含有imp脫氫酶基因的dna及其應用的製作方法

2023-05-16 13:54:41 2

專利名稱：含有imp脫氫酶基因的dna及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生產次黃苷和/或鳥苷的改良方法，用於該方法的新的微生物以及用於衍生該新微生物的新DNA。所說的次黃苷和/或鳥苷可用作生產5′-次黃苷酸(5′IMP)和5′-鳥苷酸(5′-GMP)的原料，後者則分別是日本木魚(乾燥的鰹魚)和香茹的香味成分。
現有技術中，已使用了屬於芽孢桿菌屬(美國專利3，960，661號、日本專利公開57-41915號和美國專利4，701，413號)、短桿菌屬(美國專利3，736，228號)及其他有需要腺嘌呤之性質並且最好具有各種藥物抗性的細菌，發酵生產次黃苷。另外，也已使用屬於芽孢桿菌屬(美國專利3，912，587和美國專利4，283，346)、短桿菌屬(日本專利公開58-17592號)等的細菌生產鳥苷。然而，因為次黃苷和鳥苷是通過共同的生物合成途徑產生的，所以有時在培養次黃苷生產菌時同時會產生鳥苷，或相反在培養鳥苷生產菌時可伴隨鳥苷產生大量的次黃苷。在這種情況下，為了由培養液中分離次黃苷或鳥苷，需要使用複雜的純化工藝。
為此，有人提出了使用含有質粒的轉化體生產鳥苷的方法，其中使用了近年發展的重組DNA技術，將編碼在鳥苷生物合成途徑中起重要作用之IMP脫氫酶基因的DNA連接到所說的質粒中(美國專利4，749，650號)。
另一方面，為了抑制副產物鳥苷的生成，還有人提出了利用重組DNA技術衍生IMP脫氫酶缺陷性菌株的方法(歐洲專利公開273660A號)。
但是，即使後兩種方法，與次黃苷和鳥苷在食品工業中的重要性相比，仍不能令人滿意。前者因為使用了質粒，故從生產的穩定性來看仍是不能令人滿意的，而後者則需要不停地提供微生物生長所必需的黃嘌呤。因此，期望建立一種生產次黃苷和/或鳥苷的改良方法。
本發明的一個目的是提供一種生產次黃苷和/或鳥苷的改良方法。
本發明的另一個目的是提供一種用於本發明方法的、屬於芽孢桿菌屬的新微生物。
本發明的再一個目的是提供一個用於衍生本發明之新微生物的含有IMP脫氫酶基因的新DNA。
本領域的熟練技術人員將會根據下文參照附圖所作的描述，進一步了解本發明的這些目的和其他目的以及本發明的優點。


圖1圖解顯示了下文實施例1中所述質粒pEX214的構建。
圖2-1到2-3圖解顯示了IMP脫氫酶基因的DNA順序。
圖3圖解顯示了下文實施例1中所述質粒pEX214△3的構建，及位於IMP脫氫酶基因5′上遊之連接位點鄰近區的DNA順序。
圖4圖解顯示了下文實施例1中所述質粒pEX241的構建。
圖5圖解顯示了下文實施例1中所述質粒pEX242的構建。
圖6圖解顯示了下文實施例1中所述質粒pEX210的構建。
附圖中，符號P、X、H、Sm、S、E、Sa、K、C、Ms、Mb、N和M分別代表限制性酶PstⅠ、XbaⅠ、HincⅡ、SmaⅠ、SspⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、ClaⅠ、MspⅠ、MboⅠ、NruⅠ和MluⅠ的酶切位點。符號(f)表明其末端被轉變成平頭。加陰影部分是IMP脫氫酶基因區、空白部分是IMP脫氫酶基因的相鄰區域，黑色部分是SPO1-26啟動子，粗實線是氯黴素乙醯轉移酶基因區，實線是載體區域。
本發明人已注意到這樣一個事實，即生產菌的IMP脫氫酶活性與積聚的鳥苷量密切相關，從而深入地研究了增加鳥苷或次黃苷之產率的方法，即通過酶基因的高表達以選擇性地積聚大量鳥苷，或相反通過基因的低表達以選擇性地積聚大量次黃苷。
使用重組DNA技術，本發明人已成功地得到了一種新的微生物，該微生物系衍生於能夠產生次黃苷或次黃苷與鳥苷的微生物菌株，其中染色體上編碼IMP脫氫酶基因之DNA的啟動子部分被允許目的基因在該微生物菌株中高表達的不同的啟動子所取代，另外也已由能夠產生次黃苷和鳥苷、或次黃苷與黃苷，或黃苷和/或鳥苷的微生物菌株衍生得到了另一株新微生物，其中染色體上編碼IMP脫氫酶基因之DNA的啟動子部分被允許目的基因在該微生物菌株中進行低表達的不同的啟動子所取代。
其後發現，按上述技術，使用選自芽孢桿菌屬細菌的微生物(作為接受體)製得的新微生物，能夠大量積聚鳥苷(或次黃苷)，因為在其染色體DNA上已整合了具有允許高(或低)表達目的產物之啟動子的IMP脫氫酶基因，從而可以分別非常穩定地生產次黃苷和/或鳥苷。
已基於上述發現完成了本發明，並提供了含有芽孢桿菌屬微生物染色體之IMP脫氫酶基因的DNA，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被不同的可表達啟動子所取代。此外，本發明還提供了其中整合了本發明之DNA的載體、用本發明的DNA或載體轉化的能夠產生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物、以及生產次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養基中培養本發明的芽孢桿菌屬微生物，以產生和積聚次黃苷和/或鳥苷並收集所得產物。
