一種疫苗組合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-13 13:47:11

一種疫苗組合物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明關於一種疫苗組合物，其含有豬瘟病毒抗原、豬圓環病毒2型抗原、豬肺炎支原體抗原和疫苗佐劑。本發明還提供一種製備疫苗組合物的方法，採用水溶性疫苗佐劑配製含豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將所述混合物作為稀釋劑稀釋豬瘟病毒抗原。本發明的疫苗組合物，製備方法簡單，疫苗的效價含量高，免疫方便快捷，僅免疫1次就能夠同時預防或治療豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體三種病原感染，降低了免疫成本，節約了免疫程序，更加經濟可靠。
【專利說明】一種疫苗組合物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明關於一種聯合疫苗組合物，特別關於一種豬瘟、豬圓環和豬肺炎支原體三聯混合疫苗組合物及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]豬瘟是豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特徵是高溫、微血管變性而引起全身出血、壞死、梗塞。早年又稱豬霍亂，對豬危害極為嚴重，給養豬業造成重大損失，但由於混合感染以及一些免疫抑制病原體的影響，造成了單用豬瘟疫苗防治效果的下降，豬瘟總有零星爆發。
[0003]豬圓環病毒2型(Porcine circovirus,縮寫:PCV)是迄今發現的一種最小的動物病毒。現已知PCV有兩個血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，它是斷奶仔豬多系統衰竭症候群(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原，最早發現於加拿大(1991 )，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發生和流行，除PMWS外，TONS (豬皮炎與腎病症候群)、PNP (增生性壞死性肺炎)、PRDC (豬呼吸道疾病症候群)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關聯。PCV2及其相關的豬病，死亡率10%~30%不等，較嚴重的豬場在暴發本病時死淘率高達40%，給養豬業造成嚴重的經濟損失。現已被世界各國的獸醫與養豬業者公認為是繼豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)之後新發現的引起豬免疫障礙的重要傳染病。豬圓環病毒產生免疫抑制，容易發生烈性傳染病。
[0004]豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引發的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺炎。長期以來，本病一直被認為是對養豬業造成重大經濟損失、最常發生、流行最廣、最難淨化的重要疫病之一。本病雖為老病，但近年來由於經常和PRRSV、圓環病毒、豬瘟病毒等其它病原混合感染，造成重大的經濟損失而突顯出了其重要性。豬肺炎支原體是條件性致病菌，可使機體抵抗力降低，極易繼發感染鏈球菌病等，使病情加重和病死率升高，極易繼發感染豬瘟病毒、豬圓環病毒2型等，使病情加重和病死率升高。
[0005]本領域需要能產生保護性免疫應答以同時抵抗豬肺炎支原體和豬圓環病毒2型及豬瘟病毒感染的疫苗，減少所述混合感染的發生率和/或減輕所述感染的嚴重性，或預防與所述感染有關的臨床表現，並且減少注射次數，降低動物的應激反應，有效控制豬瘟。

【發明內容】

[0006]本發明的目的正是要發明一種安全且有效的疫苗組合物，用於同時預防豬瘟、豬圓環病毒2型病及豬支原體肺炎三種病原的混合感染引起的豬瘟防治效果下降，具體來說，本發明提供一種豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體的三聯疫苗組合物，其包含豬瘟病毒抗原、豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原。
[0007]優選地，所述三聯疫苗組合物，包含豬瘟活病毒抗原、豬圓環病毒2型滅活抗原和豬肺炎支原體滅活抗原。[0008]豬 瘟活病毒抗原是指，包含至少一種在對豬給藥後能誘導、刺激或增強抗豬瘟病毒感染的免疫應答的抗原的任何組合物。優選地，本發明疫苗組合物中，所述豬瘟病毒為減毒形式的全病毒抗原，可以是選自細胞源豬瘟病毒、兔源豬瘟病毒、脾淋源豬瘟病毒中的一種或幾種。
