一種檢測海水氮限制的微藻分子生物學方法
2023-05-13 17:28:36
專利名稱：一種檢測海水氮限制的微藻分子生物學方法
技術領域：
本發明涉及一種海水氮限制的檢測方法，採用實時螢光定量PCR的方法對中肋骨條藻硝酸鹽轉運蛋白基因進行定量檢測，屬於分子檢測技術領域。
背景技術：
近幾十年來，隨著人類活動的加劇，我國近海海域中營養鹽尤其是N、P的含量急劇增高，海水富營養化現象逐年加重。營養鹽濃度和結構分別對浮遊植物的生物量及種類組成有重要影響。對浮遊植物的營養狀態進行準確的評價，將有助於預測赤潮的發生動態。在眾多營養鹽中，常被認為是限制性的營養元素有氮、磷及金屬微量元素如鐵等， 其中氮是生物細胞中不可或缺的重要元素之一。在以往評價浮遊植物氮限制的研究中， 常見的方法包括營養鹽濃度比例、營養鹽添加實驗及1N標記跟蹤氮攝取率等(Dugdale and Wilkerson 1986 ；Kilham andHecky 1988 ；Collos et al. 1993)。這些傳統的研究手段雖然有助於了解浮遊植物與氮缺乏之間的相互關係，但是仍然存在一些不足之處。自然海水中浮遊植物種類組成複雜，不同藻種對營養鹽的需求存在很大差異，所以使用群落全體生長率或生產力來評估浮遊植物收營養鹽限制的做法並不恰當。且在傳統的評估方法中，會先將大型浮遊動物濾去以去除捕食者效應，再將浮遊植物置於容器中進行培養，這種做法往往會帶來一定的「培養瓶效應」(Dugdale and Wilkerson 1986 ；Fogg and Calvariomartinez 1989 ；Colloset al. 1993)。隨著分子生物學技術的發展，基因水平上的研究在海洋生態學中的應用越來越廣泛。利用分子手段，對現場採集的樣品直接分析，避開了培養過程帶來的「培養瓶效應」，可對浮遊植物的氮限制狀態進行更準確的評價。浮遊植物在受到營養鹽限制時所呈現的細胞生理反應大致可分為以下三類 (Straus, 1994 ；La Roche et al. 1999)削減(retrenchment)或向下調節生理代謝速率、 補償作用(compensation)、獲取作用(acquisition)。 Nicolausvon Wiren (1997)指出高等植物在缺氮時會誘導增加對硝酸鹽及銨的攝取能力，也就是說細胞會發展出對氮營養鹽更有效的攝取系統(第三類生理反應)。而硝酸鹽及銨的攝取則必須經由細胞膜上的運輸蛋白進行轉運才能進入細胞內，因此通過測定硝酸鹽及銨鹽轉運蛋白基因的表達量即可對細胞氮缺乏進行有效評估。至今已在多種浮遊植物中發現硝酸鹽轉運蛋白基 @ (Hildebrand&Dahlin,2000 ；Michael Koltermann, 2003 ；Qinghua He,2004 ；Bongkeun Song, 2007)，都屬於NRT2家族，可以轉譯出高親和力硝酸鹽轉運蛋白，在缺氮或低硝酸鹽濃度下負責硝酸鹽的轉運。中肋骨條藻是廣溫廣鹽的典型代表，分布極廣，是我國沿岸水域常見種，多在夏末秋初形成優勢種，並引發赤潮。因此，通過研究中肋骨條藻硝酸鹽轉運蛋白基因的表達水平，能夠對水體中氮營養鹽的限制狀況進行準確評估。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種檢測海水中氮限制的微藻分子生物學方法，用於精確評估水體中浮遊植物的N限制狀況，預測浮遊植物的生長乃至赤潮的發生動態。一種檢測海水水體中氮限制的微藻分子生物學方法，包括以下步驟a.採集生長有中肋骨條藻的待檢測海水，提取RNA並反轉錄，得到cDNA ；b.以所得cDNA為模板，硝酸鹽轉運蛋白基因(NRT)為目的基因，ISSrRNA為內參基因，進行real-time PCR，測定NRT基因的表達量；C.根據NRT基因的表達量判斷水體中氮營養鹽的限制情況；硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量隨著硝酸鹽濃度的降低而升高，二者呈負相關關係，因此可以根據中肋骨條藻硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量對水體中氮限制的狀況作出準確定性評價。所述步驟b中，實時螢光定量PCR反應體系為採用STOR Green I染色法進行實時螢光定量PCR，其PCR混合液包括10 μ 1 SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10 μ Μ)各0. 4 0. 6μ 1, Rox Reference Dye 0. 4μ 1, cDNAlO IOOng,以去離子7jC校ιΕ至 20 μ 1 的最終體積；硝酸鹽轉運蛋白基因NRT的real-time引物序列為SCNRTfp5，-GGAGGATTCG TCTCTGACAAGG-3，，SCNRTrp5' -TATGGAACAATACCGTACGATGATC-3，； 18rRNA 引物序列為 SC18SrRNAfp 5』-AGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT-3』，SC18SrRNArp5' -GTTTGATGAACTGCGATTACT AGGA-3，。所述步驟b中實時螢光定量PCR的反應程序為95°C 5min ；接著進行40個循環， 每個循環包括95°C 5s,60°C 31s ；反應完成後進行溶解曲線分析95°C 15s,60°C lmin，然後緩慢升溫至95 °C，連續記錄螢光信號的變化。所述步驟c中NRT基因表達量的計算採用2_ΔΔ"法，表達量越高表明該水體N限制作用越明顯；硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量與初始的硝酸鹽濃度之間的關係為y =-1. 2147X+225. 52，R2 = 0. 9888，公式中y表示硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量，χ表示初始硝酸鹽濃度。本發明主要以中肋骨條藻為指示藻種，根據其硝酸鹽轉運蛋白基因的相對表達量來指示水體中氮限制的程度。本發明提供了一種估算海水中氮限制的新方法，可預測浮遊植物的生長乃至赤潮的發生動態。本發明的優點在於，應用分子生物學技術來研究浮遊植物受N限制的狀況，花費時間少，精準度高，應用上不需經過培養，直接對採樣所得的細胞進行分析，避開培養瓶效應帶來的負面影響。