用於本發明的含有IMP脫氫酶基因區域的DNA，最好含有全部編碼該酶基因的DNA，以及其上遊和下遊的某些外周部分。但它可以含有開放讀碼之5′上遊部分的DNA，包括酶的轉譯起始位點、SD順序、啟動子及其某些5′上遊區。
這樣一個DNA順序通常是用重組DNA技術由微生物的染色體DNA中分離的。作為用於這一目的的宿主-載體系統，可使用一般常用的EK系統。即其中作為宿主，可使用衍生於大腸桿菌K-12菌株的微生物，如大腸桿菌C600(T.Maniatisetal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1982，PP.504)、大腸桿菌JA221(IFO14359，ATCC33875)、大腸桿菌MM294(ATCC33625)〔Proc.Natl.Acad.Scl.USA，73，4174(1976)〕或其衍生株。作為載體，可使用質粒PBR322、pACYC184、pACYC177、pUC18、pUC19、pHSG396、pHSG298等。
另外，可使用由噬菌體載體如Charon4A(MolecularCloning，pp.31)、EMBL3和EBML4(J.Mol.Biol.，170，827)等與大腸桿菌DP50SupF(MolecularCloning，pp.504)、大腸桿菌NM538和NM539(J.Mol.Biol.，170，827)、大腸桿菌LE392(J.Biol.Chem.，218，97)等宿主結合的宿主-載體系統。當然，也可使用以芽孢桿菌屬微生物如枯草芽孢桿菌MI114(Gene，24，255)或其突變體作宿主，並以具有在芽孢桿菌屬微生物中自主複製能力的質粒如PUB110、pC194、pE194、pS194、pSA2100、pHY300PLK等作載體的宿主-載體系統。
原則上，只要微生物之IMP脫氫酶基因的鹼基順序與下文所述用作接受體的芽孢桿菌屬微生物之染色體上IMP脫氫酶基因的鹼基順序有高度同源性，均可以使用，而不必受IMP脫氫酶基因之供體微生物來源的限制。其中，當使用芽孢桿菌屬微生物時，可實現所謂的自身克隆並因其易於操作，故應優先選用。還期望所得到的轉化體是穩定的。再者，供體不一定能產生次黃苷、鳥苷、黃苷或其嘌呤鹼基。但該供體最好沒有IMP脫氫酶缺陷。
這種供體微生物的例子包括枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)、短小芽孢桿菌(B.Pumilus)或地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)。更具體地說，可包括下列微生物菌株枯草芽孢桿菌№168(BGSClAl)、枯草芽孢桿菌№.115(IFO14187，FERMBP-1327)、枯草芽孢桿菌MI114(Gene，24，255)、短小芽孢桿菌ATCC7061和地衣芽孢桿菌ATCC14580(BGSC是BacillusGeneticStockGenter，IFO是InstituteofFermentation，Osaka，ATCC是AmericanTypeCultureCollection)。
可按照美國專利4，749，650號中所述的方法由這些供體微生物中分離含IMP脫氫酶基因的DNA。另外，按照歐洲專利公開273660A號中所述的方法，可由供體微生物的基因庫中篩選一個能補償IMP脫氫酶缺陷型芽孢桿菌突變體對黃嘌呤之需求的重組體，從而得到含有IMP脫氫酶基因的DNA，所說的重組體的染色體上具有與下文所述用作接受體的芽孢桿菌屬微生物高度同源的IMP脫氫酶基因DNA順序。
可利用重組DNA技術，使用大腸桿菌的宿主-載體系統，由如此得到的含IMP脫氫酶基因的DNA中製備和分離本發明的新DNA。
可按下述方法由含IMP脫氫酶基因的質粒中製備和分離本發明的新DNA。
在下述的於大腸桿菌內製備本發明DNA的步驟中，為實驗方便起見，可在新的載體內再克隆該DNA片段，或者將其連接到多聚接頭下遊。為此，最好利用大腸桿菌載體PUC119的多聚接頭進行再克隆，這樣，新DNA的製備和DNA順序的測定均可比較方便地完成。
首先，由含有IMP脫氫酶基因的DNA中製備缺失啟動子區的DNA片段。為此，可按下述程序進行用只有一個切點的限制性酶切割含IMP脫氫酶基因的質粒，所說的酶切點位於啟動子上遊並在靠近啟動子的位置上。然後用從其末端依次切斷雙股DNA的酶，如BAL31消化已在切點被切斷了的質粒，刪除IMP脫氫酶基因的上遊區，得到剪短的DNA片段。這種情況下，為得到正好刪除了IMP脫氫酶基因之啟動子的DNA片段，可利用不同量的內切酶和控制不同的反應時間製得有不同長度的DNA片段，然後藉助下文所述的適當方法，如根據對片段的DNA順序測定結果，由其中篩選出所需的DNA片段。測定DNA順序時，可將DNA片段再克隆到適用於該目的的載體中，如M13、PUC118或PUC119中，然後用已知方法F.Sanger等人(Proc，Natl.Acad.Sci.USA，74，5463)的方法進行DNA順序測定。
可按下述程序將一不同的啟動子插入如此得到的DNA中IMP脫氫酶基因開放讀碼的上遊(即SD順序的上遊)區內。使用只有一個切點的限制性酶切斷質粒，該酶切點位於含IMP脫氫酶基因之質粒的開放讀碼的上遊(SD順序的上遊)，且質粒中的啟動子已按常規方法刪除。另一方面，由含啟動子順序的DNA中切掉一個能在下文所述接受體內表現有啟動子活性的DNA片段，並根據需要用瓊脂糖凝膠電泳法分離和提取之。然後，混合已被切割的質粒和DNA片段，如果粘性末端是相同的，即可用T4DNA連接酶將它們連接起來;如果它們的末端不同，則可用T4DNA聚合酶將其轉變成平頭，並用T4DNA連接酶連接之。這樣便得到了所需的DNA。
