提供了在多核苷酸序列中引入突變的一種隨機方式。表達後，將具有最佳特性的分離物再分離、組合併再次改組，以提高遺傳多樣性。通過將該步驟重複多次，可分離編碼被快速改進的蛋白質的基因。優選地，用編碼具有相似功能的蛋白質的一個基因家族開始基因改組步驟。本發明提供的多核苷酸序列家族應當充分適用於基因改組，以改進分泌型賴氨醯氧化酶的特性。或者，可使用經典的隨機誘變技術和選擇，例如使用NTG處理的誘變或UV誘變，來改進蛋白質的特性。可直接在分離的DNA上進行誘變，或在用感興趣的DNA轉染的細胞上進行誘變。或者，可通過本領域技術人員已知的大量技術將突變引入經分離的DNA中。這些方法的例子是易錯PCR、在重複-缺陷型宿主細胞中擴增質粒DNA等等。預期使用酵母和絲狀真菌宿主細胞提供翻譯後修飾(例如蛋白酶解加工、肉豆蔻酸化(myristilation)、糖基化、截短，和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，這可能是對本發明的重組表達產物賦予最佳生物活性所需要的。製備物本發明的多肽可以是經分離的形式。應當理解，多肽可與不影響多肽預期目的的運載體或稀釋劑混合，並仍然被認為是經分離的。本發明的多肽也可以是基本純淨的形式，在這種情況下製備物中通常包含多肽，其中製備物中多於70%，例如多於80%、90%、95%、98%或99%的蛋白質是本發明的多肽。本發明的多肽可以下述形式提供，所述形式使得它們處於其天然細胞環境外。因此，它們可以是如上所述基本經分離或純化的，或者處於它們天然不存在於其中的細胞中，例如其它真菌物種、動物、植物或細菌細胞中。賴氨醯氧化酶活性的去除或恢復本發明還涉及用於生產親本細胞的突變細胞的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼多肽或其控制序列的內源胺基酸序列，這導致突變細胞生產比親本細胞更少的多肽。可通過修飾或失活細胞中賴氨醯氧化酶表達必需的核酸序列，便利地完成具有降低的賴氨醯氧化酶活性的菌株的構建。要被修飾或失活的核酸序列可以例如是編碼顯示賴氨醯氧化酶活性必需的多肽或其部分的核酸序列，或所述核酸序列可具有從核酸序列的編碼序列表達多肽所需的調節功能。這類調節或控制序列的一個例子可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響多肽表達的部分。用於可能的修飾的其它控制序列包括但不限於，前導序列、多聚腺苷酸化序列、原肽序列、信號序列和終止序列。可如下文所述來進行核酸序列的修飾或失活對細胞進行誘變，並選擇其中賴氨醯氧化酶生產能力被降低或消除的細胞。可例如通過使用合適的物理或化學誘變劑，使用合適的寡核苷酸，或對DNA序列進行PCR誘變，進行特異或隨機的誘變。另外，可通過使用這些誘變劑的任何組合進行誘變。適用於該目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲垸磺酸酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。使用這類試劑時，典型地如下進行誘變在合適的條件下，存在選擇的誘變劑時，孵育要被誘變的細胞，並選擇顯示降低的賴氨醯氧化酶活性或不表達賴氨醯氧化酶活性的細胞。可通過在編碼多肽的核酸序列或其轉錄或翻譯所需的調節元件中引入、取代或去除一個或多個核苷酸，完成本發明多肽生產的修飾或失活。例如，可插入或去除核苷酸，從而導致終止密碼子的引入、起始密碼子的去除，或開放讀碼框的改變。可通過定點誘變或PCR誘變，根據本領域已知的方法完成這類修飾或失活。儘管修飾通常體內進行，即直接在表達待修飾的核酸序列的細胞上進行，但是優選如下文所例證的體外進行所述修飾。失活或降低選擇的宿主細胞對賴氨醯氧化酶的生產的一種便利方式的例子基於基因置換(genereplacement)或基因中斷(geneinterruption)的技術。例如，在基因中斷方法中，體外誘變對應於感興趣的內源基因或基因片段的核酸序列，生產缺陷的核酸序列，所述缺陷的核酸序列隨後被轉化進宿主細胞中，產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷核酸序列代替內源基因或基因片段。優選地，缺陷基因或基因片段還編碼下述標記物，所述標記物可被用於選擇其中編碼多肽的基因被修飾或破壞的轉化體。或者，可使用與多肽編碼序列互補的核苷酸序列，通過確立的反義技術，實現編碼本發明多肽的核酸序列的修飾或失活。更特定地，可通過引入與編碼多肽的核酸序列互補的核苷酸序列，降低或消除多肽的生產。反義多核苷酸隨後會典型地在細胞中被轉錄，並且能夠與編碼賴氨醯氧化酶的mRNA雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，細胞中生產的賴氨醯氧化酶的量會被降低或消除。優選要根據本發明的方法被修飾的細胞是微生物來源，例如是適用於生產預期蛋白質產物的真菌菌株，所述預期的蛋白質產物與細胞同源或異源。本發明還涉及親本細胞的突變細胞，所述突變細胞包含編碼多肽或其控制序列的內源核酸序列的斷裂或缺失，這導致突變細胞生產比親本細胞更少的多肽。藉此得到的多肽缺陷的突變細胞尤其適合用作表達同源和減異源多肽的宿主細胞。因此，本發明還涉及用於生產同源或異源多肽的方法，包括(a)在有助於生產多肽的條件下培養突變細胞；和(b)回收所述多肽。