一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法與流程
2023-05-13 14:07:31
本發明涉及一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法，屬於牡丹繁殖技術領域。
背景技術：
『紫斑』牡丹是野生種楊山牡丹的生產中常用到的栽培品種。『紫斑』牡丹不僅具有很好的觀賞與藥用作用，還有較高的油用價值。近年來，相關調研發現『紫斑』牡丹還可作為木本糧油植物資源進行開發利用，油用牡丹一般產油量是144斤/畝，遠遠高於芝麻、油茶等的產油量。『紫斑』牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，亞麻酸、亞油酸和油酸，其中，α-亞麻酸含量高達42.34％～49％。α-亞麻酸是構成人體腦細胞和組織細胞的重要成分，是人體不可缺少的自身不能合成又不能替代的多不飽和脂肪酸，又有「血液營養素」、「維生素F」和「植物腦黃金」之稱，有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調節免疫等功能。牡丹籽油多項指標都超過了以高檔著稱的橄欖油，是名副其實的高端食用油。
牡丹有性繁殖係數大，但實生苗變異大，不能較好的保存母本優良性狀，而且種子的種皮的透水和透氣性也影響種子的萌發，種子的上胚軸還具有休眠現象，即秋季生根，春季才發芽，而且種子萌發也不整齊，存在部分種子幾年內一直是休眠狀態。因而採用組織培養技術繁殖優質油用牡丹成為重要的良種繁育途徑。
但目前由於採用鱗芽誘導愈傷時極易褐化，導致愈傷組織誘導率低。
技術實現要素：
發明目的：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法。
技術方案：為了實現上述發明目的，本發明公開了一種紫斑牡丹初代培養愈傷組織誘導方法，包括以下步驟：
(1)外植體選擇：選擇紫斑牡丹鱗芽為外植體，清洗，預冷24-48小時；
(2)消毒及接種：在無菌條件下，將步驟(1)所得鱗芽剝去鱗片，消毒，然後接種於愈傷組織誘導培養基上；
(3)愈傷組織誘導培養：將接種後的外植體放在培養室中培養，紅光培養7-10天。
優選，所述紫斑牡丹為「紫斑」油用牡丹。
優選，所述步驟(1)中清洗方法為：用洗衣粉溶液浸泡2小時，再輕輕刷洗鱗芽外表面，然後放在自來水流水下衝洗24小時。
優選，所述步驟(1)中的預冷溫度為0-4℃。
優選，所述步驟(2)中消毒方法為：先用75％酒精消毒20-30秒，再用0.1％升汞消毒10-15分鐘，再用無菌水衝洗5-6次。
優選，所述步驟(2)中培養基的基礎培養基為MS培養基，其中6-BA1-2mg/L，NAA0.3-0.5mg/L，硝酸銀4-5mg/L，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，pH調至5.8。
優選，所述步驟(3)中培養時的溫度為25士2℃。
技術效果：相對於現有技術，本發明採用外植體預冷的方法，並且結合特定的培養基成分，最後再採用紅光培養的方法，能夠有效降低紫斑牡丹褐化率為0，無褐化現象發生，提高愈傷組織誘導率為100％，最終能獲取數量多、質量好的叢生芽，從而滿足繼代增殖的需要，促進快繁體系的建立。
具體實施方式
實施例1
1、外植體選擇：選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體，用洗衣粉溶液浸泡2小時，再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面，然後放在流水下衝洗24小時，然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷24小時。
2、外植體消毒及接種：將外植體轉到無菌操作臺上，將鱗芽剝去鱗片，先用75％酒精消毒20秒，再用0.1％升汞消毒10分鐘，再用無菌水衝洗5次後，接種於愈傷組織誘導培養基上，每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基，6-BA1mg/L，NAA0.3mg/L，硝酸銀4mg/L，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖；培養基pH調至5.8。
3、愈傷組織誘導培養：將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃，進行紅光培養7天。
4、結果：愈傷組織誘導率100％，褐化率為0，20天後不定芽分化率：85％，且不定芽生長健壯。
實施例2
1、外植體選擇：選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體，用洗衣粉溶液浸泡2小時，再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面，然後放在流水下衝洗24小時，然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷48小時。
2、外植體消毒及接種：將外植體轉到無菌操作臺上，將鱗芽剝去鱗片，先用75％酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒15分鐘，再用無菌水衝洗5次後，接種於愈傷組織誘導培養基上，每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基，6-BA2mg/L，NAA0.3mg/L，硝酸銀5mg/L，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖；培養基pH調至5.8
3、愈傷組織誘導培養：將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃，進行紅光培養10天。
4、結果：愈傷組織誘導率100％，褐化率為0，20天後不定芽分化率:88％，且不定芽生長健壯。
實施例3
1、外植體選擇：選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體，用洗衣粉溶液浸泡2小時，再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面，然後放在流水下衝洗24小時，然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷36小時。
2、外植體消毒及接種：將外植體轉到無菌操作臺上，將鱗芽剝去鱗片，先用75％酒精消毒25秒，再用0.1％升汞消毒12分鐘，再用無菌水衝洗5次後，接種於愈傷組織誘導培養基上，每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基，6-BA1.5mg/L，NAA0.4mg/L，硝酸銀4.5mg/L，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖；培養基pH調至5.8
3、愈傷組織誘導培養：將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃，進行紅光培養9天。
4、結果：愈傷組織誘導率100％，褐化率為0，20天後不定芽分化率:87％，且不定芽生長健壯。
對照例1
1、外植體選擇：選擇「紫斑」油用牡丹鱗芽為外植體，用洗衣粉溶液浸泡2小時，再軟毛刷輕輕刷洗鱗芽外表面，然後放在流水下衝洗24小時，然後用紗布包起來放在冰箱中(0-4℃)預冷12小時。
2、外植體消毒及接種：將外植體轉到無菌操作臺上，將鱗芽剝去鱗片，先用75％酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒15分鐘，再用無菌水衝洗5次後，接種於愈傷組織誘導培養基上，每玻璃瓶接一個莖段。愈傷組織誘導培養基成分為MS培養基，6-BA2mg/L，NAA0.3mg/L，硝酸銀5mg/L，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖；培養基pH調至5.8。
3、愈傷組織誘導培養：將接種後的外植體放在培養室適宜條件下培養。條件為溫度25士2℃，進行白光培養10天。
4、結果：愈傷組織誘導率65.2％，褐化率為24.8％，20天後不定芽分化率：70.6％，且不定芽生長瘦弱。
對照例2：
與實施例2方法相同，不同之處僅在於：不包含步驟1中的預冷步驟，培養結果如下：愈傷組織誘導率63.8％，褐化率為25.9％，20天後不定芽分化率：68.5％，且不定芽生長瘦弱。
對照例3：
與實施例2方法相同，不同之處僅在於：培養基中不包括硝酸銀，培養結果如下：愈傷組織誘導率64.7％，褐化率為26.2％，20天後不定芽分化率：69.4％，且不定芽生長瘦弱。