在這種情況下，如果IMP脫氫酶基因之5′相鄰區的一部分被連接到已被置換的啟動子的5′上遊，則將是有利的，因為此時在下文所述之接受體的染色體上重組後，發生了雙交換型(doublecrossing-overtype)重組。
作為切割含IMP脫氫酶基因之質粒的限制性酶，可以使用任何一種在IMP脫氫酶基因的上遊區只有一個切點的限制酶。具體地說，最好選擇在IMP脫氫酶基因之啟動子的5′上遊區特別是在接近啟動子的位置有一個酶切點，而不會在任何其他部位切斷質粒的酶。另外，當插入不同的啟動子時，可選用在IMP脫氫酶基因之開放讀碼和SP順序的5′部分，並與之接近的位置，有一個酶切位點，而不會在任何其他部分切斷質粒的酶。適用的酶包括AflⅡ、ApaⅠ、AxyⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、BstEⅡ、ClaⅠ、EcoRⅠ、Eco8lⅠ、HpaⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、MluⅠ、NcoⅠ、PstⅠ、SacⅠ、SacⅡ、SalⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、SplⅠ、SspⅠ、StuⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ等。
對用於本發明的啟動子沒有特別地限制，只要它有一個能在用於繼後步驟的接受體內表達的DNA順序，不管其來源(即原核生物的、真核生物的或合成的DNA)如何，均可使用。這些啟動子包括得自芽孢桿菌屬細菌之染色體的、得自芽孢桿菌屬細菌之噬菌體的、或得自能在芽孢桿菌屬細菌細胞內自主複製之質粒的啟動子，其可允許基因比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因有更強的表達(高表達)，或者使基因比芽胞桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因有更弱的表達(低表達)。更具體地說，高表達的啟動子包括那些用Magasanik所述方法(Magasanik，B.，「MethodinEnzymology」，Vol.VI，PP.106-111，AcademicPress，NewYork，USA)，在每分鐘，每毫克蛋白質形成1.5nmolXMP的情況下檢測時，具有每分鐘，每毫克蛋白質至少形成7.5nmolxMP的正常IMP脫氫酶活性的啟動子。低表達的啟動子包括那些於同樣條件下檢測時，具有每分鐘，每毫克蛋白質至多形成0.5nmolXMP的IMP脫氫酶活性的啟動子。其特定實例如下高表達的啟動子AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACASPO1-15〔Lee，GAndPero，J.J.Mol.
Biol.，152，247(1981)〕AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAACSPO1-26〔Leeetal.，Mol.Gen.
Genet.，180，57(1980)〕GAAAAGTGTTGAAAATTGTCGAACAGGGTGATATAATAAAAGAGTAφ29G36〔Marray，C.L.andRobinowitz，J.C.，J.Biol.Chem.，257，1053(1982)〕GAAAAGGGTAGACAAACTATCGTTTAACATGTTATACTATAATAGAAφ29G2〔Yoshikawa，H.etal.，Proc.
Natl.Acad.Sci.，USA，78，1336(1981)〕ATTAATGTTTGACAACTATTACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATCφ29Al〔Yoshikawa，H.etal.，Proc.
Natl.Acad.Sci.，USA，78，1336(1981)〕TAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAAPuroperon〔Ebbole，D.J.andZalkin，H.，J.Biol.Chem.，262，8274(1987)〕
低表達的啟動子AATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTVeg〔Moran，C.P.，Jr.etal.，Mol.
Gen.Genet.，186，339(1982)〕AAGTCTCCTTGAAATCAGAAGATATTTAGGATATATTTTTCTATGGtms〔Moran，C.P.，Jr.etal.，Mol.
Gen.Genet.，186，339(1982)〕AAAAACGGTTGCATTTAAATCTTACATATCTAATACTTTCAAAGACPenp〔Himeno，T.etal.，J.