在本發明上下文中，術語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細胞而言不是固有的多肽，其中進行修飾改變其天然序列的天然蛋白質，或由於通過重組DNA技術操作宿主細胞而在數量上改變其表達的天然蛋白質。還在又一方面，本發明提供了通過發酵下述細胞生產基本不含賴氨醯氧化酶活性的蛋白質產物的方法，所述細胞產生本發明的賴氨醯氧化酶多肽以及感興趣的蛋白質產物。所述方法包括在發酵期間或發酵完成後向發酵液中添加有效量的能夠抑制賴氨醯氧化酶活性的試劑，從發酵液中回收感興趣的產物，並任選地對回收的產物進行進一步純化。或者，培養後可對得到的培養液進行pH或溫度處理，從而大量降低賴氨醯氧化酶活性，並允許從培養液中回收產物。可對從培養液中回收的蛋白質製劑進行組合的pH或溫度處理。在真核多肽的生產中，尤其是在真菌蛋白質例如酶的生產中，對本發明的用於生產基本不含賴氨醯氧化酶的產物的方法尤其感興趣。賴氨醯氧化酶缺陷型細胞也可被用於表達食品工業或製藥學感興趣的異源蛋白質。用於鑑定基因的肽基序可使用一種肽基序鑑定編碼含該肽基序的蛋白質的基因。也可使用兩種或多種肽基序的組合而不是一種肽基序鑑定編碼含有所述肽基序的蛋白質的基因。鑑定一種或若干種編碼特異賴氨醯氧化酶的肽基序時，進而可能使用這些肽基序之一或若干的組合來鑑定編碼賴氨醯氧化酶的基因。賴氨醯氧化酶被用作如何鑑定這類基因的例子，但是所述方法是普遍適用的。一種可能是使用基序SEQ—IDNO:11的序列，使用程序例如Patscan(http:〃www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/)在經翻譯的來自DNA資料庫的DNA序列中或來自蛋白質序列資料庫的蛋白質序列中進行搜索。必需以網站上所述的特定形式輸入胺基酸序列。可進行的另一方法是使用SEQ—IDNO:11基序的序列，使用程序如http:〃mvhits.isb-sib.ch/cgi-bin/在經翻譯的來自DNA資料庫的DNA中或來自蛋白質序列資料庫的蛋白質序列中進行搜索。對該程序而言，將基序在搜索視野中輸入所謂的Prosite格中，並針對蛋白質序列或經翻譯的DNA序列中所述基序的存在搜索資料庫。該方法進一步描述於本發明的實施例1中，其使用SEQJDNO.11的胺基酸基序，並被用於鑑定編碼有用的賴氨醯氧化酶的真菌基因。可使用本領域已知的方法，隨後將使用這些方法之一鑑定的基因翻譯成蛋白質序列，並且檢查其氨基端信號序列的存在。為了檢測信號序列，可使用程序如SignalP(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。在本發明中，我們發現既含有共有序列又含有預測的信號序列的蛋白質序列可能是分泌型賴氨醯氧化酶。尋找這些組合的特性給出這類酶的工業生產而言巨大的優點。使用肽基序鑑定賴氨醯氧化酶基因的另一種可能性是用要鑑定其中賴氨醯氧化酶基因的生物的優選的密碼子選擇，以SEQ—IDNO:11基序的胺基酸序列成為核苷酸序列的回譯(back-translation)為基礎，設計寡核苷酸引物，並使用該寡核苷酸與基因文庫雜交，或者在PCR引物中與反轉錄的mRNA庫雜交。使用肽序列基序SEQ一IDNO:11，還可能在基因序列未知時分離編碼賴氨醯氧化酶的基因。在文獻中已描述了設計可用於該目的的簡併寡核苷酸引物的方法(Sambrooketal.(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress)。還描述了使用簡併寡核苷酸作為探針或引物，從生物中分離基因的方法。編碼SEQ—IDNO:11的肽基序的寡核苷酸適用於分離編碼賴氨醯氧化酶特性的基因。可通過在核苷酸未知的位置上引入肌苷(I)鹼基，來降低這類寡核苷酸的簡併性。另外，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)鹼基二者均有可能的位置可被尿嘧啶(U)代替，腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)二者均有可能的位置上僅可引入鳥嘌呤，從而降低簡併性並且僅小量影響寡核苷酸引物的特異性。另外，為了在已知其中密碼子偏好的生物中篩選編碼賴氨醯氧化酶的基因的存在，可通過在寡核苷酸的設計中考慮密碼子偏好來進一步降低寡核苷酸的簡併性。本領域技術人員會知道如何實現。另外，可獨立地合成沒有簡併性的寡核苷酸引物的所有可能組合，並在個別的篩選實驗中使用。首先，在通用載體中從感興趣的物種構建基因組、cDNA或EST文庫。用於文庫構建的合適方法描述於文獻中(Sambrooketal.(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress)。其次，在對從文庫中分離的DNA進行的PCR反應中，與一種通用的寡核苷酸一起使用上述簡併寡核苷酸，所述通用的寡核苷酸在載體中重組DNA插入物的邊界處引起反應。在文獻中已描述了只能獲得單個簡併寡核苷酸引物時用於分離目的基因的有用策略(例如Minambresetal.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.272，477-479;PCRtechnology(1989)Ed.H.A.Erlichpp.99-104,StocktonPress)。第三，對PCR擴增的片段隨後進行標記，並用作通過常規手段篩選文庫的探針。