細胞周期蛋白g1作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用的製作方法

2023-05-13 19:43:46 2

細胞周期蛋白g1作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於電離輻射生物劑量計，具體涉及細胞周期蛋白G1(cyclin?G1，CCNG1)基因作為電離輻射生物劑量計的應用。人淋巴母細胞受到低劑量電離輻射後，以及哺乳動物輻射後外周血淋巴細胞的CCNG1基因mRNA水平表達的增加與受到的電離輻射劑量成正比，存在一定的劑量-效應關係，於照射後24h和48h採用實時螢光定量PCR法即可快速簡便地定量檢測，因此，CCNG1可作為低劑量電離輻射範圍的生物劑量計，可以採用CCNG1基因表達定量分析法對人體和哺乳動物受到低劑量電離輻射的劑量大小進行評估。
【專利說明】細胞周期蛋白G1作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用
1【技術領域】
[0001]本發明屬於低劑量電離福射生物劑量計,具體涉及細胞周期蛋白Gl (cyclin Gl,CCNG1)作為低劑量範圍電離輻射生物劑量計的應用。
2【背景技術】
[0002]低劑量電離輻射暴露的人群和機率遠比大劑量照射事件或事故大，如天然本底輻射、頻繁的飛行活動、醫學檢查、不適當的居住環境、職業照射和空間活動等。低劑量電離輻射雖不足以引起臨床可見的損傷，但對低劑量暴露人群若不及時採取監測、危害評價和防護措施，會對暴露人員帶來遠後效應的健康危害，還可能造成人員嚴重的心理損害等。作為輻射損傷救治和危害評價的重要依據，輻射劑量的準確估算對診斷和治療有重要的指導作用。目前，輻射生物劑量計的研究已有了長足的發展，但在臨床應用中仍存在耗時長、費用高、專業技術要求高等問題，且主要應用範圍為較高劑量的輻射損傷。近年來，國內外相關實驗室開展了一些新型生物劑量計的研究，也報導了適用於低劑量輻射的生物標誌物，但主要採用的是數個基因的聯合應用。迄今為止，這些研究尚處於探索階段，因此，有必要尋找新型、快速、可靠的低劑量電離輻射生物劑量指標。[0003]CCNGl是細胞周期蛋白(cyclin)家族的重要成員，定位於5號染色體q32，編碼產物為含366個胺基酸的蛋白質，其N端有一個典型的細胞周期蛋白盒，C端有一段與人表皮生長因子受體酪氨酸磷酸化位點同源的序列。CCNGl是唯一受腫瘤抑制基因p53調控的細胞周期蛋白，其啟動子內部包括2個p53的結合位點，對細胞周期進程起負調控作用，在細胞增殖、DNA修復中起作用，參與細胞DNA損傷後的G2 / M期阻滯與凋亡。CCNGl也是最早被發現為P53的靶基因之一，是p53-Mdm2網絡中的關鍵調控因子。有研究報導了 CCNGl在ATM依賴的p53調控和DNA損傷時細胞周期調節中的重要作用，認為CCNGl缺乏可增加P53的聚集，使p53在Ser-15位點磷酸化，進而導致細胞周期阻滯，而CCNGl介導的p53調控依賴於ATM(ataxia_telangiectasia mutated)蛋白的狀態，CCNGl異位表達可顯著減少受到DNA損傷時含有ATM的正常人皮膚成纖維細胞穩定態p53和Ser_15位點的p53磷酸化。Seo HR等人研究報導CCNGl通過上調細胞周期蛋白BI (cyclin BI)對抗電離輻射誘導的G2期阻滯進而增加細胞的輻射敏感性[1°]。常公民等採用3.0Gy中子照射小鼠，發現小鼠骨髓細胞CCNGl基因表達明顯上調，認為CCNGl可能是中子輻射致骨髓損傷的敏感靶基因之一。
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【發明內容】

[0004]本發明目的是提供細胞周期蛋白Gl (cyclin G1,CCNG1)作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用。
[0005]為達到上述目的，本發明採用的技術方案是:細胞周期蛋白Gl作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用。
[0006]一種檢測人或動物所受低劑量範圍輻射劑量的方法，包括如下步驟:[0007] (1)按照常規方法培養細胞，將細胞置於已知輻射強度的環境中接受輻射，照後在三個以上時間點收集輻射後細胞，定量檢測其細胞周期蛋白Gl的mRNA表達水平，獲得該細胞受到的電離輻射劑量和B細胞轉位基因2表達水平關係的標準曲線；
[0008](2)分離並收集接受了待測劑量輻射的動物外周血淋巴細胞，測定其中的細胞周期蛋白Gl的mRNA表達水平，根據步驟(1)獲得的標準曲線計算得到該動物所受到的電離福射劑量。
[0009]上述技術方案中，待測細胞可來自細胞株，如人淋巴母細胞，也可來自人或動物的組織細胞，如外周血淋巴細胞。
[0010]上述技術方案中，測定細胞中細胞周期蛋白Gl的表達水平的方法是:採用實時螢光定量PCR法測定細胞中細胞周期蛋白Gl的mRNA表達水平。
[0011]由於上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0012]由於細胞株或動物受到低劑量電離輻射後，其中CCNGl含量的增加與受到的電離輻射劑量正相關，存在一定的劑量-效應關係，且於照射後24h即可採用簡便易行、定量準確、敏感度高的方法進行快速檢測，因此，CCNGl可作為低劑量電離輻射生物劑量計，定量檢測人或動物受到低劑量電離輻射。
