稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記及應用的製作方法

2023-05-13 19:49:01

稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記SSIVb-m，以水稻作為物種，所述分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，SSIVb-m正向：ATTTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT，反向：AAAACATTGCTCCAAAACAGC。本發明還同時提供了上述分子標記SSIVb-m的用途，用於水稻稻米直鏈澱粉含量鑑定和/或其後代輔助選擇育種。當篩選日本晴和特青的後代時，選擇後代中帶型與日本晴帶型一致的單株用於育種。
【專利說明】稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業生物技術工程，特別涉及與稻米直鏈澱粉含量調控基因SSIVb有關的分子標記SSIVb-m及其獲得方法。
【背景技術】
[0002]高產、優質一直是水稻育種長期追求的目標。經過長期的努力，尤其是雜交稻技術的利用，我國在水稻生產上取得了舉世公認的成就。但是由於過去一直把如何解決人們的溫飽問題放在第一位，故而水稻育種工作的重點大部分集中於水稻高產新品種的培育，從而導致優質稻米的育種嚴重滯後，特別是一些高產的雜交稻品質普遍偏差。
[0003]導致稻米品質改良進展較慢的另一個主要原因是稻米品質遺傳的複雜性和傳統育種手段的局限性。稻米的品質性狀包括外觀品質、加工品質、蒸煮品質、營養品質和食味品質等諸多方面，而稻米蒸煮品質是評價稻米品質的最重要指標。蒸煮品質是指稻米在蒸煮過程中所表現出來的特性，主要由直鏈澱粉含量(Amylose Content, AC)、膠稠度(GelConsistency, GC)、糊化溫度(Gelatinization Temperature, GT)三個理化指標來評價，其中AC是影響稻米品質最主要的理化指標。育種學家和遺傳學家做了大量的工作以探尋稻米AC的遺傳學基礎，然而不同實驗室的結果有著較大的差別。早期的研究表明稻米AC是由一個主效基因控制，並受到其他微效QTL的調控[1，2]。隨後的研究發現Waxy (Wx)對於稻米AC的多少具有決定性的作用，可能就是控制AC的主效基因[3-5]。除在第6染體上檢測到I個主效QTL外，不同研究檢測到的微效QTL數目及位置很不一致。例如，Tan等在第1、2染色體上檢測到了兩個微效QTLs [6] ,He等在第5染色體檢測到了一個微效QTL[6]，Aluko等在第3和8染色體上分別檢測到了微效QTLs[7]。黃祖六等研究發現除了第6染色體的Wx基因位點外，在第3染色體也檢測到一個控制稻米AC的主效QTL ;另外5個微效QTLs分別位於第4、4、6、9、11染色體的不同座位上[8]。其他實驗室在第4、6、7染色體也檢測到了控制AC的QTLs [9]。吳長明等在第6染色體上並沒有發現與AC有關的QTL位點，只是在第I，7，8，9，12染色體上發現5個QTL位點[10]。 [0004]導致稻米品質改良進展較慢的另一個主要原因是在傳統育種手段的局限性。傳統育種方法主要是對有利目標性狀進行定向選擇和固定，培育出優良新品種，這具有很大的盲目性和不可預測性[11]。並且，個體選擇的方法是對符合育種目標的農藝性狀進行直接選擇，即選擇的是個體表現型而不是基因型。由於基因間存在一因多效、多因一效、調控基因以及修飾基因等的作用，個體的表現型與基因型往往存在較大差異，因而通過田間表型性狀進行個體選擇的準確性較差。分子標記輔助選擇(Marker-gssisted Selection, MAS)技術給水稻育種提供了新的途徑，與傳統育種技術相結合可大大提聞育種效率，縮短育種周期。MAS的核心是把常規育種中的表型選擇轉化為基因型選擇，它直接反映了 DNA的序列差異，不受基因表達的影響，結果可靠性強，並且不受植物的生長發育階段及環境條件的影響[12]ο
[0005]上文中涉及的參考文獻如下:[0006]1.Bollich C.ff., BD.1nheritance of amylose in two hybrid populations ofrice.Cereal Chem.1973，50，631_636(Bollich C.ff., BD.直鏈澱粉含量的在兩個雜交群體的遺傳，穀物化學.1973.50:631-636)；
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【發明內容】
[0018]本發明要解決的技術問題是提供一種與稻米澱粉合成基因SSIVb有關的分子標記及其開發方法和用途，本發明所得的分子標記SSIVb-m為稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記，能用於稻米直鏈澱粉含量的輔助選擇育種。