然後可將全長基因亞克隆進適用於在目的生產宿主生物中過表達賴氨醯氧化酶的表達載體中。在一種不同的途徑中，當不能從下述物種中獲得文庫時，可用不同的簡併引物或用使用單個簡併引物的3'-RACE通過PCR擴增基因的部分，所述物種是篩選是否存在編碼賴氨醯氧化酶的基因的物種。為此，RNA從感興趣的物種中分離，並用於使用單個簡併引物作為基因特異引物的3'-RACE反應中。先前已描述了使用一種簡併的寡核苷酸和一種通用引物，通過3'-RACE對未知cDNA部分的擴增(W099/38956)。使用僅來自小肽的信息分離全長基因的傳統方法是將經標記的簡併寡核苷酸與複製了文庫的濾紙雜交。文獻中已詳盡地描述了使用簡併寡核苷酸篩選基因文庫的方法，和計算或測定這些寡核苷酸的最適雜交條件的方法(Sambrooketal.(1989))。上述寡核苷酸可被用於該方法中，從不同物種中分離編碼賴氨醯氧化酶的基因。在對該方法的一種變更中，可首先構建部分基因文庫。為此，將DNA分級，之後通過與上述經標記的寡核苷酸雜交，檢測含有編碼賴氨醯氧化酶的基因的DNA片段。這些片段被分離，並用於構建富含編碼賴氨醯氧化酶的基因的部分基因文庫中。隨後可通過常規手段篩選該文庫。對這種方法而言，首先用限制性酶消化基因組DNA，之後通過凝膠電泳分離，同時cDNA可被直接分級。分離編碼賴氨醯氧化酶的基因的一種不同的方法是使用針對任何共有序列的肽獲得的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。文獻中己詳盡地描述了對小肽特異的抗體的生產方法(Harlow,EandLane，D(1988)Antibodies;alaboratoryma麵l，ISBN0-87969-314.—2)。可通過將cDNA或基因組DNA克隆進下述載體中構建表達文庫，所述載體適合在便利的宿主例如五.co/,或酵母中表達插入物。表達載體可基於噬菌體X或不基於噬菌體入。已公開了通過表達文庫生產的抗原的免疫檢測，和純化表達抗原的特異克隆的方法。使用對任何共有基序的肽特異的抗體，可能使用該方法分離編碼含有該基序的賴氨醯氧化酶的基因。實際上，考慮到本發明中所述信息時，許多不同的方法可被用於分離編碼賴氨醯氧化酶的基因。使用肽基序序列信息優於現有技術方法的優點是能夠快速並相對容易地鑑定編碼活性賴氨醯氧化酶的新穎基因。序列信息的使用表明新穎的賴氨醯氧化酶在乳酪製造或食品工業其它應用中的價值，而不需要在直接應用實驗中對所有可能的氧化酶進行費時的測試。我們會在以下的實施例中闡述本發明。我們會闡述新穎的賴氨醯氧化酶的鑑定、克隆、生產、純化和生物化學表徵。我們會進一步闡述賴氨醯氧化酶在食品製備中的用途。圖1:賴氨醯氧化酶表達載體pGBFINZGR-l、pGBFINZGT-l、pGBFINGLO-l、pGBFINZGY-1和pGBFINGLO-2的構建。在該圖中感興趣的基因被標記為Xxx，所述代碼可以被表1的任何代碼代替。圖2:SDS-PAGE圖譜，其顯示J印ergz7/^m'gw中賴氨醯氧化酶的蛋白質表達。樣品取自培養物上清液，並被點在SDS-PAGE(10%NUPAGE,Invitrogen)上。C:對照，不含被轉化的質粒的宿主菌株。M:標記物蛋白質(116、66、45、35、25、18禾B14kDa)、ZGR、ZGT、GLO-l、GLO-2和ZGY:過表達的賴氨醯氧化酶。箭頭指出過表達的蛋白質的位置。圖3:85t:下12.5%乳清溶液的粘度發展，其用賴氨醯氧化酶ZGR、ZGT或GLO-l處理或不經處理。圖4:k-酪蛋白、a-酪蛋白和/c-酪蛋白與a-酪蛋白混合物的SDS-PAGE圖譜，以及用賴氨醯氧化酶ZGR孵育後的相同圖譜。序列SEQ—IDNO1:AspergillusnidulansZGR蛋白質SEQ—IDNO2CryptococcusneoformansZGT蛋白質SEQ—IDNO3:FusariumgraminearumGLO1蛋白質SEQ—IDNO4:PodosporaanserinaZGY蛋白質SEQ—IDNO5:FusariumgraminearumGL02蛋白質SEQ_IDNO6:AspergillusnidulansZGR合成DNASEQ—IDNO7:CryptococcusneoformansZGT合成DNASEQ—IDNO8:FusariumgraminearumGLO1基因組DNASEQ—IDNO9:PodosporaanserinaZGY合成DNASEQ—IDNO10:FusariumgraminearumGL02基因組DNASEQ—IDNO11:共有基序IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK實施例實施例1在真菌基因組序列中鑑定推定的賴氨醯氧化酶編碼基因大量生產來自真菌來源的分泌型賴氨醯氧化酶是人們感興趣的，因為它們能夠被用於食品應用。目前，唯一被描述的來自絲狀真菌的分泌型賴氨醯氧化酶來自於0/7zae，並在EP1466979Al的SEQ—IDNO:2中描述。本文中我們嘗試在真菌^sperg///^m'ger中過表達該As/wgz7/w00^re酶。令人驚訝的是，在Asperg"/t打&er中過表達該序列後在培養液中未能測量到賴氨醯氧化酶活性。為了解釋這一驚人的結果，我們更詳細地檢查了EP1466979Al中所述的胺基酸序列。令人驚訝的是，推定的A^ergz7/wOAjz"e賴氨醯氧化酶的序列在一些方面中與其它賴氨醯氧化酶和銅胺氧化酶的序列在重要的位置上不同。