4【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例一中指數生長期的AHH-1細胞經不同劑量137Cs Y射線照射後CCNGl基因表達量隨時間變化圖；
[0014]圖2為實施例一中指數生長期的AHH-1細胞經不同劑量137Cs Y射線照射後24小時CCNGl基因表達量的劑量-效應曲線；
[0015]圖3為實施例一中指數生長期的AHH-1細胞經不同劑量137Cs Y射線照射後48小時CCNGl基因表達量的劑量-效應曲線；
[0016]表1為實施例二中不同劑量6tlCoy射線誘導動物外周血淋巴細胞中CCNGl基因表達變化。
5【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
[0018]實施例一:不同低劑量電離輻射人淋巴母細胞中CCNGl基因表達的劑量-效應關係
[0019]1.材料:人淋巴母細胞(AHH-1)由第二軍醫大學防原醫學教研室惠贈；TRlzolreagent 和 M-MLV 反轉錄酶為 Invitrogen 公司產品；SYBR Premix Ex Taq 為 Takara 公司
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[0020]2.細胞培養細胞培養於含10 %小牛血清，穀氨醯胺及100萬U / L青黴素和鏈黴素的RPMI1640培養基。細胞置於37°C、5% C02孵箱中培養，2~3天傳代I次，取對數生長期細胞用於輻照。
[0021]3.福照:復旦大學放射醫學研究所，Gamma cell40, 137Cs (N0RD10N InternationalInc.CANADA)，劑量率為 0.162Gy / min，劑量為 0，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0Gy。
[0022]4.Real-time PCR法測定人淋巴母細胞中CCNGl基因表達的量:[0023]4.1總RNA抽提及cDNA合成:實驗組經照射後和未照射對照組細胞置於37°C、5% C02孵箱中繼續培養他，411，2411，4811，7211，16811，隨後每組樣品取IXlO6細胞，加ImlTRIzol，裂解後提取總RNA，Nanodrop ND-1000檢測樣品RNA濃度和純度，進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反轉錄酶對抽提的人淋巴母細胞總RNA進行cDNA逆轉錄合成，逆轉錄總體積為20ul，總RNA為lug，引物為OIigo (dT) 18,具體操作依據產品說明書。
[0024]4.2引物設計:依據NCBI資料庫中的β-actin和CCNGl基因序列，用Primerpremier5軟體設計實時螢光定量PCR的相應引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0025]4.3實時螢光定量PCR:採用SYBR實時螢光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)實時螢光PCR檢測儀，按照用戶手冊操作。PCR反應程序為:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40個循環。每個樣品重複做3個平行樣，每次反應結束後進行熔解曲線分析，排除非特異性PCR產物的影響。以β-actin為內參，同時設置空白對照組。
[0026]4.4定量方法和統計分析:採用相對定量法，以看家基因β -actin為內參，採用MJOptionMonitorAnalysis Software V3.1 和 Exc el 軟體對結果進行分析。
[0027]如圖1所示，照射後24h，與未照射組比較，0.1Gy照射組CCNGl基因上調2.01倍，
0.2Gy照射組CCNGl基因上調2.35倍，0.5Gy照射組CCNGl基因上調3.16倍，0.8Gy照射組CCNGl基因上調3.51倍，1.0Gy照射組CCNGl基因上調4.32倍；照射後48h，與未照射組比較，0.1Gy照射組CCNGl基因上調1.66倍，0.2Gy照射組CCNGl基因上調2.11倍，0.5Gy照射組CCNGl基因上調2.41倍，0.8Gy照射組CCNGl基因上調2.78倍，1.0Gy照射組CCNGl基因上調3.32倍。
[0028]結果表明，低劑量電離輻射後24h，受照細胞CCNGl基因表達上調，並隨照射劑量增加而增加，與照射劑量正相關，呈現出一定的劑量-效應關係(圖2)，擬合劑量-效應曲線方程為:y=2.8205X+1.5028，R2=0.9274。隨著時間的延長，受照細胞CCNGl基因表達開始下調，在72h時已接近正常，但在48h時仍顯著高於未照射組，並與照射劑量正相關，呈現出一定的劑量-效應關係(圖3)，擬合劑量-效應曲線方程分別為:y=1.941x+1.373，R2=0.911。其中Y為CCNGl基因在mRNA水平的相對表達量，X為照射劑量(Gy)。
