家蠶中腸特異表達啟動子p3及其應用的製作方法

2023-05-13 21:14:06

專利名稱：家蠶中腸特異表達啟動子p3及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別涉及家蠶中腸特異表達啟動子，還涉及含有該啟動子的轉基因載體及該轉基因載體的應用。
背景技術：
家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目模式生物。家蠶基因組框架圖和精細圖譜的繪製工作相繼在2004和2008完成，標誌著人類對家蠶的研究和認識正式進入後基因組時代。對家蠶基因的研究主要採取「發現基因，研究基因，利用基因」的策略，目前發現了大量功能未知的家蠶基因，但是對家蠶基因研究進展卻十分緩慢，進一步限制了利用家蠶基因。轉基因和RNA幹擾(RNAi)技術是目前研究基因功能最有效的方法，由於家蠶物種本身的特點， 在利用RNAi技術研究基因功能方面存在局限，所以轉基因技術是研究家蠶基因功能最有效的手段。但是許多功能基因都為組織特異性表達，因此利用轉基因技術研究組織特異表達基因需要由組織特異啟動子啟動。目前家蠶組織特異表達啟動子較單一，只有定位於絲腺和脂肪體表達的組織特異啟動子報導，導致家蠶轉基因載體中組織特異啟動子缺乏，因此限制了對家蠶組織特異表達基因的研究。研究表明家蠶的許多重要基因都特異表達於中腸。但是，中腸組織特異的啟動子未見報導，這使科研人員在通過轉基因等技術手段研究中腸組織特異表達基因時感覺很棘手，使相關研究很難開展，同時增加了利用中腸組織特異表達基因的難度。因此急需一種家蠶中腸啟動子，構建含有家蠶中腸啟動子P3的表達載體，為家蠶轉基因提供中腸組織特異表達載體。

發明內容
有鑑於此，本發明目的之一在於提供一種啟動子，該啟動子在家蠶中腸特異性啟動。為實現上述技術目的，本發明的技術方案為
家蠶中腸特異表達啟動子P3，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3含有如SEQ ID No:2 所示核苷酸序列，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的鹼基長度不超過2073，源於家蠶 BGIBMGA008060 基因。進一步，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。進一步，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。本發明目的之二在於提供家蠶中腸特異性啟動子的製備方法，該方法操作簡單， 重現性好。為實現上述目的，本發明的技術方案為
所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的製備方法，具體步驟如下以家蠶基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得家蠶中腸特異表達啟動子P3，所述左、右引物分別如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，PCR擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性40秒、49°C退火40秒、 72°C延伸2分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。本發明目的之三在於提供一種重組載體，其能在家蠶中腸特異表達。為實現上述目的，本發明的技術方案為 家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體。進一步，根據權利要求5所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體，所述重組載體為P3-EGFP-SV40片段同基礎載體pBac[3XP3-DSRed af]片段連接而得重組載體 pBac[P3-EGFP-SV40-3 X P3-DsRed af]。本發明目的之四在於提供所述家蠶中腸特異性啟動子的重組載體的構建方法， 該方法操作簡單，穩定性好。為實現上述目的，本發明的技術方案為
所述重組載體的構建方法，所述P3-EGFP-SV40片段的構建，具體步驟如下酶切所述如SEQ ID No:l或如SEQ ID No 2所示的核苷酸序列，連接用相同內切酶酶切的 EGFP-SV40-1180 載體，所述 EGFP-SV40-1180 載體由已含有 SV40 片段的 pSLfall80fa 與 pBac[3XP3-EGFP afm]中EGFP綠色螢光蛋白構建，得中間載體P3-EGFP-SV40-1180，所得中間載體P3-EGFP-SV40-1180用限制性內切酶Asc I酶切，得P3-EGFP-SV40片段。進一步，所述EGFP-SV40-1180載體的構建，包括以下步驟所述EGFP綠色螢光蛋白引物，上遊引物如SEQ ID No. 6所示序列，下遊引物如SEQ ID No.7所示序列，以所述pBac[3XP3-EGFP afm]質粒為模板，進行PCR擴增；擴增產物用BamH I和Not I 進行酶切，得所述EGFP酶切片段，同時用BamH I和Not I酶切所述已包含SV40片段的 PSLfal ISOfa載體，得所述pSLfal ISOfa載體酶切片段，連接酶切所得所述EGFP酶切片段和所述pSLfall80fa載體酶切片段，得EGFP-SV40-1180載體。