Bacteriol.，168，1128(1986)〕CAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCcat〔Horinovichi，S.andWeisblum，B.，J.Bacteriol.，150，815(1982)〕AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAAAACATTTACTTCCATGGAAATGATGATAGATTAATTTTTAAGAAAAAGAACTGGTAATTCGCGAATTATGAAAAAGCGCTTTTTCTGCAPl〔K.Nakahamaetal.，Gene，36，179(1985)〕可由含有所說的啟動子的DNA(質粒)上將其切下來，然後用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯醯胺凝膠電泳法分級分離並回收之。另外，可使用市場上出售的DNA合成儀(如美國AppliedBiosystems公司製造的儀器)，依照磷醯胺方法合成有上述啟動子的鹼基順序的DNA。
為了大量獲得本發明的新DNA，然後用上述加有T4DNA連接酶的連接反應混合物轉化需要黃嘌呤的宿主微生物，以得到轉化體，其中，宿主微生物對黃嘌呤的需要通過取代的啟動子的表達得到補償。可按照已知方法，如「MolecularCloning」一書第86-93頁中所述的方法，由轉化體大量生產該DNA。
可按常規方法用限制酶切割上述方法製得的質粒，用瓊脂糖凝膠電泳法分離，然後再用電泳洗脫等方法提取和分離，可從質粒中分離出含IMP脫氫酶基因(其中啟動子已被置換)的DNA。
以下描述用新DNA轉化接受體以衍生新微生物的方法。
作為進行這種轉化的接受體，可使用任何一種微生物，在該微生物內可摻入某細胞外線性DNA並在其與該DNA的鹼基順序有高度同源性的染色體上發生部分重組，以改變其遺傳性徵，即任何具有這種轉化能力的微生物均可使用。該微生物不一定與IMP脫氫酶基因的供體完全相同，而只要其染色體DNA的鹼基順序與上述線性DNA中所含有的IMP脫氫酶基因的鹼基順序高度同源即可。為製備有產生次黃苷和/或鳥苷之能力的轉化體，從已知的觀點看，芽孢桿菌屬的細菌如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌等都是適用的，即它們可積聚兩種或多種嘌呤核苷酸及其相關物質，如次黃苷、鳥苷和黃苷，它們具有轉化的能力，沒有致病性，並且長久以來已被安全地用於發酵工業中。
此外，在許多情況下，當為上述用作接受體的微生物提供適於積聚嘌呤核苷酸及其相關物質的一種或多種已知特性，如嘌呤類似物抗性(如8-氮雜鳥苷抗性)、核苷酸磷酸化酶缺陷、5′-鳥苷酸還原酶缺陷、葉酸拮抗物抗性時，可望獲得進一步改善的效果。
芽孢桿菌屬接受體的例子包括枯草芽桿菌BM1032(IFO14559，FERMBP-1242)枯草芽孢桿菌1A3(BGSC№1A3)枯草芽孢桿菌NA-6011(IFO14189，FERMBP-291)枯草芽孢桿菌NA-6012(IFO14190，FERMBP-292)枯草芽孢桿菌NA-6128(IFO14373，FERMBP-617)枯草芽孢桿菌NA-7821(IFO14368，FERMBP-618)枯草芽孢桿菌ATCC19221枯草芽孢桿菌ATCC14662短小芽孢桿菌(FERMP-2116)短小芽孢桿菌(FERMP-4832)短小芽孢桿菌(FERMP-4829)地衣芽孢桿菌IFO12485當用本發明的新DNA轉化芽孢桿菌屬微生物時，可使用在質粒中以整合形式存在的DNA。但一般說來，最好使用切割質粒或切下本發明的DNA後得到的線性DNA。
可按照已知方法〔C.AnagnostopoulosandJ.Spizien，J.Bacteriol.，81，741(1961)〕用該線性DNA片段轉化芽孢桿菌屬的微生物。
為了有效地得到本發明的轉化體，可以預先切掉接受體IMP脫氫酶基因的全部或部分啟動子，使之成為需要黃嘌呤的菌株。然後在不含黃嘌呤的瓊脂平板上接種並培養之，即可由大量接受體微生物細胞中篩選出所需的轉化體，因為用本發明的DNA轉化的菌株已不再需要黃嘌呤。可用其中IMP脫氫酶基因的啟動子和全部或部分開放讀碼已被刪除的DNA轉化接受體，並用複製平板法篩選需要黃嘌呤的菌株，以得到其中染色體上IMP脫氫酶基因的啟動子和全部或部分開放讀碼被刪除的突變株。可按照製備其中缺失啟動子之DNA的同樣方法，由含有IMP脫氫酶基因(其與接受體的IMP脫氫酶基因有高度同源性)和相鄰區域的質粒中製得用於這一目的DNA，條件是用核酸外切酶進一步消化，以不僅缺失啟動子，而且還切掉了全部或部分結構基因;或者是使用適當的限制性酶製備其中基因的啟動子和開放讀碼均缺失的DNA。在這種情況下，最好適當選擇核酸外切酶消化的條件，以儘可能多地缺失基因的啟動子和開放讀碼，並儘可能多地保留相鄰區域。在用限制性酶製備上述DNA時，所用的酶最好有一個能滿足上述條件的酶切位點。另外，在製備這樣的DNA時，可將下文所述的標誌基因插入缺失的部分中，並利用該標誌如藥物抗性標誌得到需要黃嘌呤的菌株。從而便很容易進行篩選，實際操作中也是很便利的。可參照歐洲專利公開273660A中所述的方法插入選擇標誌並收集轉化體。用如此製得的需要黃嘌呤的菌株作為接受體並用本發明的DNA進行轉化。然後將細胞懸浮液塗布於不含黃嘌呤的瓊脂平板上，並從生長於平板上的菌落中得到本發明的新的微生物。