[0009]優選所述豬瘟病毒抗原為豬瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原。所述豬瘟兔化弱毒株由中國獸醫藥品監察所保藏，保藏號AV1412。
[0010]優選地，本發明疫苗組合物中，所述的豬瘟病毒的含量為104_°~IO6 tlTCID5c/頭份，更優選地IO5 tlTCID5ci/頭份。
[0011]豬圓環病毒2型滅活抗原為選自豬圓環病毒2型全病毒抗原，含有豬圓環病毒2型免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有豬圓環病毒2型免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。優選所述豬圓環病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位成份。
[0012]本發明中，所述抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗PCV2感染的免疫應答。優選地，本發明疫苗組合物中，所述豬圓環病毒2型抗原為滅活形式的全病毒抗原，可以是江蘇南農高科豬圓環病毒2型滅活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北農豬圓環病毒2型滅活疫苗的DBN-SX07株、哈爾濱維科豬圓環病毒2型滅活疫苗的LG株、武漢科前豬圓環病毒2型滅活疫苗的WH株中的一種或幾種。
[0013]優選地，本發明疫苗組合物，豬圓環病毒2型抗原為滅活形式的豬圓環病毒2型SH株全病毒。所述豬圓環病毒2型SH株(Porcine Circovirus Type2, strain SH),在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏號為CGMCC N0.2389。
[0014]優選地，本發明疫苗組合物中，所述的滅活的豬圓環病毒2型滅活前含量為IO4 0 ~IO6.0TCID50/ 頭份，更優選地 IO5.0TCID50/ 頭份。
[0015]豬肺炎支原體抗原是指，包含至少一種在對豬給藥後能誘導、刺激或增強抗豬肺炎支原體感染的免疫應答的抗原的任何組合物。優選地，所述豬肺炎支原體抗原是豬肺炎支原體全細胞菌苗，優選滅活形式的豬肺炎支原體細菌，含有至少豬肺炎支原體的免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少豬肺炎支原體的免疫原性胺基酸序列的多肽或成分。優選地豬肺炎支原體抗原是滅活形式的J株或豬肺炎支原體HN0613株全細胞菌體。最優選地，豬肺炎支原體抗原是滅活形式的豬肺炎支原體HN0613株全細胞菌體。所述豬肺炎支原體 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏編號為:CCTCC NO:M2012230，保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)。保藏日期為2012年6月13日。
[0016]豬支原體肺炎抗原還可以包含以下疫苗組合物中的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的豬支原體肺炎滅活疫苗和西班牙海博萊生物大藥廠的喜可舒的J株、美國先靈葆雅公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Myco Silcnccr")、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株、梅裡亞動物保健公司的豬克喘的BQ14株、南京天邦豬肺炎支原體的168株、普萊柯豬肺炎支原體HN0613株中的一種或幾種。
[0017]優選地，本發明疫苗組合物中，所述的滅活的豬肺炎支原體滅活前含量為107_°~110 0MHDCE/頭份，更優選地108_°~IO9 ciMHDCE/頭份，更優選地IO9 ciMHDCE/頭份。[0018]優選地，所述疫苗組合物還包括疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為GelOl (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)中的一種或幾種的組合。本發明所用的疫苗佐劑優選水溶性疫苗佐劑，例如Ge IOI佐劑。
[0019]優選地，所述疫苗組合物還包括凍幹保護劑，所述凍幹保護劑優選為2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0020]本發明提供了一種製備所述疫苗組合物的方法，包括如下步驟:採用疫苗佐劑配製含豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將豬瘟病毒抗原與凍幹保護劑混合製備含豬瘟病毒抗原的組合物，然後用所述混合物稀釋所述含豬瘟病毒抗原的組合物，得含豬圓環病毒2型抗原、豬肺炎支原體抗原和豬瘟病毒抗原的三聯疫苗組合物。