本發明目的之五在於提供所述家蠶中腸特異性啟動子P3的應用，該應用為中腸組織特異表達基因提供了新思路。所述家蠶中腸特異表達啟動子P3在家蠶中腸特異表達活性蛋白的應用。本發明的有益效果在於本發明成功獲得了家蠶中腸特異啟動子的核苷酸序列，為後期構建含有家蠶中腸特異啟動子的表達載體提供了必要基礎；利用該序列本發明還成功的構建了由P3或P3-DI介導的EGFP表達載體P3-EGFP-SV40-1180和 P3-DI-EGFP-SV40-1180 ；同時利用基礎載體 pBac[3XP3_DsRed af]與 P3-EGFP-SV40 或 P3-DI-EGFP-SV40表達框進行連接獲得重組轉基因載體pBac [P3-EGFP-SV40-3 X P3-DsRed af]和 pBac[P3-DI-EGFP-SV40-3XP3-DsRed af]；將 P3-PR 或 P3-DI-PR 和輔助質粒對家蠶產下2小時後的非滯育蠶卵進行顯微注射，獲得了轉基因家蠶，在GFP激發光下觀察顯示由 P3或P3-DI介導的EGFP都特異表達於家蠶中腸組織中；同時對EGFP在中腸、脂肪體和血液三個組織的表達譜分析顯示，只在家蠶中腸中能夠檢測到EGFP基因的表達；因此，本發明的家蠶特異啟動子P3特異表達於家蠶中腸組織中，並可成功表達外源基因，為研究家蠶中腸特異表達基因提供了有力工具，具有良好的應用前景。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖1為本發明P3-DI啟動子介導的EGFP轉基因系統的螢光觀察圖(A、B和C為明場下觀察結果；D、E、F為在GFP激發光下觀察結果；A、D為非轉基因大造品種；B、E為P3-DI)； 圖2為本發明P3-DI轉基因系統EGFP組織表達譜(A為P3-DI-1轉基因家蠶；B為非轉基因家蠶；1、2、3分別為血液、脂肪體、中腸組織)。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1
一、家蠶中腸特異性啟動子的獲得
(1)以家蠶大造為基因組，提取家蠶基因組DNA，根據已經報導的家蠶全基因組晶片數據和家蠶基因組資料庫(http://silkworm, swu. edu. cn/silkdb/)，找到一個中腸特異表達基因 BGIBMGA008060，經過(http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)網站分析該基因5』端的非編碼區預測，如SEQ ID No. 1所示2073bp的核苷酸序列，結果表明在該序列中有典型的啟動子結構區域，稱為家蠶中腸特異性啟動子(以下簡稱P3)。因此設計 P3 的特異引物，引物序列如下P3 F: 5，ccggaattcaaaaacattccaagatatcc 3，(SEQ ID No :3),下劃線部分為 EcoR I 酶切位點，P3 R: 5' cgggatcctttattgacattaaaaatattatat a 3' (SEQ ID No :4)，設計的引物委託生工生物工程(上海)有限公司進行合成。(2)根據步驟(1)所得家蠶基因組DNA為模板和設計的P3 F、P3 R為P3啟動子的上、下遊引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性1分鐘、49°C 退火40秒、72°C延伸2分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘，PCR產物採用質量百分濃度為的瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，回收2073bp的目的片段P3，獲得P3回收片段，具有如SEQ ID No. 1所示2073bp的核苷酸序列；
二、構建EGFP-SV40-1180 載體
根據EGFP綠色螢光蛋白基因序列設計特異引物，引物序列如下EGFP F: 5' cgggatccatggtgagcaagggcgag3' (SEQ ID No :7)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點， EGFP R: 5' atagtttagcggccgcttacttgtacagctcgtccatgc 3' (SEQ ID No:8),下劃線部分為Not I酶切位點，設計的引物委託生工生物工程(上海)有限公司進行合成。以 pBac[3XP3-EGFP afm]質粒為模板，以設計的EGFP F、EGFP R為上下遊引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、59°C退火1分鐘、72°C延伸 40秒，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物分別用BamH I和Not I進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑑定並回收，得EGFP酶切片段，同時用BamH I和Hind III酶切含有SV40 終止信號的pSLfal ISOfa載體，瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，得pSLfal ISOfa載體酶切片段，連接EGFP酶切片段和pSLfalISOfa載體酶切片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下， 16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆， 提取質粒，酶切鑑定片段大小，得含有EFGP綠色螢光蛋白基因的pSLfallSOfa載體(簡稱 EGFP-SV40-1180)。