艮卩，EP1466979Al的SEQ—IDNO:2中所述^^m7/w0/7zae基因的經注釋的的蛋白質的164位是丙氨酸，而在所有其它所述胺和賴氨醯氧化酶中，該位置高度保守地為脯氨酸。另外，該經注釋的的蛋白質是甲硫氨酸，而在胺氧化酶中，該位置上的亮氨酸是高度保守的。另外，與哺乳動物和屍/W/"賴氨醯氧化酶相比時，EP1466979Al中所述蛋白質在殘基109以後含有2個胺基酸的額外插入。EP1466979Al中所述蛋白質中的499位是蘇氨酸，而在其它胺氧化酶中，該位置始終是疏水殘基和殘基。蛋白質中保守的位置通常與酶的基本功能相關，並且不能對其作出改變但不改變酶的催化活性。因此值得懷疑，EP1466979Al中所述的蛋白質序列是否的確正確並且編碼功能性賴氨醯氧化酶。因此，在EP1466979Al中一些轉化體中測量的氧化酶活性可能不歸因於所述基因的過表達。因為過表達來自EP1466979Al的基因的途徑是不成功的，所以我們小心地檢查了賴氨醯氧化酶的胺基酸序列，並且在本文中提出了下述胺基酸序列基序，所述基序適用於鑑定來自真菌的賴氨醯氧化酶。我們提出適用於鑑定真正的真菌賴氨醯氧化酶的基序是I誦H-D-網-L-S-G-S-M-H-D誦H-V誦[IL]-N-F誦K(SEQJDNO:l1)在該基序中，每個胺基酸用標準IUPAC單字母代碼表示，其中在一個位置上可能是多個胺基酸，可能的胺基酸處於括號中。我們用基序SEQ_IDNO:ll，在http:〃mvhits.isb-sib.ch/cgi-bin/上用模式搜索選項搜索了trEMBL(經翻譯的EMBLDNA資料庫)。該程序能夠用確定的基序例如SEQ_IDNO:ll搜索經翻譯的DNA或蛋白質資料庫。為此，將所述基序在模式搜索視野中輸入所謂的Prosite格中，如上文所述，並針對蛋白質序列或經翻譯的DNA序列中所述基序的存在搜索各個資料庫。使用該方法，我們能夠鑑定來自真菌來源的6個可能的賴氨醯氧化酶，所述賴氨醯氧化酶之前未被指定為該活性並且均含有基序SEQ一IDNO:ll。編碼6個新的可能的賴氨醯氧化酶中4個的基因展示於表1中，並且來源於i4s/ergr7/wsm'cw/a"s、C^ptococciwweq/br,"5、Fw^由附gram/wea陽m禾口屍oJo5/ora。除了這4條序歹lj以夕卜，來自C，tococctwwe—r畫朋的第二基因(Q5KEB2一CRYNE)禾口來自A^t/my/joracmsM的基因(Q7S286—NEUCR)也存在基序SEQ一IDNO:ll。6條序列均來自真菌，所述真菌來自種系發生上廣泛分離的物種，來自兩個分離的門擔子菌亞門和子囊菌亞門，表示蛋白質基序在進化中是高度保守的，並且編碼生物化學上相關的胺基酸殘基。有趣的是，所有演繹出的蛋白質序列在蛋白質的氨基端含有推定的信號序列，並因此可能編碼分泌型蛋白質。為了測試序列基序是否的確適用於鑑定具有相關活性的賴氨醯氧化酶，我們克隆並過表達了編碼表1中提到的4個新蛋白質的基因。作為對照，我們還包括了來自屍usan'wmgraw/"ean/m的第二基因，其與所有4個其它的賴氨醯氧化酶具有明顯的同源性，但是缺乏所述胺基酸序列基序。使用該對照實驗，我們能夠研究所述基序的使用是否的確適用於鑑定和檢測來自真菌來源的新穎的相關賴氨醯氧化酶。表l:被表達的酶的特性列表。tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48通過DNA2.00lttp:〃www.dnatwopointo.com/)製造能夠編碼上述蛋白質的合成基因。可能合成生產任何基因序列並在克隆和表達中使用。使用下述算法設計合成的基因(SEQ—IDNO:6、7和9)，所述算法使編碼序列適應在^s;e/^//^m'gw中高表達基因的密碼子偏好(WO06/077258)。針對這一點的例外是兩個Fw^n'i^基因的序列，從中得到基因組DNA序列(SEQJDNO:8和10)。使用的基因序列編碼分別在SEQ一IDNO:1-5中提到的蛋白質。將克隆位點屍"c/和^yc/分別引入這些酶編碼序列的上遊和下遊，從而簡化克隆步驟。用Pac/和Ac/消化含有合成的推定的賴氨醯氧化酶基因的片段，分離包含編碼序列的戶ac/Z^cI片段，並使用標準分子生物學方法與pGBFIN-5中的/士cl//j;A片段交換(WO99/32617)。使用得到的表達質粒在A;^gz7^m'g"中表達不同的基因，並如表1中所述命名。克隆步驟和表達質粒的結構展示於圖1中。在合成的基因Xxx的位置，可填入表1中所述基因的代碼，得到表1中所述質粒。將感興趣的基因的編碼序列克隆到^s^^7/mw/ger的啟動子下遊，並且^sperg飾sm'^/aws的am必基因作為在As/erg飾51中選擇的標記物存在於表達質粒上。實施例2通過A.niger轉化和過表達推定的真菌賴氨醯氧化酶通過用7V"WI消化，將表達載體pGBFINZGR-l、pGBFINZGT-l、pGBFINGLO-l、pGBFINZGY-l和pGBFINGLO-2線性化，所述消化從表達載體中去除所有五.co/z'衍生的序列。使用苯酚:氯仿:異戊醇(24:23:1)萃取純化被消化的DNA，並用乙醇沉澱。使用這些載體轉化CBS513.88。^y/ergz'〃Mm'gw轉化步驟詳盡地描述於WO98/46772中。還描述了如何在含乙醯胺的瓊脂平板上選擇轉化體，和如何選擇定向的多拷貝整合體。優選地，選擇含多拷貝表達盒的A轉化體用於進一步產生樣品材料。