如下所述，如此得到的轉化體是一種新的微生物。即，用適當的限制性酶切割轉化體和用於轉化之接受體的染色體DNA，然後進行瓊脂糖凝膠電泳、用鹼進行變性處理並轉移到硝化纖維素濾器上。另外，用放射性核素分別標記含IMP脫氫酶基因的片段和含所用啟動子的DNA片段。用它們作探針進行Southern雜交，並分析與各探針雜交所得片段的大小，以證實啟動子已被交換。另外，也可測定轉化體之染色體DNA上IMP脫氫酶基因內啟動子區的DNA順序，來進一步證實啟動子的交換。當基於用本發明的DNA轉化產生雙交換型重組時，IMP脫氫酶基因的表達強度是不同的。而當用本發明的DNA造成單交換型重組時，除上述特徵外，還表達了所用之標誌物的特徵。但其他一些特徵則與接受體的特徵相同。
下述實施例中製得的本發明轉化體的典型例子包括枯草芽孢桿菌NA6242(IFO14867，FERMBP-2381，CCTCCM90018)枯草芽孢桿菌NA6243(IFO14868，FERMBP-2382，CCTCCM90019)其中IFO號是根據布達佩斯條約規定在InstituteforFermentation，Osaka的保藏登記號.FERMBP號是在FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustralScienceandTechnology(FRI)的保藏登記號。各轉化體已於1989年4月3日保藏在IFO，於1989年4月12日保藏在FRI。
當然，經適當地選擇啟動子和接受體細胞，可很容易地按本文所述的方法製得不同的轉化體。
可用生產次黃苷和/或鳥苷的常規發酵方法，使用本發明製得的轉化體生產次黃苷和/或鳥苷。
為此，可使用含有碳源、氮源、金屬離子，及必要時還含有胺基酸、核酸、維生素等其他營養素的培養基。作為碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、澱粉、糖化澱粉及糖蜜等。它們可以單獨或聯合使用。作為氮源，除使用蛋白腖、大豆粉、乾酵母、尿素等有機氮源外，還可單獨或聯合使用硫酸、硝酸、鹽酸、碳酸等的銨鹽、及氣態氨、氨水等無機氮源。作為其他營養素，可適當選擇並單獨或結合使用微生物生長所必需的無機鹽、胺基酸和維生素等。作為腺嘌呤源，可使用腺嘌呤、腺苷和腺苷酸及含有它們或其提取物的微生物細胞。
另外，必要時可向培養基內加入矽油、聚二醇醚等消泡劑，以及表面活性劑等。
一般可在需氧條件如通氣深層培養條件下進行培養。培養基的PH值最好在4-9範圍內。當培養期間PH發生變化時，可向其中加入硫酸、碳酸鈣、氫氧化鈉、氣態氨、氨水等，以將PH調到上述範圍。一般可在20至45℃的範圍內選擇最適培養溫度，所選擇的溫度應適於使用的特定微生物的生長和次黃苷和/或鳥苷的積聚。當次黃苷和/或鳥苷的積聚量達到最大時即可停止培養。一般說來，培養24至144小時可獲得理想的結果。
可使用已知的方法如沉澱法由培養物中分離次黃苷和/或鳥苷，並使用層析法等分離和純化之(如使用離子交換樹脂、活性碳等)。
按照本發明的方法，可以增加次黃苷或鳥苷(為生產重要的香味成分5′-次黃苷酸或5′-鳥苷酸的原料)的積聚比率，並可在工業上實現其高產率生產。
即是說，使用能夠產生次黃苷或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物作為接受體並用本發明的DNA去轉化它，可得到有高度生產鳥苷能力的新微生物。因為有高表達之啟動子的IMP脫氫酶基因已被整合到該新微生物的染色體上，故可很穩定地反覆生產鳥苷。另外，按照本發明的方法，也可使用能產生次黃苷和鳥苷，或次黃苷和黃苷、或黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌微生物作為接受體，並用本發明的其他DNA轉化之，得到有高度生產次黃苷能力的新微生物。因後一株新的微生物染色體上的IMP脫氫酶基因的啟動子是經過修變的，故可很穩定地反覆生產次黃苷。
下述參考實施例和實施例旨在進一步詳細闡述本發明，而不構成對本發明之範圍的限制。
在下列參考實施例和實施例中，使用的所有限制性酶(均由NipponGeneCo.，Ltd.，Japan生產)和修飾酶用量均為每微克DNA5單位。除特別指出者外，反應條件均如廠商提供的使用說明書所述。
參考實施例1含枯草芽孢桿菌IMP脫氫酶基因之質粒pEX117的分離按照「MolecularCloning」一書第86-93頁中所述的方法，由含有該質粒的重組體，即大腸桿菌TEX117(日本專利公開60-156388號)中提取含有得自枯草芽孢桿菌NA6012(IFO14190，FERMBP-292)之IMP脫氫酶基因區的重組質粒pEX117。即將大腸桿菌TEX117接種在LB培養基(含細菌用胰化腖10g/升，酵母浸膏5g/升，氯化鈉5g/升)上並向其中加入140μg/ml氯黴素以擴增該質粒。培養過夜後，收集並洗滌細胞。向洗過的細胞中加入溶菌酶，再加0.2N含1%十二烷基硫酸鈉的氫氧化鈉溶液以使細胞溶解。加入5M乙酸鉀後，離心得到含質粒的上清液。向該上清液內加入0.6體積的異丙醇以沉澱質粒DNA，用乙醇洗滌後將其溶解在TE緩衝液(10mMTris-HCl緩衝液-1mMEDTA，pH8.0)。向該溶液內加入氯化銫使其比重達到1.60，再加入溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓至終濃度為600μg/ml。於20℃下，以50，000rpm離心該混合物(超離心，轉子V65Ti)，然後用紫外光檢測質粒的沉澱帶並收集之。用正丁醇除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓後，將其對TE緩衝液透析，由300ml培養液中得到約200μg重組質粒pEX117。
用不同的限制性酶切割pEX117，基於HindⅢ消化的λ噬菌體DNA的分子量作出瓊脂糖凝膠電泳圖譜，並由之得到如圖1所示的限制性酶切圖。
pEX117為一重組質粒，其中在pBR322的PstⅠ位點內插入了一個約6.4千鹼基對(Kbp)的DNA片段。