三、構建P3-EGFP-SV40-1180 載體
用限制性內切酶EcoR I和BamH I分別酶切EGFP-SV40-1180載體和P3回收片段， 經瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，分別得EGFP-SV40-1180酶切片段和P3酶切片段，連接 EGFP-SV40-1180酶切片段和P3酶切片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，得家蠶中腸特異性啟動子的中間載體，簡稱P3-EGFP-SV40-1180。四、構建家蠶中腸特異性啟動子的重組載體
用限制性內切酶Asc I酶切家蠶中腸特異性啟動子的載體P3-EGFP-SV40-1180， 瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，得P3-EGFP-SV40片段；同時用內切酶Asc I單酶切 pBac[3XP3_DsRed af]載體，得 pBac[3XP3_DsRed af]線性片段，然後對獲得pBac[3XP3-DSRed af] 線性片段5，端去磷酸化，連接P3-EGFP-SV40片段和 pBac[3XP3-DsRed af]線性片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，得家蠶中腸特異性啟動子的轉基因載體 pBac[P3-EGFP-SV40-3XP3-DsRed af]，簡稱 P3-PR。本實施例以外源基因EGFP為例，還可以為其他外源基因，也可以為其他中腸特異表達基因。實施例2
一、家蠶中腸特異性啟動子的獲得
(1)以家蠶大造為基因組，提取家蠶基因組DNA，根據已經報導的家蠶全基因組晶片數據和家蠶基因組資料庫(http://SilkWorm. swu. edu. cn/silkdb/)，找到一個中腸特異表達基因BGIBMGA008060，與家蠶基因組資料庫中該基因EST數據進行比對後發現該基因的翻譯起始位點(ATG)位於第2外顯子上，即該基因5』端的非編碼區包含第一內含子。在 (http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)網站對該基因 5，端的第一內含子上遊的非編碼區進行預測，如SEQ ID No:2所示1598bp的核苷酸序列，結果表明在該序列中有典型的啟動子結構區域，稱為家蠶中腸特異性啟動子(以下簡稱P3-DI)。因此設計 P3-DI的特異引物，含有如SEQ ID No. 1所示1-1598位的核苷酸序列，即SEQ ID No 2所示序列，弓丨物序列如下P3-DI F: 5' ccggaattcaaaaacattccaagatatccgccg 3 『 (SEQ ID No :5)，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點，P3-DI R 5' cgggatcccatagcgcgcagctcaccac 3' (SEQ ID No :6)，下劃線部分為BamH I酶切位點，設計的引物委託生工生物工程(上海)有限公司進行合成。(2)以設計的P3-DI F、P3-DI R為P3-DI啟動子上、下遊引物進行PCR擴增，PCR 反應條件為94 V預變性4分鐘，94V變性40秒、65 V退火40秒、72 °C延伸1分20秒， 共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物採用質量百分濃度為的瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，切膠回收1598bp的目的片段，得P3-DI回收片段，具有如SEQ ID No :1所示的 1-1598位核苷酸序列。二、構建 EGFP-SV40-1180 載體
根據EGFP綠色螢光蛋白基因序列設計特異引物，引物序列如下EGFP F: 5' cg￡gatccatggtgagcaagggcgag3' (SEQ ID No :7)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點， EGFP R: 5' atagtttagcggccgcttacttgtacagctcgtccatgc 3' (SEQ ID No :8),下劃線部分為Not I酶切位點，設計的引物委託生工生物工程(上海)有限公司進行合成。