對賴氨醯氧化酶表達載體而言，如下針對每個被轉化的質粒純化了30個Amger轉化體首先將個體轉化體塗布在選擇性培養基平板上，然後將單個菌類塗布在PDA平板上。在30'C生長1周後收集個體轉化體的孢子。將孢子冷凍儲存並用於接種液體培養基。使用含多拷貝表達盒的Aw/gw菌株，通過將所述菌株在搖瓶培養中培養產生樣品材料。培養Am'gw菌株和從培養液中分離菌絲體的一種有用的方法描述於WO98/46772中。培養基為CSM-MES(每升培養基中150g麥芽糖、60gSoytone(Difco)、15g(NH4)2S04、1gNaH2P04H20、1gMgS047H20、lgL-精氨酸、80mgTween-80、20gMESpH6.2)。在發酵的第4-8天取樣5ml，在HereauslabofiigeRF中於5000rpm下離心10分鐘，並將上清液儲存於-2(TC下直至進一步分析。圖2顯示了培養後通過上清液的SDS-PAGE(考馬斯染色)測定的蛋白質表達i普。顯然，從^s/7grgz7/wj"z*Ams、O^tococcus"eo/br畫"5、屍w5an'wwgrawZwean/附禾卩屍oAw;ora克隆的賴氨醯-氧化酶顯不極佳的過表達，說明它們被充分地表達和分泌。這是高度驚人和出乎意料的，因為與宿主^s;ef^7ZMSw&er接近得多的Xspergi//usoo^"e酶不能被過表達，儘管先前已報導(EP1466979)該經注釋的的A^ergz7^oo^e賴氨醯氧化酶能夠在異源宿主中表達。下述四種賴氨醯氧化酶基因在該宿主中被有效地表達，所述基因的所有供體生物都與^^ergz7/^m'gw更不相關。來自F船ahwwgramZ"earwm的基因GL02也有效地被表達並從J^erg/〃twra/ge廠中分泌。實施例3從Am'g^上清液中純化過表達的賴氨醯氧化酶如下對v4wwg/〃M中過表達的賴氨醯氧化酶進行更大量的培養，所述賴氨醯氧化酉每衍生自v^/ergz7/us"齒/a"s、C，tococcws"eq/b,w朋j、i^ksw7'ww禾口屍cxio^oraa似en'"a。將表達相關賴氨醯氧化酉每的經轉化的Am'ger菌株在下述培養基中培養，所述培養基每升含有麥芽糖.1120:40g;Soytone(Difco):30g;(NH4)2S04:15g，NaH2P04.H20:lg;MgS04.7H20:1，L-精氨酸:1g，Tween-80:0.08g，擰檬酸鈉70g。將pH調節至6.2。在3CTC下生長5-6天後，通過添加3.5g/1苯甲酸鈉並再延長孵育6小時殺死細胞。然後向發酵液中添加10g/1CaC12和45g/1助濾劑(DicaliteBF;Gent，比利時)。通過最初的編織物過濾，之後經過Z-2000和Z-200濾器(Pall)的過濾去除菌絲體。使用帶有10kDa膜的Amicon超濾池進行超濾，直至體積減少2-4倍。如下進行賴氨醯氧化酶的純化賴氨醯氧化酶ZGR(衍生自A,gz.腸w編麵)在Amicon超濾池中，在20mMTris.HCl(pH7.5;緩衝液Al)中將含賴氨醯氧化酶ZGR的濃縮培養上清液平衡至1.8mS/cm的電導率。隨後使用5ml/min的流速將樣品上樣在Q-Sepharose柱(5mlQ-FFHitrap,Pharmacia)上。用3倍體積(cv)緩衝液Al洗滌後，使用從緩衝液Al到Bl(Bl-緩衝液Al+lMNaCl)的20cv線性梯度洗脫賴氨醯氧化酶。通過SDS-PAGE鑑定在340mMNaCl左右洗脫的賴氨醯氧化酶，將其合併並轉移至帶有10kDa膜的Amicon濃縮池中，從而將緩衝液改變為25mM磷酸鈉(pH6.6;緩衝液A2)。然後將樣品應用在Q-Sepharose柱(5mlQ-FFHitrap，Pharmacia,5ml/min)上，在緩衝液A2中平衡。用3cv緩衝液A2洗滌後，在從緩衝液A2到緩衝液B2(B2-緩衝液A2+1MNaCl)的20cv線性梯度中洗脫賴氨醯氧化酶。將含有賴氨醯氧化酶的級分合併。通過SDS-PAGE(考馬斯染色)測定所述酶至少為95%純淨。賴氨醯氧化酶ZGT(存f生自Oyptococa^weo/brm"朋)基本如針對ZGR所述純化賴氨醯氧化酶ZGT，使用以下的改動緩衝液Al和Bl為pH7.1而不是pH7.5。賴氨醯氧化酶在第一步驟中在330mMNaCl處被洗脫，在第二柱中在470mMNaCl處被洗脫。通過SDS-PAGE(考馬斯染色)測定所述蛋白質至少為95%純淨。賴氣酷氧^七醜GLO-1(f行生自i^san'wwgnwn'weanwO。基本如針對ZGR所述純化賴氨醯氧化酶GLO-l，使用以下的改動緩衝液Al和Bl為pH7.0而不是pH7.5;緩衝液A2含有20mMTris.HCl(pH7.7)，緩衝液B2含有20mMTris.HCl(pH7.7)+1MNaCl。GLO-l在第一步中在90mMNaCl處被洗脫，在第二純化步驟中其不與柱結合併且存在於流出液中。通過SDS-PAGE(考馬斯染色)測定所述蛋白質至少為95%純淨。賴氛酷氧化酷GLO-2(t生自gramz'wefln/zw)基本如針對ZGR所述純化賴氨醯氧化酶GLO-2，使用以下的改動緩衝液Al和Bl為pH7.0而不是pH7.5;緩衝液A2含有20mmTris.HCl(pH7.9)，緩衝液B2含有20mMTris.HCl(pH7.9)+1MNaCl。GLO-2在第一純化步驟中在分別為80和200mM的兩個峰中被洗脫，表明存在一些蛋白質異質性。