[0021]優選地，先將豬肺炎支原體菌液和豬圓環病毒2型病毒液分別進行滅活，然後將滅活檢驗合格的豬肺炎支原體抗原和豬圓環病毒2型抗原分別進行濃縮，配苗，製備得到滅活苗部分；豬瘟病毒液加入凍幹保護劑，製備得到活苗部分，用所述滅活苗部分稀釋所述活苗部分，即得所述含有圓環病毒抗原、豬肺炎支原體抗原和豬瘟病毒抗原的三聯疫苗組合物。
[0022]優選地，所述滅活苗部分包含豬圓環病毒抗原、豬肺炎支原體抗原和GelOl佐劑，豬圓環病毒抗原含量為104_°~IO6 tlTCID5c/頭份，豬肺炎支原體抗原含量為107_°~110 0MHDCE/頭份，GelOl佐劑，基於所述滅活苗部分含量為12%(V/V);所述活苗部分中豬瘟病毒含量為104_°~IO6 tlTCID5ci/頭份，用所述滅活苗部分稀釋所述豬瘟活苗部分，優選1:1(頭份/頭份)，製成三聯混合疫苗。
[0023]本發明還提供一種所述疫苗組合物在製備預防或治療豬瘟、豬圓環病毒2型、豬支原體肺炎的藥品中的用途。
[0024]本發明提供的三聯用疫苗組合物與單一疫苗相比，聯合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、儲存乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的「冷鏈」，這種環環相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優越性。
[0025]本發明的豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體抗原組合物及使用該組合物製備的預防和治療豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體感染三聯疫苗，不會產生抗原成份的相互免疫幹擾或影響。預防和治療豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體感染的三聯疫苗與豬瘟、豬圓環病毒2型或豬肺炎支原體的單疫苗的效力相比，在對豬注射免疫過程中，豬體的應激反應出人預料地小，因此，本發明的三聯疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現的不良反應。
[0026] 此外，本發明提供的三聯疫苗組合物，製備方法簡單，疫苗的效價含量高，免疫方便快捷，與現有技術中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上三種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發明僅免疫I次就能夠預防豬瘟、豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體三種病原感染，降低了免疫成本，節約了免疫程序，更加經濟可靠。
【具體實施方式】[0027]以下配合本發明的優選實施例，進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段。
[0028]本發明所述「每頭份」或「/頭份」是指每頭豬每次用疫苗量。未作特別說明之處，在本發明的實施方式中所述「每頭份」或「/頭份」為2ml。本發明所述疫苗佐劑包括但不限於:Gel01 (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)，優選水溶性疫苗佐劑，例如GelOl (法國 SEPPIC)。
[0029]本發明所述凍幹保護劑的例子，包括但不限於:明膠水溶液、乳糖水溶液及其混合物，優選2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0030]實施例1豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的製備
[0031]I菌株來源
[0032]製造及檢驗本品用的豬圓環病毒2型毒株為PCV-2毒株SH株，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏號為CGMCCN0.2389 。
[0033]製造及檢驗本品用的豬肺炎支原體囷株為HN0613株，在中國典型培養物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012 年 6 月 13 日，保藏編號:CCTCC N0.M2012230。
[0034]製造及檢驗本品用的豬瘟病毒毒株為豬瘟兔化弱毒株(中國獸醫藥品監察所保藏，保藏號AV1412)。
[0035]2疫苗半成品的製備及檢驗
[0036]2.1生產用種子的製備
[0037]2.1.1豬肺炎支原體:
[0038]一級種子的繁殖:凍幹菌種(HN0613株，保藏編號為CCTCC N0.M2012230)，用液體培養基稀釋，劃線接種於固體培養基平皿上，置37°C培養7d，選擇生長良好的菌落，接種於固體培養基斜面上，37°C培養7d，作為一級種子。