[0019]為了解決上述技術問題，本發明提供一種稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記SSIVb-m，以水稻作為物種，該分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' — 3'，
[0020]SSIVb-m 正向:ATTTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT
[0021]反向:AAAACATTGCTCCAAAACAGC。
[0022]本發明還提供了上述分子標記SSIVb-m的開發方法，包括以下步驟:
[0023]I)、以粳稻品種日本晴作為低直鏈澱粉含量基因供體親本與作為高直鏈澱粉的特青進行雜交、回交和自交，從而獲得作為後代的稻米低直鏈澱粉含量的單株；
[0024]2)、用 CTAB (十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻親本幼苗及後代幼苗基因組DNA ；
[0025]3)、採用Indel (插入/缺失片段,insertion/deletions)分子標記方法進行稻米低直鏈澱粉含量基因標記的篩選；
[0026]4)、開發出一個Indel分子標記SSIVb-m。
[0027]與稻米低直鏈澱粉含量有關的分子標記SSIVb-m，具體是用下述方法得到的:`[0028]I)、根據基因SSIVb的核苷酸序列，設計、發展Indel分子標記，用於檢測低直鏈澱粉含量日本晴和高直鏈澱粉含量特青的多態性；通過測序以進一步確定引物SSIVb-m區間的序列在低直鏈澱粉含量的日本晴和高直鏈澱粉含量的特青之間的差異；通過雜交、回交和自交結合標記輔助選擇，獲得特青背景的低直鏈澱粉含量的水稻新種質；
[0029]2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及後代幼苗基因組DNA ；
[0030]3)、採用Indel分子標記方法進行稻米低直鏈澱粉含量的基因標記篩選低直鏈澱粉含量的水稻新種質；
[0031]4)、鑑定出一個Indel分子標記SSIVb_m，經多態性檢測，發現其與稻米直鏈澱粉
含量相關聯。
[0032]本發明還同時提供了上述分子標記SSIVb-m的用途，用於水稻稻米直鏈澱粉含量鑑定和/或其後代輔助選擇育種。
[0033]作為本發明的分子標記SSIVb-m的用途的改進:當篩選日本晴和特青的後代時，選擇後代中帶型與日本晴帶型一致的單株用於後續的育種改良。
[0034]採用Indel分子標記SSIVb-m進行稻米直鏈澱粉含量篩選的方法具體是:
[0035](I)、Indel標記在高、低稻米直鏈澱粉含量品種日本晴和特青間的DNA多態性分析:
[0036]根據基因SSIVb的核苷酸序列，設計、發展Indel分子標記SSIVb-m,用於檢測低直鏈澱粉含量的日本晴和高直鏈澱粉含量的特青之間的多態性。引物委託上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為:20ng/ul水稻基因組DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mM MgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ulTaq DNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，總體系20ul。反應程序:95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個循環；72°C補齊10分鐘；產物檢測:在含有0.5% ug/ul EB的4.0%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察並照相記錄結果。
[0037](2)、Indel標記SSIVb-m的序列區間在低、高稻米直鏈澱粉含量品種日本晴和特青間的基因組序列差異:
[0038]根據獲得的Indel分子標記SSIVb-m，用於PCR擴增低直鏈澱粉含量品種日本晴和高直鏈澱粉含量品種特青的基因組序列，PCR擴增產物委託上海英駿生物技術有限公司進行測序分析。PCR擴增參照上述(I)進行，PCR產物的回收選用北京百泰克生物技術有限公司開發的PCR產物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)。
[0039](3)、利用Indel標記SSIVb-m開展低直鏈澱粉含量的輔助選擇育種