未對此進行進一步檢査。將兩峰合併並用於第二純化步驟中，其中所述酶分別在180和400mM的兩個級分中再次洗脫，其中大部分蛋白質(80%)在180mM處洗脫。將該級分合併並用於進一步的分析。賴氨醯氧化酶ZGY(衍生自戶odo犯oTO基本如ZGR所述純化賴氨醯氧化酶ZGY，使用以下的改動緩衝液Al含有50mM乙酸鈉(pH5.0)，緩衝液Bl含有50mM乙酸鈉(pH5.0)+1MNaCl。在第二純化步驟中，使用羥磷灰石柱(XK16/20，30ml,Pharmacia,2ml/min)。緩衝液A2含有10mM磷酸鈉(pH6.8)，緩衝液B2含有500mM磷酸鈉(pH6.8)。通過SDS-PAGE(考馬斯染色)測定所述蛋白質至少為95%純淨。使用Bradford試劑測定蛋白質濃度。實施例4賴氨醯氧化酶的活性測定賴氨醯氧化酶對胺底物的酶活性導致11202和NHs的形成。兩種反應產物均可被用於監測酶活性。賴氨醯氧化酶活性監測H，Cb的形成。使用可得自Invitrogen的AmplexRed單胺氧化酶測定試劑盒，監測賴氨醯氧化酶活性。反應根據製造商的說明進行。除非另有說明，測定溶液中的底物濃度為1mM。除非另有說明，反應在3(TC下進行，並且使用Genios微量滴定板讀數器(TECAN)按時監測反應。為了測定酶的pH最適度，使用以下的緩衝液25mM檸檬酸鈉(pH3.0,pH6.0)、25mM乙酸鈉(pH4.0,pH5.0)、25mMTris.HCl(pH7.0，pH8.0)和Tris.Glycine(pH9.0,pH10.0)。賴氨醯氧化酶活性監測NH,的形成在37'C下開放的Eppendorff管中，通過將酶在含10mMAc-Gly-Lys-OMe(得自Bachem，德國)和25mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)的溶液中輕柔搖動(500rpm)孵育4小時，測定賴氨醯氧化酶活性。用氨檢測試紙(得自Hach，德國)檢測NHs的形成。在空白實驗中，添加水代替酶溶液。墨綠色的形成是NH3存在的信號；沒有氨時得到黃色。使用以下的底物(測試溶液中10.0mM)在AmplexRed測試中測試賴氨醯氧化酶ZGR、ZGT、GL0-1、GL0-2和ZGY的賴氨醯-氧化酶活性Ac-Gly-Lys-OMe、Ac-Lys-OMe(均得自Bachem，德國)、節胺和對酪胺(Invitrogen)。在含賴氨酸底物的情況下，唯一游離的氨基是賴氨酸側鏈中的氨基，因為"-氨基被封閉。因此，對這些底物的任何活性明確地發出賴氨醯-氧化酶活性的信號。結果在下文中給出；活性表示為用顯示最大活性的底物獲得的活性的％。屍z'c/n'a酶的數據從Kuchar&Dooley(JInorgBiochem(2001)83,193-204)公開的k^/Km值計算。tableseeoriginaldocumentpage52表h賴氨醯氧化酶對若干底物的活性。酶對節胺的活性被設定為100%;其它活性被表述為該活性的％。如針對賴氨醯氧化酶所預期的，酶均對Ac-Gly-Lys-OMe顯示明顯的偏好。顯然ZGR、ZGT、GLO-l和ZGY對賴氨醯基具有驚人的高度偏好，並且當肽底物更大時活性更高(Ac-Gly-Lys-OMe與Ac-LysOMe相比)。驚人的是，它們對賴氨酸底物的偏好甚至比屍k/n'a賴氨醯氧化酶更強。其中與Ac-Gly-Lys-OMe相比，A'c/n'a衍生的賴氨醯氧化酶對苄胺具有稍微更多的活性，而ZGR、ZGT、GLO-l和ZGY對賴氨醯-底物具有明顯的偏好。另外，如Pichia酶一樣，GLO-2蛋白質對小底物如苄胺和酪胺具有明顯的偏好。令人驚訝的是，使用胺基酸序列基序鑑定的四種賴氨醯氧化酶對賴氨酸底物具有更高的偏好，缺乏基序之一的賴氨醯氧化酶具有較不優選的活性譜。顯然，使用胺基酸基序的搜索特異地鑑定對賴氨酸底物具有更優選的活性的賴氨醯氧化酶，並因此是有用的賴氨醯氧化酶鑑定中的一個重要的新工具。應當注意，使用BLASTP測定使用基序SEQ—IDNO:11發現的賴氨醯氧化酶彼此僅40-60%相同，但是顯然所有這些酶共有的是這些酶的特異性更加朝向對賴氨酸底物的更高偏好。使用BLASTP測定具有相似同源核心但是缺乏基序SEQ—IDNO:ll的酶(如GL02)以及來自屍/c/nh戶aWon;y禾B^s/7ergz'〃uso^zae的賴氨醯氧化酶不顯示該底物特異性。還使用Ac-Gly-Lys-OMe作為底物，針對氨釋放酶測試了酶ZGR、ZGT和GLO-l。在所有情況下，氨的釋放均被明確證明。這些結果進一步證實所鑑定的酶是賴氨醯氧化酶。實施例5賴氨醯氧化酶對多種蛋白質底物的活件在pH6下針對以下蛋白質底物測試賴氨醯氧化酶ZGR、ZGT和GLO-l的活性乳清(來自的BiPro)、酪蛋白(得自DMV，荷蘭)、谷蛋白水解產物(在55。C，pH4.1下用Fromase750TL(得自DSM，荷蘭)將致命谷蛋白(得自Protinax)水解1小時。通過在85"下熱處理15分鐘使酶失活，並噴霧乾燥)。為了參照的目的，在如前所述的條件下使用Ac-Gly-Lys-OMe。結果在下文中給出。多種賴氨醯氧化酶的活性被定量為形式++++(非常有活性，可與Ac-Gly-Lys-OMe相比)、+++(很有活性)、++(中度活性)、+較少活性、-無活性。tableseeoriginaldocumentpage53表2:ZGR、ZGT和GLO-l對乳清、酪蛋白和谷蛋白的活性。