實施例1其中IMP脫氫酶基因之一部分啟動子順序被SPOl取代的新DNA的製備1-i)IMP脫氫酶基因的再克隆用XbaⅠ和HincⅡ雙重消化pE117(3μg)，同時用XbaⅠ和HincⅡ雙重消化pUC119(1μg)。將它們混合後向混合物內加入1/2體積的7.5M乙酸銨。再加入乙醇達終濃度為70%，以沉澱DNA。離心後，將DNA溶解於TE緩衝液(5μl)中並用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan)使之彼此連接。用該反應混合物的一部分(5μl)轉化大腸桿菌X895(IFO 14308，FERMP-7411，需要黃嘌呤的菌株)並將細胞懸液塗布於含氨苄青黴素(25μg/ml)的M-9CATA培養基(每升含Na2HPO46g、KH2PO43g、NaCl0.5g、NH4Cl 1g、MgSO41mM、CaCl21mM、葡萄糖2g、酪蛋白胺基酸2g、色氨酸50mg腺嘌呤50μg、瓊脂15g，PH7.2)上。37℃保溫1天後，按照常規方法由生長於平板上的轉化體中提取質粒並定名為pEX214。按照S.N.Cohen等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕的方法進行轉化。然後按參考實施例1中所述的同樣方法大量製備DNA，由1升培養液中約製得1300μgDNA。
質粒pEX214的構建如圖1中所示。
1-ⅱ)pEX214中所含IMP脫氫酶基因之DNA順序的測定按照N.Poncz等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，4298(1982)〕所述的方法，製備缺失pEX214之XbaⅠ-HincⅡ片段的DNA片段，並按Sanger方法測定其鹼基順序。為實現Sanger氏方法，其中使用了SEQUENASE(由UnitedStatedBiochemicalCorp.USA製造，並按廠商推薦的方法使用之)。
其鹼基順序測定結果如圖2所示。
1-ⅲ)IMP脫氫酶基因之啟動子的缺失用XbaⅠ切割pEX214(10μg)後，用乙醇沉澱法回收DNA並溶解於TE緩衝液(10μl)中。然後加入緩衝液、水和BAL31(0.2U)使反應混合物體積達到50μl並於30℃保溫。每隔1分鐘取出7μl反應混合物並向各等份內加入TE緩衝液飽和的苯酚(7μl)。用乙醇沉澱法由該溶液中回收DNA並溶解於TE緩衝液(5μl)中。然後，用T4DNA聚合酶將結合端轉變成平頭。向如此得到的7份DNA溶液中分別加入PstⅠ，消化後進行瓊脂糖凝膠電泳。切下含有相當於電泳分離約為1.7kbp(1.6至1.75kbp)之DNA的瓊脂，並用電洗脫器(由IBICorp.USA製造)由瓊脂回收該DNA片段。這個片段是用BAL31由1分鐘反應的樣品中得到的。
另一方面，按照同樣方法用SmaⅠ和PstⅠ雙消化pUC119(1μg)，並回收約相當於3.2kbp的DNA片段。
混合上述兩片段，用連接試劑盒連接之，並用於轉化大腸桿菌JM109。將細胞懸液鋪敷在含有氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，於37℃下保溫1天並收集生長於平板上的12個轉化體。按照上面1-ⅱ)中所述的同樣方法，檢查各轉化體內所含質粒上被插入部分的鹼基順序，以選擇其中缺失了-35區的質粒pEX214△3。
圖3中顯示了pEX214△3的構建及其鹼基順序的測定。
1-ⅳ)將1MP脫氫酶基因的5′相鄰區插入pEX214△3用SmaⅠ和XbaⅠ雙重消化pEX117(5μg)。用SspⅠ切割pEX214(20μg)。分別用瓊脂糖凝膠電泳法分級分離後，由前者中回收1.45kbp片段(約1μg)並由後者中回收1.2kbp片段(約4μg)。進一步用XbaⅠ切割1.2kbp的SspⅠ片段並按同樣方法分析分離以回收0.1kbp的片段(約0.2μg)。另一方面，用EcoRⅠ切割pEX214△3(1μg)後，按「MolecularCloning」第395頁所述的方法，用T4DNA聚合酶將粘性末端轉變成平端。向其中加入上面回收的1.45kbp(1μg)和0.1kbp(0.2μg)部分，並用連接反應試劑盒連接這三個片段。然後使用部分連接反應混合物(5μl)轉化大腸桿菌X895菌株。由生長於含氨苄青黴素之LB瓊脂平板上的轉化體中提取質粒並定名為pEX241。
圖4中顯示了pEX241的構建程序。
1-ⅴ)將SPO-1啟動子連接到pEX241上用EcoRⅠ切割含SPO1-26啟動子的質粒pSPO1-26(10μg)，然後用瓊脂糖凝膠電泳法分級分離以回收約0.1kbp的DNA片段，並將其溶解於TE緩衝液(5μl)中。另一方面，用KpnⅠ切割pEX241(1μg)並與上述0.1Kbp片段混合。然後用T4DNA聚合酶將粘性末端轉變成平端。用連接反應試劑盒連接並用以轉化大腸桿菌X895菌株。將轉化反應混合物塗布於含有氨苄青黴素的M-9CATA瓊脂平板上、並由生長於平板上的菌落中得到大腸桿菌TF242(IFO14864，FERMBP-2378，CCTCCM90015)轉化株。按照參考實施例1中所述的同樣方法，由培養液中得到質粒(約1，200μg)並定名為pEX242。用PvuⅠ和PstⅠ雙重消化質粒pEX242(50μg)。經瓊脂糖凝膠電泳分級分離後，回收2.9kbp片段(產率約7μg)。
圖5中顯示了pEX242的構建程序。
實施例22-ⅰ)含有其中缺失大部分IMP脫氫酶基因的DNA之質粒的製備用XbaⅠ和MluⅠ雙重消化pEX117(5μg)。以瓊脂糖凝膠電泳法分級分離後回收7.0Kbp和3.8Kbp的片段。進一步用NruⅠ消化3.8Kbp片段得到NruⅠ-MluⅠ部分。另一方面，按照實施例1中所述的同樣方法，由pEX214中製得XbaⅠ-SspⅠ片段(0.1Kbp)。