以 pBac[3XP3-EGFP afm]質粒為模板，以設計的EGFP F,EGFP R為上下遊引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、59°C退火1分鐘、72 °C延伸 40秒，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物分別用BamH I和Not I進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑑定並回收，得EGFP酶切片段，同時用BamH I和Hind III酶切含有SV40 終止信號的pSLfallSOfa載體，瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，得pSLfallSOfa載體酶切片段，連接EGFP酶切片段和pSLfalISOfa載體酶切片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下， 16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆， 提取質粒，酶切鑑定片段大小，得含有EGFP綠色螢光蛋白基因的pSLfallSOfa載體(簡稱 EGFP-SV40-1180)。三、構建P3-DI-EGFP-SV40-1180 載體
同時，用限制性內切酶EcoR I和BamH I酶切P3-DI回收片段，經瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，得P3酶切片段，連接EGFP-SV40-1180酶切片段和P3-DI酶切片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，得家蠶中腸特異性啟動子的過渡載體，簡稱 P3-DI-EGFP-SV40-1180。四、構建家蠶中腸特異性啟動子的重組載體
用限制性內切酶Asc I酶切家蠶中腸特異性啟動子的載體P3-DI-EGFP-SV40-1180， 瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，得P3-DI-EGFP-SV40片段；同時用內切酶Asc I單酶切 pBac[3XP3_DsRed af]載體，得 pBac[3XP3_DsRed af]線性片段，然後對獲得pBac[3XP3-DsRed af]線性片段5，端去磷酸化，連接P3-DI-EGFP-SV40片段和 pBac[3XP3-DsRed af]片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，得家蠶中腸特異性啟動子的重組載體 pBac [P3-DI-EGFP-SV40-3 X P3_DsRed af]，簡稱 P3-DI-PR。本步驟以外源基因EGFP為例，還可以為其他外源基因，也可以為其他中腸特異表達基因。實施例3
一、轉基因顯微注射和陽性個體的篩選
(1)將家蠶大造品種蠶卵浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)解除滯育以後，放於15°C和80%溼度的黑暗環境中催青30天左右直至孵化，將蟻蠶收好置於標準環境中飼養(溫度25°C，溼度80%)，化蛾以後將雌雄蠶蛾交配4小時，拆對後產下的蠶卵為非滯育蠶卵，用於下一步的顯微注射；
(2)將產下的蠶卵在乾淨的載玻片上排列整齊，在蠶卵產後2小時用Eppendorf顯微注射儀將P3含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重組載體載體P3-PR和輔助質粒A3H，一起注射進185粒大造蠶卵中，用無毒膠水封口以後置於25°C、相對溼度80%的環境中催青10 天左右孵化，將孵化的115頭GO代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾，GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得20蛾圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀螢光顯微鏡觀察Gl胚胎篩選並獲得3個陽性蛾圈，即3個家蠶中腸特異性啟動子P3的轉基因家蠶，簡稱P3轉基因系統，轉化效率為15%;將含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的重組載體P3-DI-ra和輔助質粒A3H，一起注射進200粒大造蠶卵中，共孵化125頭GO代蟻蠶，獲得34蛾圈Gl代蠶卵，篩選得到4個陽性蛾圈，即4個家蠶中腸特異性啟動子的轉基因家蠶，簡稱P3-DI轉基因系統，轉化效率為
11. 80%ο二、轉基因系統的螢光觀察和分子檢測(1)將獲得的陽性蛾圈各自單蛾圈飼養，繼代擴大得到3個P3轉基因系統和4個P3-DI 轉基因系統，各自隨機選擇2個轉基因系統(P3-1，P3-2，P3-DI-1，P3-DI-2)，在幼蟲5齡3 天進行螢光觀察，結果如附圖1所示，P3-DI的轉基因系統中腸有綠色螢光，而其他組織沒有綠色螢光，包括P3-DI序列在內的P3啟動子的轉基因系統觀察結果和P3-DI類似。表明了如SEQ ID No:l所示的2073bp核苷酸序列和如SEQ ID No: 2所示的1598bp核苷酸序列都能成功介導外源基因EGFP特異表達於家蠶中腸。