[0040]低直鏈澱粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈澱粉含量的秈稻品種特青進行雜交，通過回交、自交結合標記輔助選擇，將日本晴的低直鏈澱粉含量基因SSIVb導入到高直鏈澱粉含量的特青中，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用於育種改良，獲得了若干份特青背景的帶日本晴SSIVb基因的材料；收穫這些植株上所結的種子，檢測其直鏈澱粉含量，發現其直鏈澱粉含量顯著降低。
[0041]直鏈澱粉含量高是稻米品質低劣的最主要因素。本發明採用分子生物學方法以低直鏈澱粉含量的日本晴為材料，發展和篩選新的、而且穩定的能降低稻米直鏈澱粉含量的分子標記及其方法，用於優質稻米的輔助選擇育種；由於研究所用的材料能有效降低一般稻米的直鏈澱粉含量，其對我國稻米品質的改善具有普遍性。
[0042]本發明創造 了稻米澱粉合成相關基因SSIVb的Indel標記SSIVb-m。利用這種方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點，可以有目標地將日本晴的低直鏈澱粉含量基因SSIVb在實驗室內選擇獲得並有目的地進行多個優質的聚合，從而培育出具有優質的水稻新品種。在本發明中，當所得植株經檢測出現日本晴的條帶時，我們判定其屬於低直鏈澱粉含量的水稻；當所得植株經檢測出現特青的條帶時，我們判定其屬於高直鏈澱粉含量的水稻；當所得植株經檢測同時出現特青+日本晴的條帶時，我們判定其可能屬於高直鏈澱粉含量的水稻。
[0043]因此，本發明結果在水稻優質育種實踐中具有重要意義。其優點具體歸納如下:
[0044](I)本發明的能調控稻米直鏈澱粉含量的分子標記，是在通過低直鏈澱粉含量的粳稻日本晴與高直鏈澱粉含量的秈稻特青的雜交、回交和自交中篩選獲得的，能顯著降低稻米直鏈澱粉含量，而且穩定存在，可用於優質稻米的輔助選擇育種。
[0045](2)本發明依據的是稻米澱粉合成基因SSIVb的核苷酸序列發展而獲得的Indel分子標記，極大提高了輔助選擇的效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0047]圖1是Indel標記SSIVb-m在低直鏈澱粉含量的粳稻日本晴、高直鏈澱粉含量的秈稻特青、Fl的電泳譜帶圖；
[0048]圖2是引物SSIVb-m的PCR擴增產物在日本晴和特青間的序列差異；
[0049]圖3是Indel標記SSIVb-m鑑定獲得的8份低直鏈澱粉含量的日本晴和特青的後代的電泳譜帶圖；
[0050]圖4是標記SSIVb-m輔助選育的8份材料的直鏈澱粉含量；[0051]對上述圖1~4中符號分別作如下說明:
[0052]I代表:低直鏈澱粉含量的粳稻日本晴；
[0053]2代表:高直鏈澱粉含量的秈稻特青；
[0054]3代表:日本晴/特青的Fl植株；
[0055]4，5，6，7，8，9，10，11均代表:日本晴和特青的後代，經Indel標記SSIVbi的篩選
後獲得。
【具體實施方式】
[0056]實施例1、用Indel標記SSIVb_m鑑定低直鏈澱粉含量的粳稻日本晴和高直鏈澱粉含量的秈稻特青的多態性
[0057]具體做法是:從中國水稻研究所種質資源庫中選取水稻材料日本晴和特青，用日本晴和特青雜交獲得其Fl，`利用引物SSIVb-m鑑定其多態性(圖1)。
[0058]一、提取 DNA
[0059]I)、配製DNA提取緩衝液:
[0060]按順序依次加I 體積的 DNA 提取溶液(0.35M sorbitol; 0.1M Tris, pH8.2; 0.005MEDTA ;其餘為水)，I 體積的核裂解液(0.2M Tris, pH7.5;0.05M EDTA;2M NaCl;0.055MCTAB ;其餘為水)和0.4體積的5% (質量濃度)sarkosyl溶液(即十二醯-N-甲基甘氨酸鈉的水溶液);最後加入亞硫酸氫鈉，配製成DNA提取緩衝液；亞硫酸氫鈉在DNA提取緩衝液中的終濃度為0.02M。
[0061]上述DNA提取溶液的製備方法為:在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇)、0.Imol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH8.2),0.005mol的EDTA (乙二胺四乙酸)中加水定容至1L。
[0062]上述核裂解液的製備方法為:在0.2mol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH7.5)、
0.05mol的EDTA (乙二胺四乙酸)、2mol的NaCl (氯化鈉)、0.055mol的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)加水定容至1L。
[0063]2)、對上述日本晴、特青、Fl的水稻葉片分別進行如下處理:
[0064]①、稱取0.1g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然後加入700 μ I的上述步驟I)配製的DNA提取緩衝液，65°C水浴40分鐘。再加700 μ I的氯仿:異戊醇(24:1的體積比)，並混勻。10，OOOrpm離心5分鐘，將上清液轉移到新的離心管中。
[0065]②、在上述步驟①離心後所得的上清液中加2/3~I倍體積預冷(至4°C)的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉澱。13，OOOrpm離心8分鐘,倒出上清液。
[0066]③、再用70% (體積濃度)的已醇200 μ I洗滌上述步驟②所得的DNA沉澱物。
[0067]④、將上述洗滌後的DNA晾乾並溶於100 μ I TE緩衝液或純水中。
[0068]⑤、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。完整合適的DNA用於PCR擴增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完整的DNA。
[0069]二、PCR 擴增
[0070]I)、反應體系:
[0071]水稻基因組DNA20ng/ulIul，10XPCR Buffer2.0ul,25mM MgCl22.0ul,2mMdNTP2.0ul，IOuM 引物各 1.0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul, ddH2010.8ul，總體系 20ul。[0072]所述引物為:SSIVb-m正向:AITTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT
[0073]反向:AAAACATTGCTCCAAAACAGC；
[0074]2)、反應程序:
[0075]95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個循環；72°C補齊10分鐘。
[0076]三、電泳檢測
[0077]取擴增產物20ul，用4.0 %的瓊脂糖凝膠(含有0.5% ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察並照相記錄結果。如圖1所示。
[0078]在圖1中，日本晴為62bp的條帶，特青為59bp的條帶，「F1」為62bp+59bp的條帶。
[0079]根據圖1，我們能得出下述結論:Indel分子標記SSIVb_m能夠檢測特青和日本晴之間的多態性，且日本晴的PCR擴增產物片段要大於特青，由此表明SSIVb-m能用於特青和日本晴之間的分子檢測及其後代的標記輔助選擇。
[0080]實施例2、用Indel分子標記SSIVb-m鑑定低直鏈澱粉含量的粳稻日本晴和高直鏈澱粉含量的秈稻特青的序列差異
[0081]具體做法是:應用Indel分子標記SSIVb-m對日本晴和特青的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物委託上海英駿生物技術有限公司進行測序，比較其序列的差異(圖2)。
[0082]一、提取 DNA
[0083]I )、配製DNA提取緩衝液:
[0084]同實施例1。
[0085]2)、對上述日本晴和特青的水稻葉片分別進行如下處理:
[0086]同實施例1。
[0087]3) PCR 擴增
[0088]同實施例1。
[0089]4 ) PCR產物的回收
[0090]PCR產物的回收選用北京百泰克生物技術有限公司開發的PCR產物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)，參照產品說明要求進行，回收的PCR產物委託上海英駿生物技術有限公司進行測序。
[0091]根據圖2，我們能得出以下結論:日本晴和特青的SSIVb-m擴增產物存在3bp的鹼基差異(如圖2中的下劃線所示)，這是我們能夠使用Indel分子標記SSIVb-m檢測出其多態性的原因所在，也是我們能用於其後代標記輔助選擇的遺傳基礎。
[0092]實施例3、利用Indel標記SSIVb-m開展低直鏈澱粉含量的輔助選擇育種
[0093]具體做法是:低直鏈澱粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈澱粉含量的秈稻品種特青進行雜交、回交和自交，對所得後代結合分子標記SSIVb-m的輔助選擇，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用於育種改良。
[0094]一、提取 DNA
[0095]1)、配製DNA提取緩衝液:
[0096]同實施例1。
[0097]2)、對上述日本晴 、特青、所得後代的水稻葉片分別進行如下處理:
[0098]同實施例1。[0099]二、Indel 標記檢測
[0100]I)、PCR 擴增
[0101]同實施例1。
[0102]2)、電泳檢測
[0103]同實施例1。
[0104]三、Indel分子標記SSIVb-m開展低直鏈澱粉含量的輔助選擇育種
[0105]低直鏈澱粉含量的基因供體粳稻品種日本晴與高直鏈澱粉含量的普通秈稻品種特青進行雜交、回交和自交，結合分子標記SSIVb-m的輔助選擇，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株進一步用於育種改良(圖3)，淘汰帶型與高直鏈澱粉含量特青的帶型一致和雜合帶型(同時具有日本晴和特青帶型)的個體，育種材料的稻米直鏈澱粉含量採用國家標準(GB/T15683-2008)進行檢測。分析表明，所選擇的帶日本晴帶型的8個單株均比輪迴親本特青明顯降低(圖4)。該實驗結果表明:Indel標記SSIVb-m可以用於稻米直鏈澱粉含量的輔助選擇育種。
[0106]備註說明:
[0107]圖3和圖4中的「4~11」均為日本晴和特青依次進行雜交、回交和自交獲得的，且是選擇了 「帶型與日本晴帶型一致」的單株。
[0108]對比例1、 利用Indel標記SSIVb-m判別稻米直鏈澱粉含量
[0109]具體做法是:將實施例3的步驟三中被淘汰的帶型與高直鏈澱粉含量特青的帶型一致和雜合帶型(同時具有日本晴和特青帶型)的個體繼續進行種植，通過對其後代稻米籽粒直鏈澱粉含量的測定，進一步分析分子標記SSIVb-m輔助選擇的可靠性。
[0110]一、提取 DNA
[0111]I)、配製DNA提取緩衝液:
[0112]同實施例1。
[0113]2)、對上述水稻葉片分別進行如下處理:
[0114]同實施例1。
[0115]二、Indel 標記檢測
[0116]I)、PCR 擴增
[0117]同實施例1。
[0118]2)、電泳檢測
[0119]同實施例1。
[0120]三、Indel標記SSIVb-m判別稻米直鏈澱粉含量
[0121]隨機選擇了在實施例3的步驟三中被淘汰4個帶型與特青一致的單株繼續種植，經Indel分子標記SSIVb-m檢測,其後代均表現與特青一致的帶型,分別收穫這些單株籽粒並測定其直鏈澱粉含量。另外，隨機選擇其中I個雜合帶型(同時具有日本晴和特青帶型)的個體用於繼續種植，在其後代中隨機選取12個單株，Indel分子標記SSIVb-m檢測表明，該12個單株中有3個單株表現特青帶型，6個單株表現雜合帶型，3個表現日本晴帶型，符合1:2:1的分離關係；待植株成熟後，分別收穫這些單株並測定其籽粒的直鏈澱粉含量。表I是這16個單株(株系)的稻米籽粒的直鏈澱粉含量，4個與特青帶型一致的單株均表現與特青類似的高直鏈澱粉含量；而在帶型雜合的12個後代單株中，有9個單株表現類似與特青的高直鏈澱粉含量(其中，3個單株的帶型表現特青帶型，6個單株的帶型表現雜合帶型)；3個呈日本晴帶型的單株，其直鏈澱粉含量顯著低於特青。該實驗結果表明=Indel分子標記SSIVb-m可以用於判別稻米直鏈澱粉含量。
[0122] 表1.稻米直鏈澱粉含量及其對應的基因型
【權利要求】
1.稻米直鏈澱粉含量微控基因SSIVb的分子標記SSIVb-m，以水稻作為物種，其特徵是:所述分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' —3'，
SSIVb-m 正向:ATTTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT
反向:AAAACATTGCTCCAAAACAGC。
2.如權利要求1所述的分子標記SSIVb-m的開發方法，其特徵是包括以下步驟: 1)、以粳稻品種日本晴作為低直鏈澱粉含量基因供體親本與作為高直鏈澱粉含量的秈稻特青進行雜交、回交和自交，從而獲得作為後代的稻米低直鏈澱粉含量的單株； 2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及後代幼苗的基因組DNA； 3)、採用Indel分子標記方法進行水稻稻米低直鏈澱粉含量分子標記的篩選； 4)、鑑定出一個Indel分子標記SSIVb-m。
3.如權利要求1所述的分子標記SSIVb-m的用途，其特徵是:用於水稻稻米直鏈澱粉含量鑑定和/或其後代輔助選擇育種。
4.根據權利要求3所述的分子標記SSIVb-m的用途，其特徵是:當篩選日本晴和特青的後代時，選擇後代 中帶型與日本晴帶型一致的單株用於育種。
【文檔編號】C12N15/11GK103602674SQ201310585846
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】曾大力, 錢前, 李家洋, 田誌喜, 楊窯龍, 張光恆, 郭龍彪, 高振宇, 朱麗, 胡江, 董國軍, 胡興民, 顏美仙 申請人:中國水稻研究所