圖1為本發明實施例所述中肋骨條藻cDNA的SCNRT及SC18SrRNAPCR擴增圖，圖中l、DL2000DNAMarker ；2、SCNRT ；3、SC18SrRNA。圖2為本發明實施例所述中肋骨條藻培養4 後硝酸鹽轉運蛋白基因的表達水平與初始硝酸鹽濃度之間的關係。圖3為本發明實施例所述cDNA的SCNRT PCR擴增圖，圖中1、DL2000DNA Marker ；2、中肋骨條藻；3、東海原甲藻；4、塔瑪亞歷山大藻；5、赤潮異彎藻；6、新月菱形藻；7、柔弱角毛藻；8、錐狀斯氏藻；9、偽矮海鏈藻；10、旋轉角毛藻；11、球等邊金藻；12、強壯前溝藻； 13、米氏凱倫藻。
具體實施例方式1.設計引物的有效性驗證中肋骨條藻的培養液的配製方法首先將天然海水經孔徑為0. 45 μ m的混合纖維濾膜過濾，置於高壓滅菌鍋中121°C高溫高壓滅菌20min，室溫冷卻後按照f/2改良海水配方(Guillard 1993)添加除硝酸鹽以外的營養鹽，硝酸鹽的添加量為10% f/2，即88. 3 μ M， 培養液具體組分及濃度見表1。接種中肋骨條藻，並培養至對數生長期。表1培養液中具體組分及摩爾濃度
權利要求
1.一種檢測海水水體中氮限制的微藻分子生物學方法，其特徵在於包括以下步驟a.採集生長有中肋骨條藻的待檢測海水，提取RNA並反轉錄，得到cDNA；b.以所得cDNA為模板，硝酸鹽轉運蛋白基因為目的基因，ISSrRNA為內參基因，進行 real-time PCR，測定NRT基因的表達量；C.根據NRT基因的表達量判斷水體中氮營養鹽的限制情況；硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量隨著硝酸鹽濃度的降低而升高，二者呈負相關關係，因此可以根據中肋骨條藻硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量對水體中氮限制的狀況作出準確定性評價。
2.根據權利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特徵在於所述步驟b中，實時螢光定量PCR反應體系為採用STOR Green I染色法進行實時螢光定量PCR，其PCR混合液包括10 μ 1 SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10 μ M)各0. 4 0. 6μ 1, Rox Reference Dye 0. 4μ 1, cDNAlO IOOng,以去離子7jC校ιΕ至 20 μ 1 的最終體積；硝酸鹽轉運蛋白基因的real-time引物序列為SCNRTfp5，-GGAGGATTCGTCTCTGACAAGG -3，，SCNRTrp5，-TATGGAACAATACCGTACGATGATC-3，； 18rRNA 引物序列為SC18SrRNAfp5，-AG GTCTGTGATGCCCTTAGATGT-3』，SC18SrRNArp5' -GTTTGATGAACTGCGATTACTAGGA-3』。
3.根據權利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特徵在於所述步驟b中實時螢光定量PCR的反應條件為95°C 5min ；接著進行40個循環，每個循環包括95°C 5s,60°C 31s ； 反應完成後進行溶解曲線分析95°C 15s,60°C lmin，然後緩慢升溫至95°C，連續記錄螢光信號的變化。
4.根據權利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特徵在於所述步驟c中NRT基因表達量的計算採用2_Δ Δε 法，表達量越高表明該水體N限制作用越明顯；硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量與初始的硝酸鹽濃度之間的關係為y = -1.2147x+225. 52，公式中y表示硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量，χ表示初始硝酸鹽濃度。
全文摘要
本發明涉及一種檢測海水氮限制的微藻分子生物學方法，主要以中肋骨條藻為指示藻種，根據其硝酸鹽轉運蛋白基因的相對表達量來指示水體中氮限制的程度。主要包括以下步驟a.提取中肋骨條藻RNA並反轉錄為cDNA；b.以硝酸鹽轉運蛋白基因為目的基因，以18S核糖體RNA基因為內參基因，採用SYBR Green I染料染色法實時螢光定量硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量；c.通過比較不同區域硝酸鹽轉運蛋白基因的表達量對水體氮限制的狀況進行評價。本發明提供了一種估算海水中氮限制的新方法，預測浮遊植物的生長乃至赤潮的發生動態。
文檔編號C12Q1/68GK102399857SQ20101028014
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者俞志明, 劉雲, 宋秀賢, 曹西華 申請人:中國科學院海洋研究所