[0029]實施例二:不同低劑量電離輻射Balb / c小鼠外周血淋巴細胞中CCNGl基因表達的劑量-效應關係
[0030]1.材料:肝素鈉；小鼠淋巴細胞分離液為達科為生物技術有限公司產品；TRlzolreagent 和 M-MLV 反轉錄酶為 Invitrogen 公司產品；SYBR Premix Ex Taq 為 Takara 公司產品。
[0031]2.動物分組及處理:20隻雄性Balb / c小鼠，體重20 ±2g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物隨機分為4組，分別為未照射組、0.1Gy照射組、0.5Gy照射組和
1.0Gy照射組，每組5隻。各照射組在海軍醫學研究所輻照室進行照射，放射源為6°Co，單次照射，劑量率為0.5Gy / h。
[0032]3.分離淋巴細胞:於照射結束後24h，收集照射組和未照射組小鼠的抗凝血，分離淋巴細胞，具體操作依據說明書的操作步驟。
[0033]4.Real-time PCR法測定小鼠外周血淋巴細胞中CCNGl基因表達的量:[0034]4.1總RNA抽提及cDNA合成:取I X IO6細胞，加Iml TRIzol，裂解後提取總RNA，Nanodrop ND-1000檢測樣品RNA濃度和純度，進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反轉錄酶對抽提的外周血淋巴細胞總RNA進行cDNA逆轉錄合成，逆轉錄總體積為20ul，總RNA為lug，引物為OIigo (dT) 18，具體操作依據產品說明書。
[0035]4.2引物設計:依據NCBI資料庫中的β-actin和CCNGl基因序列，用Primerpremier5軟體設計實時螢光定量PCR的相應引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0036]4.3實時螢光定量PCR:採用SYBR實時螢光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)實時螢光PCR檢測儀，按照用戶手冊操作。PCR反應程序為:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40個循環。每個樣品重複做3個平行樣，每次反應結束後進行熔解曲線分析，排除非特異性PCR產物的影響。以β-actin為內參，同時設置空白對照組。
[0037]4.4定量方法和統計分析:採用相對定量法，以看家基因β -actin為內參，採用MJOptionMonitorAnalysis Software V3.1 和 Exc el 軟體對結果進行分析。
[0038]如表1所示，照射後24h，與未照射組比較，0.1Gy照射組CCNGl基因平均上調倍數為2.16，0.5Gy照射組CCNGl基因平均上調倍數為4.01，1.0Gy照射組CCNGl基因平均上調倍數為5.49 ;根據上調倍數和實施例一中照射後24h的擬合劑量-效應曲線方程:y=4.269X+1.457，計算得到各組動物受照射劑量分別為0.165Gy，0.598Gy和0.945Gy。
[0039]結果表明，小鼠在低劑量電離輻射後24h，外周血淋巴細胞中CCNGl基因表達上調，與照射劑量正相關，呈現一定的劑量-效應關係，根據劑量-效應曲線計算得到的理論受照劑量接近實際受照劑量。
[0040]表1不同劑量6tlCo Y射線照射後動物外周血淋巴細胞中CCNGl基因表達變化
照射劑量理論值(Gy) CCNGl基因表達變化倍數 ' 照射劑量實際值(Gy)
[0041]
【權利要求】
1.細胞周期蛋白Gl作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用。
2.權利要求1中細胞周期蛋白Gl作為一種快速檢測輻射劑量的生物指標，其特徵在於，一定時間範圍內細胞周期蛋白Gl基因mRNA表達量與輻射劑量相關。
3.權利要求2中所述輻照劑量特徵為低劑量電離輻射。
4.細胞周期蛋白Gl作為低劑量電離輻射生物劑量計的應用，包括如下步驟: (1)按照常規方法培養離體細胞或飼養哺乳動物，將細胞或動物置於已知輻射強度的環境中接受福射，照後在24h、48h收集福射後細胞或米集哺乳動物外周血淋巴細胞，定量檢測其細胞周期蛋白Gl的mRNA表達水平，獲得該細胞或哺乳動物受到的電離輻射劑量和細胞周期蛋白Gl表達水平關係的標準曲線； (2)收集接受了待測劑量的輻射照射的離體細胞，或將哺乳動物置於待測劑量的環境中接受輻射，照後分離外周血淋巴細胞，測定其細胞周期蛋白Gl的mRNA表達水平，根據步驟(I)獲得的標準曲線計算得到該細胞或動物所受的輻射劑量。
5.權利要求4中所述細胞周期蛋白Gl也可以聯合其他指標，共同估算輻射劑量。
6.權利要求4中所述離體細胞可以來源於細胞株，如人淋巴母細胞，也可來自離體細胞，如人或哺 乳動物的外周血淋巴細胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642904SQ201310585411
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】何穎, 沈先榮, 錢甜甜, 王慶蓉, 陳偉, 劉玉明, 蔣定文, 侯登勇, 李珂嫻, 劉瓊 申請人:中國人民解放軍海軍醫學研究所