[0039]二級種子的繁殖:取少量液體培養基洗一級種子的斜面培養物，接種於液體培養基大管中，置37°C培養7d，經檢驗純粹後作為二級種子。
[0040]2.1.2豬圓環病毒2型:將毒種用MEM液體培養基作1:9稀釋，然後按細胞培養液體積的5% (V/V)接種於PK15細胞(購自中國獸藥監察所)培養，37°C吸附30分鐘，加入含4% (V/V)體積犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細胞維持液，37°C培養4曰，凍融2~3次,收穫病毒,作為生產用毒種。
[0041]2.1.3豬瘟病毒:用細胞維持液，將新鮮脾毒製成0.3% (V/V)~0.5% (V/V)的病毒懸液，接種生長良好的ST細胞，置36~37°C繼續培養。每隔4~5天收穫換液一次，取二收、三收細胞培養毒液，經安全性、純淨性和特異性檢驗合格後，作為生產用毒種。在_15°C以下保存，不超過6個月。
[0042]2.2制苗用菌液和病毒液的製備
[0043]2.2.1豬肺炎支原體菌液的製備:將液體培養基培養的豬肺炎支原體二級種子液以1:10 (v/v)接種於液體培養基中。37°C下培養3飛日，培養物下降0.5個pH值以上，純粹檢驗合格後，再以同樣的方式擴大培養(繼代次不超過6代)。培養結束後，取樣，進行純粹檢驗應純粹。
[0044]2.2.2豬圓環病毒2型液的製備:用轉瓶細胞培養法。將長滿單層的PK15細胞(購自ATCC)，倒去細胞培養液，將毒種液按細胞培養液體積5%的接種量接種於PK15細胞上，輕輕旋轉細胞瓶2周，37°C吸附30分鐘，加入細胞維持液，置37°C旋轉(10-12轉/小時)培養。每日觀察廣2次，細胞生長良好，37°C培養4日收穫細胞和細胞液，凍融3次，置-20°C以下保存，應不超過2個月。
[0045]2.2.3豬瘟病毒液的製備:取已形成良好單層的ST細胞培養瓶，棄去營養液，接種含3% (V/V)~5% (V/V)生產用細胞毒種的維持液，置36~37°C後繼續培養。接毒後5天作第一次收穫換液，以後每隔4天收穫換液I次。各收次病毒培養液分別取樣檢驗，應符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標準規定。收穫的病毒液置_15°C以下保存，應不超過3個月。
[0046]2.3含量測定
[0047]2.3.1豬肺炎支原體菌體含量測定:用PCR方法對培養物進行計數。10倍系列稀釋所檢培養物，然後做PCR，PCR檢出的最低限量為3Χ10_3μ8 (相當於1000個左右的菌體)，按稀釋的倍數計數菌體數(沈青春，譚青松，王琴等人，PCR方法測定Mhp培養物菌數[J]，中國預防獸醫學報,2006,28(1):55~57)。培養物含量應為I~2X 109MHDCE/ml。(MHDCE=豬肺炎支原體DNA細胞等同物，即IMHDCE相當於I個豬肺炎支原體)。
[0048]2.3.2豬圓環病毒2型含量測定:將病毒液用MEM維持液做10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10_73個稀釋度，每個稀釋度分別接種96孔培養板PK15細胞單層4孔，每孔0.1ml,同時設立陰性對照，在37°C含5% (V/V) CO2的溫箱中繼續培養24小時，換含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續培養24小時；用冷丙酮固定細胞，用間接免疫螢光試驗(IFA)測定每個稀釋度含有PCV-2陽性細胞(呈綠色)的孔數，根據Karber氏法計算病Μ TCID500 每 ml 病毒含量應≥ IO5 5TCID5tltj
[0049]2.3.3豬瘟病毒含量測定:各收次病毒培養液分別採用間接免疫螢光法進行TCID5tl測定。每ml病毒含量應≥IO6-5TCID500
[0050]2.4 滅活
[0051]2.4.1豬圓環病毒2型液的滅活:將檢驗合格病毒液，按病毒液總量加入終濃度為0.2%的甲醛溶液(V/V)，隨即充分搖勻升溫，當溫度升至37°C時開始計時，保持18小時滅活完畢，加入0.2wt%的焦亞硫酸鈉終止滅活,取樣進行滅活檢驗。
[0052]2.4.2豬肺炎支原體菌液的滅活:將檢驗合格的豬肺炎支原體菌液，按菌液體積總量緩慢加入終濃度為0.2%的甲醛溶液(V/V)，放37°C滅活，其間每隔4小時攪拌一次，24小時後取出，進行滅活檢驗。
[0053]2.5 濃縮
[0054]將滅活檢驗合格的豬肺炎支原體菌液和豬圓環病毒2型液分別採用超濾濃縮技術進行濃縮，濃縮後抗原含量分別為10nMHDCE/ml，107 0TCID50/mL.[0055]實施例2豬瘟、豬圓環和豬肺炎支原體三聯混合疫苗組合物的製備
[0056]I豬圓環和豬肺炎支原體二聯滅活疫苗製備
[0057]1.1防腐劑的配製
[0058]1% (w/v)的硫柳萊水溶液:lg硫柳萊溶解於100mL純化水，121°C高壓滅菌30min備用。[0059]1.2稀釋劑的配製