然後，用ClaⅠ消化pC194(5μg)得到1.7Kbp的ClaⅠ片段。再用MspⅠ和MboⅠ雙重消化該片段，得到一個含有氯黴素乙醯轉移酶基因的1.05Kbp片段。用T4DNA聚合酶將該片段的粘性末端填成平頭。
然後以上述方法製得4個其量分別為0.5μg、0.5μg、0.1μg和0.2μg的下列片段7.0Kbp的XbaⅠ-MluⅠ片段、2.2Kbp的NruⅠ-MluⅠ片段、0.1Kbp的XbaⅠ-SspⅠ片段、1.05Kbp的MspⅠ-MboⅠ片段(兩端均填成平頭)。混合這些片段並用連接反應試劑盒連接之。用該反應混合物的一部分轉化大腸桿菌C600，並將細胞懸液塗布於含氯黴素(10μg/ml)和四環素(12.5μg/ml)的LB瓊脂平板上。37℃保溫1天後，按常規方法由生長於平板上的菌株中提取質粒並定名為pEX210。
圖6顯示了pEX210的構建程序。
2-ⅱ)染色體上缺失大部分IMP脫氫酶基因之轉化體的衍化用PstⅠ切割質粒pEX210(50μg)，並按照實施例1-ⅴ)中所述的方法分離和回收7.0Kbp的片段。將該片段(1μg)加到按C.Anagnostopoulos和J.Spizizen〔J.Bacteriol.，81，741(1961)〕所述方法製備的枯草芽孢桿菌NA6128(IFO14373，FERMBP-617)的感受態細胞懸液(1ml)中。37℃下振蕩培養1小時後，將培養物鋪敷在含有氯黴素(10μg/ml)的LB瓊脂平板上並於37℃下保溫1天。收集所得轉化體並定名為枯草芽孢桿菌NA6210(IFO14866，FERMBP-2380，CCTCCM90017)。將該微生物菌株接種在M-9CATA瓊脂平板和含有黃嘌呤(50μg/ml)的M-9CATA瓊脂平板上，然後觀察在兩培養基上的生長情況。結果發現，該菌株在前一平板上沒有生長，而只在後一平板上生長。由此可見，NA6210菌株已變成了需要黃嘌呤的菌株。
2-ⅲ)攜帶IMP脫氫酶基因之轉化體的衍化其中所說基因的啟動子被SPO1-26啟動子所取代製備枯草芽孢桿菌NA6210菌株的感受態細胞，並向其懸液(1ml)內加入實施例1-ⅴ)中製得的pEX242的PvuⅠ-PstⅠ片段(2.9Kbp，1μg)。將混合物於37℃下振蕩1小時。然後將細胞懸液塗布於M-9CATA瓊脂平板上並於37℃保溫1天。收集在平板上生長的菌落，得到枯草芽孢桿菌NA6242菌株(IFO12485，FERMBP-2381)。觀察該菌株在LB瓊脂平板和含氯黴素(10μg/ml)之LB瓊脂平板上的生長情況。結果發現，其可在前一平板上生長，但在後一平板上則不生長。可見，該菌株是對氯黴素敏感的，但其起始菌株即NA6210菌株是對氯黴素有抗性的。
2-ⅳ)枯草芽孢桿菌NA6128和NA6242之IMP脫氫酶活性的比較用Magasanik所述的方法檢測枯草芽孢桿菌NA6242的IMP脫氫酶活性時，結果為每分鐘每毫克蛋白中生成了13mmolXMP。另一方面，按同樣方法檢測枯草芽孢桿菌NA6128的IMP脫氫酶活性，則結果為每分鐘每毫克蛋白中生成了1.5nmolXMP。可見，由於置換了啟動子，其酶促活性提高了約8.7倍。
實施例3由枯草芽孢桿菌NA6242生產鳥苷在含有種子菌培養基(20ml，如表1所示)的200ml體積Erlenmeyer培養瓶內接種一鉑金耳枯草芽孢桿菌NA6242，並於37℃下振蕩培養18小時。取其1ml培養物接種在含主發酵培養基(20ml，如表1所示)的200ml有皺褶的培養瓶內，並於37℃下旋轉振蕩培養84小時。培養結束後，用高效液相層析法測定其中積聚的鳥苷量。結果發現，其中積聚了24.0mg/ml鳥苷。如按同樣方法培養枯草芽孢桿菌NA6128時，則只積聚8.0mg/ml鳥苷。
表1濃度(g/升)培養基成分種子菌培養基發酵培養基葡萄糖30120穀氨酸鈉1010硫酸銨-20尿素310玉米漿2020硫酸鎂22腺嘌呤0.20.075磷酸氫二鉀21-氯化鉀-0.5氯化鈣25硫酸錳-0.0025碳酸鈣-30PH7.06.8實施例4p1啟動子插入pEX241中由按照日本專利公開№60-137291中所述方法製備的含P1啟動子的質粒pBTM128中切下含P1啟動子的DNA片段，並按照實施例1-ⅴ)中所述的同樣方法連接到pEX241中。即，先用EcoRⅠ和PstⅠ雙重消化PBTM128(10μg)，經瓊脂糖凝膠電泳分離後，回收長約0.1Kbp的DNA片段，並將其溶解在TE緩衝液(5μl)中。另一方面，用KpnⅠ切割pEX241(1μg)並與上述的0.1Kbp片段混合。用T4DNA聚合酶將粘性末端填成平頭，然後用連接反應試劑盒連接兩片段並用以轉化大腸桿菌X895。將細胞懸液塗布於A-9CATA瓊脂平板上，於37℃保溫過夜。由平板上形成的一個菌落分離得到轉化體大腸桿菌TF243(IFO14865，FERMBP-2379，CCTCCM90016)。按照參考實施例1所述的同樣方法，由1升培養液中提取到約1，200μg質粒，並定名為pEX243。用PvuⅠ和PstⅠ雙重消化pEX243，經瓊脂糖凝膠電泳分級分離後回收2.9Kbp的片段，得到約7μgDNA。
實施例5攜帶IMP脫氫酶基因之轉化體的衍生其中所說基因的啟動子被P1啟動子所取代按實施例2所述方法製備枯草芽孢桿菌NA-6210的感受態細胞，向其中加入實施例4中製得的pEX243的PvuⅠ-PstⅠ片段(2.9Kbp，7μg)，並按實施例2-ⅲ)中所述的同樣方法進行轉化。將細胞懸液塗布於M-9CATA瓊脂平板上，並由所形成的菌落中得到轉化體枯草芽孢桿菌NA6243(IFO14868，FERMBP-2382，CCTCCM90019)。按照實施例2-ⅲ)中所述方法檢查該菌株，發現它是對氯黴素敏感的菌株。
按實施例2-ⅳ)中所述方法檢測枯草芽孢桿菌NA6243菌株的IMP脫氫酶活性時，該活性值為0.5nmol已生成的XMP/分鐘、毫克蛋白質，可見，由於置換了啟動子，使酶促活性約降低1/3。