顯然，賴氨醯氧化酶彼此間活性不同，而且對多種蛋白質的活性也不同。乳清蛋白質最難以被賴氨醯氧化酶修飾，而酪蛋白是最易受ZGR和ZGT影響的底物。ZGR對谷蛋白也非常有活性，其中ZGT僅有中度活性。GLO-l在三種賴氨醯氧化酶中具有最少活性，其對乳清蛋白顯示沒有可檢測的活性，對酪蛋白幾乎沒有活性，對谷蛋白有少量活性。然而，結果明顯證明酶對蛋白質中賴氨酸殘基有活性，如針對賴氨醯氧化酶所預期的。如根據實施例4的結果所預期的，GLO-2對任何蛋白質底物均不顯示活性。實施例6賴氨醯氧化酶的pH和T譜的測定使用實施例4中所示緩衝液，在pH範圍3-8中測定賴氨醯氧化酶的pH譜。測定在兩步中進行。首先在固定的時間周期中在適當的pH下進行反應。然後將溶液在標準緩衝液中稀釋用於AmplexRed測定法(H202)，並測定初始速率。pH譜的記錄在3(TC下使用苄胺作為底物進行。結果在表3中給出。tableseeoriginaldocumentpage54表3.最適pH和其中賴氨醯氧化酶顯示〉80y。最大活性的pH範圍。表格顯示賴氨醯氧化酶具有不同的pH最適度，範圍從pH4到pH9。具有最廣泛pH範圍的賴氨醯氧化酶為ZGRG.5個pH單位)。這些酶的溫度最適度在其pH最適度下測定並在表3中給出。GLO-l酶顯示最高的T-最適度(50。C)。ZGR、ZGT和ZGY具有相對低的T-最適度，但是其溫度範圍與許多食品引用充分相容。ZGT的T-最適度相當低，甚至低於2(TC。實施例7證明賴氨醯氧化酶中的醌結構已知賴氨醯氧化酶在活性位點中含有醌結構。因此，我們使用以下的步驟驗證了鑑定的賴氨醯氧化酶中這類輔因子的存在。將賴氨醯氧化酶ZGR、ZGT禾卩GLO-l上樣在SDS-PAGE(10%bis-TrisNuPage,Invitrogen)上，然後Western印跡在硝酸纖維素紙上。通過用NBT(硝基-四唑藍氯化物)(2M甘氨酸鈉中0.24mM，pH10)染色印跡使醌顯影。醌結構的存在導致蛋白質所述位置上出現紫色。ZGR、ZGT和GLO-l清楚地顯示該紫色的形成。作為對照，包括內切蛋白酶(Maxiren600，得自DSM，荷蘭)和羧肽酶(AccelerzymeCPG，得自DSM，荷蘭)。已知這些酶不具有醌基，並且在用NBT染色後不顯示紫色。該實驗顯示賴氨醯氧化酶ZGR、ZGT和GLO-l含有醌結構，如針對賴氨醯氧化酶所預期的那樣。從該實驗不能推測醌的精確性質。實施例8加熱時賴氨醯氧化酶用於修飾濃縮的乳清溶液構造的用途在該方法的第一步中，將WPI(BiPro，Davisco)在MilliQ水中溶解至10.5%並在室溫下與ZGR、ZGT或GLO-l(10mg酶/25ml溶液)孵育過夜。用賴氨醯氧化酶處理未顯示蛋白質溶液粘度的任何顯著改變，表明不存在或低水平(<1%)的蛋白質交聯。在對照實驗中，添加水代替酶溶液。然後將溶液轉移至RapidVisco分析儀(RVA-4NewPortScientific,澳大利亞)的測量池中，在85'C下平衡。在該方法的第二步中，允許所述方法第一步中形成的反應性中間產物在共價鍵的形成下反應。將溶液緩慢攪拌(50rpm)並監測粘度的改變。圖5清楚地顯示在空白中未發生粘度改變，表明無凝膠形成。相反，賴氨醯氧化酶的添加導致粘度的顯著提高。這對ZGR而言是特別顯著的。用賴氨醯氧化酶處理導致凝膠形成清楚地發生，意味著在所述方法第一步中製備的反應性蛋白質底物的反應性。令人驚訝的是，甚至GLO-l也具有作用，儘管在實施例4中未觀察到該賴氨醯氧化酶對乳清蛋白的活性。實施例4中的反應僅在數分鐘內被監測，而在本實施例中，允許酶與蛋白質過夜反應。酶對乳清蛋白具有顯然低的活性，但是仍然足以影響加熱後的粘度發展，如在該實施例中所證明的。顯然，賴氨醯氧化酶能夠產生反應性蛋白質中間產物，所述中間產物可在第二步驟中通過加熱被用於修飾濃縮的乳清溶液的構造。乳清蛋白作為膨脹劑(texturizingagent)存在於許多食品中；其具有能夠用賴氨醯氧化酶修飾乳清蛋白質膨脹特性的工業利益，並且具有能夠製備反應性中間產物的特殊利益，所述中間產物可隨後被用於修飾食物構造。實施例9賴氨醯氧化酶ZGR改進米麵包體積的用途將480克米粉(BL-250，vanSillevoldt,荷蘭)和20克米蛋白質(RemyIndustries,0400061)在Hobart混合機(第一速度2分鐘，第二速度3分鐘)中與475克水、22.5克Koningsgist(Gilde，荷蘭)、10克NaCl、5克蔗糖、50克biskien(脂肪，UniPro，荷蘭)、20克黃胞膠和12ppmBakezymeP500(DSM，荷蘭)。用手使生麵團成形，首先在38°C下醒發20分鐘，最後在38。C下醒發40分鐘(均在85%相對溼度下)。在一個實驗中混合之前添加賴氨醯氧化酶ZGR(IOOppm)，在對照實驗中不添加賴氨醯氧化酶。含有賴氨醯氧化酶的生麵團被判斷為更加醒發。使用MIWECombo烤箱(Amstein，德國，閉合的閥門(closedvalve))烘焙麵包(240°C，20分鐘)。烘焙後，含有賴氨醯氧化酶的麵包在結構上更穩定並且體積更大。實施例10乳蛋白質的交聯在水中製備k-酪蛋白、a-酪蛋白和zc-酪蛋白與a-酪蛋白混合物(均0.3%w/v)的3。/。(w/v)溶液，並在37。C下與賴氨醯氧化酶ZGR(0.1mg/ml)孵育過夜。隨後將樣品在85'C下加熱(30分鐘)。製備對照樣品，其中不添加賴氨醯氧化酶ZGR。在SDS-PAGE上分析樣品(見圖4)。