一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法與流程
2023-05-13 14:07:31
本發明涉及一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法,屬於牡丹繁殖技術領域。
背景技術:
『紫斑』牡丹是野生種楊山牡丹的生產中常用到的栽培品種。『紫斑』牡丹不僅具有很好的觀賞與藥用作用,還有較高的油用價值。近年來,相關調研發現『紫斑』牡丹還可作為木本糧油植物資源進行開發利用,油用牡丹一般產油量是144斤/畝,遠遠高於芝麻、油茶等的產油量。『紫斑』牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸,亞麻酸、亞油酸和油酸,其中,α-亞麻酸含量高達42.34%~49%。α-亞麻酸是構成人體腦細胞和組織細胞的重要成分,是人體不可缺少的自身不能合成又不能替代的多不飽和脂肪酸,又有「血液營養素」、「維生素F」和「植物腦黃金」之稱,有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調節免疫等功能。牡丹籽油多項指標都超過了以高檔著稱的橄欖油,是名副其實的高端食用油。
牡丹有性繁殖係數大,但實生苗變異大,不能較好的保存母本優良性狀,而且種子的種皮的透水和透氣性也影響種子的萌發,種子的上胚軸還具有休眠現象,即秋季生根,春季才發芽,而且種子萌發也不整齊,存在部分種子幾年內一直是休眠狀態。因而採用組織培養技術繁殖優質油用牡丹成為重要的良種繁育途徑。
但目前由於採用鱗芽誘導愈傷時極易褐化,導致愈傷組織誘導率低。
技術實現要素:
發明目的:為了解決上述技術問題,本發明提供了一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法。
技術方案:為了實現上述發明目的,本發明公開了一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法,包括以下步驟:
(1)外植體選擇:選擇紫斑牡丹鱗芽為外植體,清洗,預冷24-48小時;
(2)消毒及接種:在無菌條件下,將步驟(1)所得鱗芽剝去鱗片,消毒,然後接種於愈傷組織誘導培養基上;
(3)愈傷組織誘導培養:將接種後的外植體放在培養室中培養,紅光培養7-10天。
優選,所述紫斑牡丹為「紫斑」油用牡丹。
優選,所述步驟(1)中清洗方法為:用洗衣粉溶液浸泡2小時,再輕輕刷洗鱗芽外表面,然後放在自來水流水下衝洗24小時。
優選,所述步驟(1)中的預冷溫度為0-4℃。
優選,所述步驟(2)中消毒方法為:先用75%酒精消毒20-30秒,再用0.1%升汞消毒10-15分鐘,再用無菌水衝洗5-6次。
優選,所述步驟(2)中培養基的基礎培養基為MS培養基,其中6-BA1-2mg/L,NAA0.3-0.5mg/L,硝酸銀4-5mg/L,7g/L瓊脂,30g/L蔗糖,pH調至5.8。
優選,所述步驟(3)中培養時的溫度為25士2℃。
技術效果:相對於現有技術,本發明採用外植體預冷的方法,並且結合特定的培養基成分,最後再採用紅光培養的方法,能夠有效降低紫斑牡丹褐化率為0,無褐化現象發生,提高愈傷組織誘導率為100%,最終能獲取數量多、質量好的叢生芽,從而滿足繼代增殖的需要,促進快繁體系的建立。
具體實施方式
實施例1
1、外植體選擇:選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體,用洗衣粉溶液浸泡2小時,再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面,然後放在流水下衝洗24小時,然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷24小時。
2、外植體消毒及接種:將外植體轉到無菌操作臺上,將鱗芽剝去鱗片,先用75%酒精消毒20秒,再用0.1%升汞消毒10分鐘,再用無菌水衝洗5次後,接種於愈傷組織誘導培養基上,每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基,6-BA1mg/L,NAA0.3mg/L,硝酸銀4mg/L,7g/L瓊脂,30g/L蔗糖;培養基pH調至5.8。
3、愈傷組織誘導培養:將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃,進行紅光培養7天。
4、結果:愈傷組織誘導率100%,褐化率為0,20天後不定芽分化率:85%,且不定芽生長健壯。
實施例2
1、外植體選擇:選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體,用洗衣粉溶液浸泡2小時,再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面,然後放在流水下衝洗24小時,然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷48小時。
2、外植體消毒及接種:將外植體轉到無菌操作臺上,將鱗芽剝去鱗片,先用75%酒精消毒30秒,再用0.1%升汞消毒15分鐘,再用無菌水衝洗5次後,接種於愈傷組織誘導培養基上,每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基,6-BA2mg/L,NAA0.3mg/L,硝酸銀5mg/L,7g/L瓊脂,30g/L蔗糖;培養基pH調至5.8
3、愈傷組織誘導培養:將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃,進行紅光培養10天。
4、結果:愈傷組織誘導率100%,褐化率為0,20天後不定芽分化率:88%,且不定芽生長健壯。
實施例3
1、外植體選擇:選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體,用洗衣粉溶液浸泡2小時,再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面,然後放在流水下衝洗24小時,然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷36小時。
2、外植體消毒及接種:將外植體轉到無菌操作臺上,將鱗芽剝去鱗片,先用75%酒精消毒25秒,再用0.1%升汞消毒12分鐘,再用無菌水衝洗5次後,接種於愈傷組織誘導培養基上,每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基,6-BA1.5mg/L,NAA0.4mg/L,硝酸銀4.5mg/L,7g/L瓊脂,30g/L蔗糖;培養基pH調至5.8
3、愈傷組織誘導培養:將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃,進行紅光培養9天。
4、結果:愈傷組織誘導率100%,褐化率為0,20天後不定芽分化率:87%,且不定芽生長健壯。
對照例1
1、外植體選擇:選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體,用洗衣粉溶液浸泡2小時,再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面,然後放在流水下衝洗24小時,然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷12小時。
2、外植體消毒及接種:將外植體轉到無菌操作臺上,將鱗芽剝去鱗片,先用75%酒精消毒30秒,再用0.1%升汞消毒15分鐘,再用無菌水衝洗5次後,接種於愈傷組織誘導培養基上,每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基,6-BA2mg/L,NAA0.3mg/L,硝酸銀5mg/L,7g/L瓊脂,30g/L蔗糖;培養基pH調至5.8。
3、愈傷組織誘導培養:將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃,進行白光培養10天。
4、結果:愈傷組織誘導率65.2%,褐化率為24.8%,20天後不定芽分化率:70.6%,且不定芽生長瘦弱。
對照例2:
與實施例2方法相同,不同之處僅在於:不包含步驟1中的預冷步驟,培養結果如下:愈傷組織誘導率63.8%,褐化率為25.9%,20天後不定芽分化率:68.5%,且不定芽生長瘦弱。
對照例3:
與實施例2方法相同,不同之處僅在於:培養基中不包括硝酸銀,培養結果如下:愈傷組織誘導率64.7%,褐化率為26.2%,20天後不定芽分化率:69.4%,且不定芽生長瘦弱。