實施例6由枯草芽孢桿菌NA6243生產次黃苷在含有表1所示種子菌培養基(20μl)的200ml體積Erlenmeyer培養瓶內接種一鉑金耳枯草芽孢桿菌NA6243，並於37℃下振蕩培養18小時。取1ml培養物接種於含表1所述主發酵培養基(20ml)的200ml體積有皺褶的培養瓶內，並於37℃下旋轉振蕩培養84小時。發酵結束後按實施例3中所述的同樣方法測定積聚的次黃苷和鳥苷量，測得次黃苷量為27.0mg/ml，鳥苷量為3.0mg/ml。而按同樣方法培養枯草芽孢桿菌NA6128時，則只聚積22.0mg/ml次黃苷和8.0mg/ml鳥苷。
權利要求
1.含有枯草桿菌屬微生物之染色體中IMP脫氫酶基因的DNA，特徵在於其中IMP脫氫酶基因的啟動子被不同的可表達啟動子取代。
2.根據權利要求1的DNA，其中不同的啟動子是選自於一組由芽孢桿菌屬細菌染色體的質粒、衍生於芽孢桿菌屬細菌之噬菌體的質粒、以及能在芽孢桿菌屬細菌內自主生長的質粒中得到的啟動子。
3.根據權利要求1的DNA，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更強。
4.根據權利要求1的DNA，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更弱。
5.與含有芽孢桿菌屬微生物染色體之IMP脫氫酶基因的DNA整合的載體，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被一不同的可表達啟動子所取代。
6.根據權利要求5的載體，其中該不同的啟動子選自於一組由芽孢桿菌屬細菌染色體的質粒、衍生於芽孢桿菌屬細菌之噬菌體的質粒、以及能在芽孢桿菌屬細菌內自主生長的質粒中得到的啟動子。
7.根據權利要求5的載體，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更強。
8.根據權利要求5的載體，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子所取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更弱。
9.帶有某一基因的芽孢，桿菌屬微生物，其中芽孢桿菌屬微生物之染色體上基因的啟動子在其染色體上被一不同的可表達啟動子取代。
10.根據權利要求9的可產生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物，其為用含有芽孢桿菌屬微生物之染色體上IMP脫氫酶基因的DNA轉化的，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被一不同的可表達啟動子或整合了該DNA的載體所取代。
11.根據權利要求10的微生物，其中不同的啟動子選自於一組由芽孢、桿菌屬細菌染色體的質粒、衍生於芽孢桿菌屬細菌之噬菌體的質粒、以及能在芽孢桿菌屬細菌內自主生長的質粒中得到的啟動子。
12.根據權利要求10的微生物，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子所取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更強。
13.根據權利要求10的微生物，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子所取代，後者可比芽桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更弱。
14.一種生產次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養基中培養能夠產生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物，該微生物是用含有芽孢桿菌屬微生物染色體上IMP脫氫酶基因的DNA轉化的，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被一不同的可表達啟動子或整合了該DNA的載體所取代，以產生和積聚次黃苷和/或鳥苷並收集所得產物。
15.根據權利要求14的方法，其中不同的啟動子選自一組由芽孢桿菌屬細菌染色體的質粒、衍生於芽孢桿菌屬細菌之噬菌體的質粒、以及能在芽孢桿菌屬細菌內自主生長的質粒中得到的啟動子。
16.根據權利要求14的方法，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子所取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更強。
17.根據權利要求14的方法，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被某一啟動子取代，後者可比芽孢桿菌屬微生物之染色體上的IMP脫氫酶基因表達更弱。
全文摘要
本發明公開了含有芽孢桿菌屬微生物之染色體的IMP脫氫酸基因的DNA，其中IMP脫氫酶基因的啟動子被一個不同的可表達啟動子所取代。還公開了整合了該DNA載本、能用上述DNA或載體轉化了的、產生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物、以及生產次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養基中培養所說的芽孢桿菌屬微生物以產生並積聚次黃苷和/或鳥苷，並收集所得產物。
文檔編號C12N15/75GK1046558SQ9010219
公開日1990年10月31日 申請日期1990年4月18日 優先權日1989年4月19日
發明者宮川権一郎, 神崎直之, 長谷川建夫 申請人:武田藥品工業株式會社