(2)取P3-1和P3-DI-1轉基因系統的中腸、脂肪體和血液組織，分析外源基因EGFP在組織表達譜，根據EGFP基因序列，設計檢測引物上遊引物序列為 EGFP F: 5，-cagtgcttcagccgctaccc-3『 (SEQ ID No 9),下遊引物序列為EGFP R: 5，-ggatgttgccgtcctccttg-3，(SEQ ID No :10)，分別提取 P3 和 P3-DI 中腸、脂肪體和血液組織RNA，採用RT-PCR逆轉錄擴增試劑盒(Takara)進行反轉獲得各組織cDNA，以 BGIBMGA003186基因為內參，上遊引物序列為5，-ttcgtactggctcttctcgt-3，(SEQ ID No: 11)，下遊引物序列為 5，-caaagttgatagcaattccct_3，(SEQ ID No :12)，進行 RT-PCR 檢測， 結果如附圖2所示，在脂肪體和血液組織沒有檢測到EGFP的表達，只在中腸檢測到EGFP的表達，以正常大造中腸、脂肪體和血液組織中都未檢測到EGFP的表達，說明P3確實是家蠶中腸特異表達啟動子。在上述實施例中，其中，P3-1和P3-DI-1均為家蠶中腸特異表達啟動子P3。以上所述僅為本發明的優選實施例，並不用於限制本發明，顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。
權利要求
1.家蠶中腸特異表達啟動子P3，其特徵在於所述家蠶中腸特異表達啟動子P3含有如 SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的鹼基長度不超過2073， 源於家蠶BGIBMGA008060基因。
2.根據權利要求1所述的家蠶中腸特異表達啟動子P3，其特徵在於所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
3.根據權利要求1所述的家蠶中腸特異表達啟動子P3，其特徵在於所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下以家蠶基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得家蠶中腸特異表達啟動子P3，所述左、右引物分別如SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，PCR擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性40秒、49 °C退火40秒、72 °C延伸2分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。
5.含有權利要求1所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體。
6.根據權利要求5所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體，其特徵在於所述重組載體為P3-EGFP-SV40片段同基礎載體pBac[3XP3-DSRed af]片段連接而得重組載體 pBac [P3-EGFP-SV40-3 X P3-DsRed af]。
7.權利要求5所述重組載體的構建方法，其特徵在於，所述P3-EGFP-SV40片段的構建， 具體步驟如下酶切所述如SEQ ID No: 1或如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，與用相同內切酶酶切好的EGFP-SV40-1180載體連接，所述EGFP-SV40-1180載體由pSLfall80fa與 pBac[3XP3-EGFP afm]中EGFP綠色螢光蛋白構建，得中間載體P3-EGFP-SV40-1180，所得中間載體P3-EGFP-SV40-1180用限制性內切酶Asc I酶切，得P3-EGFP-SV40片段。
8.根據權利要求7所述重組載體的構建方法，其特徵在於所述EGFP-SV40-1180載體的構建，包括以下步驟所述EGFP綠色螢光蛋白引物，上遊引物如SEQ ID No :6所示序列， 下遊引物如SEQ ID No :7所示序列，以所述pBac[3XP3-EGFP afm]質粒為模板，進行PCR擴增；擴增產物用BamH I和Not I進行酶切，得所述EGFP酶切片段，同時用BamH I和Not I 酶切所述已包含SV40片段的pSLfal ISOfa載體，得所述pSLfal ISOfa載體酶切片段，連接酶切所得所述EGFP酶切片段和所述pSLfalISOfa載體酶切片段，得EGFP-SV40-1180載體。
9.含有權利要求1所述家蠶中腸特異表達啟動子P3在家蠶中腸特異表達活性蛋白的應用。
全文摘要
本發明涉及家蠶基因技術，具體為家蠶中腸特異表達啟動子P3，具有如SEQ ID No1所示的部分或全部核苷酸序列；該啟動子是通過設計特異引物進行PCR擴增而獲得；本發明還涉及含有該啟動子的轉基因載體，具體為P3-EFGP-SV40表達框和pBac[3XP3-DsRedaf]線性載體連接而得重組載體pBac[P3-EFGP-SV40-3XP3-DsRedaf]；該啟動子具有使外源基因特異表達於家蠶中腸，可用於轉基因研究家蠶中腸特異表達基因的功能，為研究和利用家蠶中腸特異表達基因提供了有力工具。
文檔編號C12N15/10GK102296071SQ20111027339
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者夏慶友, 徐漢福, 王根洪, 程廷才, 蔣亮, 金盛凱, 陸改 申請人:西南大學