[0060]無菌的PBS緩衝溶液:在900ml純化水內溶解8g氯化鈉、0.25g氯化鉀、3.63g磷酸氫二鈉、0.24g磷酸二氫鉀，然後定容至1L，121°C高壓滅菌30min備用。
[0061]1.3疫苗佐劑處理
[0062]GelOl (法國SEPPIC)佐劑滅菌:將GelOl (法國SEPPIC)佐劑轉入可滅菌容器內，121 °C高壓滅菌30min備用。
[0063]1.4 配苗
[0064]通過無菌操作，將實施例1中製備的濃縮豬圓環和豬肺炎支原體抗原與佐劑、稀釋劑等按照不同配比混合後，用乳化機低速，例如在轉速為10-12轉/h下攪拌30min。滅活疫苗部分豬圓環病毒抗原含量為104_°~IO6 tlTCID5ci/頭份，豬肺炎支原體抗原含量為IO7 0~IOici ciMHDCE/頭份，GelOl佐劑，基於所述滅活苗部分含量為12% (V/V)。
[0065]2豬瘟疫苗的製備
[0066]將檢驗合格的豬瘟各收次病毒液，混合於同一容器，分別取適量混勻的病毒液進行濃縮和稀釋，加入凍幹保護劑(2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例配製)以1:1 (v/v)比例混合後充分混勻，定量分裝，迅速進行冷凍真空乾燥，製成每頭份病毒含量分別為 104_°TCID5(1、IO5 tlTCID5ci 和 IO6 tlTCID5ci 的活疫苗部分。
[0067]3三聯苗的製備
[0068]將實施例1中所製備的濃縮抗原按照表1的配比進行疫苗配製。使用前取滅活苗部分稀釋活苗部分。
[0069]表1疫苗配比具體實施案例
[0070]
【權利要求】
1.一種疫苗組合物，其特徵在於，含有豬瘟病毒抗原、豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原。
2.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟活病毒抗原，優選為豬瘟病毒兔化弱毒株全病毒。
3.根據權利要求1或2所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬圓環病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位成份。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體滅活抗原，優選為滅活的全細胞菌體。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬瘟病毒含量為IO4-0~IO6 tlTCID5ci/頭份，所述豬肺炎支原體含量為107_°~IOici ciMHDCE/頭份，所述豬圓環病毒2型含量為IO4 0~IO6 0TCID50/頭份。
6.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述疫苗組合物還包括疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為GelOl (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol )、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)中的一種或幾種的組合。
7.根據權利要求1所述 的疫苗組合物，其特徵在於，所述疫苗組合物還包括凍幹保護劑，所述凍幹保護劑為2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例混合所得的混合物。
8.一種製備疫苗組合物的方法，其特徵在於，包括如下步驟:採用疫苗佐劑配製含豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將豬瘟病毒抗原與凍幹保護劑混合製備含豬瘟病毒抗原的組合物，然後用所述混合物稀釋所述含豬瘟病毒抗原的組合物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述豬圓環病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物為二聯滅活疫苗，所述含豬瘟病毒抗原的組合物為凍幹活疫苗。
10.權利要求1~7中任一項所述的疫苗組合物在製備預防和/或控制豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體混合感染的藥品中的應用。
【文檔編號】A61K39/02GK103908665SQ201310001446
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月5日 優先權日:2013年1月5日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司