明顯地，賴氨醯氧化酶的添加導致下述蛋白質的形成，所述蛋白質與其中未添加賴氨醯氧化酶的對照相比具有提高的分子量。用賴氨醯氧化酶ZGR處理導致共價的蛋白質交聯，導致更高分子量的聚集物。權利要求1.下述賴氨醯氧化酶催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應隨後將O2還原為H2O2的用途，所述賴氨醯氧化酶(a)顯示出針對Ac-Gly-Lys-OMe的賴氨醯氧化酶活性和針對苄胺的賴氨醯氧化酶活性之間的比例至少為1.1，優選地至少為1.3，更優選地至少為1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下測定；和(b)在0和60℃之間的溫度下具有最適活性。2.下述多肽催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應隨後將02還原為11202的用途，所述多肽具有賴氨醯氧化酶活性並包含以下胺基酸基序(括號中的殘基指出該點處允許的簡併，胺基酸用單字母代碼表示)-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。3.根據權利要求2的多肽的用途，其中所述多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQIDNO:1到4中任一的整條胺基酸序列具有至少60%的胺基酸序列同一性。4.根據權利要求3的多肽的用途，所述多肽具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQIDNO:1到4中任一的整條胺基酸序列具有至少60%，優選地至少70%，更優選地至少80%，進一步更優選地至少90%，最優選地至少95%，進一步最優選地至少約97%的同一性。5.根據權利要求3的多肽的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1到4的胺基酸序列中的任一條。6.根據權利要求3的多肽的用途或根據權利要求1或2的賴氨醯氧化酶的用途，其中所述多肽或賴氨醯氧化酶得自真菌，優選地得自A/7e/"gz'〃tw，更優選地得自A/erg飾sm-^/"/aws、C，/ococc船7.根據權利要求3的多肽或根據權利要求1或2的賴氨醯氧化酶用於製備食物或飼料或營養藥物或用於製備下述中間產物的用途，所述中間產物用於製備食物或飼料或營養藥物。8.用於生產賴氨醯氧化酶的方法，所述方法包括在適合生產賴氨醯氧化酶的條件下培養包含下述核酸構建體的宿主細胞，以及回收賴氨醯氧化酶，所述核酸構建體包含編碼賴氨醯氧化酶的多核苷酸，所述賴氨醯氧化酶包含下述胺基酸序列-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。9.用於鑑定新的賴氨醯氧化酶的方法，包括針對下述胺基酸序列的存在篩選胺基酸序列-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。10.修飾含有蛋白質的食物或飼料製品的工藝，所述工藝包括通過將食物或詞料製品與賴氨醯氧化酶接觸來修飾所述食物或飼料製品，所述賴氨醯氧化酶選自由以下組成的組I.賴氨醯氧化酶，所述酶(a)顯示出針對Ac-Gly-Lys-OMe的賴氨醯氧化酶活性和針對苄胺的賴氨醯氧化酶活性之間的比例至少為1.1，優選地至少為1.3，更優選地至少為1.4，其中所述活性在37'C和7.0的pH下測定；和(b)在0和60'C之間的溫度下具有最適活性；和11.賴氨醯氧化酶，其包含以下的胺基酸基序(括號中的殘基指出該點處允許的簡併，胺基酸用單字母代碼表示)-IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK。II.用於在蛋白質或肽中製備活性醛的工藝，所述工藝包括通過賴氨醯氧化酶對所述蛋白質或肽的賴氨醯胺進行氧化脫氨反應，並優選地濃縮和/或乾燥含有活性醛的蛋白質或肽。12.用於製備交聯的蛋白質或肽的工藝，所述工藝包括對包含活性醛並且根據權利要求11的方法製備的蛋白質或肽加熱，從而交聯所述蛋白質。13.包含活性醛的蛋白質或肽，並優選地為其乾燥形式，所述活性醛通過所述蛋白質或肽的賴氨醯胺的氧化脫氨反應形成。14.包含根據權利要求13的蛋白質或肽的食物、飼料、營養藥物或食物、飼料或營養藥物的中間產物。全文摘要本發明涉及經分離的賴氨醯氧化酶，其能夠催化蛋白質或肽中賴氨醯基成為相應醛的氧化脫氨反應，隨後將O2還原為H2O2，其中所述賴氨醯氧化酶(a)顯示針對Ac-Gly-Lys-OMe的賴氨醯氧化酶活性和針對苄胺的賴氨醯氧化酶活性之間的比例至少為1.1，優選地至少為1.3，更優選地至少為1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下測定；和(b)在0和60℃之間的溫度下具有最適活性。文檔編號C12N9/06GK101652473SQ200880009278公開日2010年2月17日申請日期2008年3月18日優先權日2007年3月22日發明者利嘉·韋斯特拉肯,彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾,簡安娜·加蒂娜·巴克胡斯,阿伯圖斯·阿拉德·蒂克·范申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司