苯並咪唑化合物及其作為色譜配體的用途的製作方法

2023-05-16 22:27:51 2

專利名稱：：苯並咪唑化合物及其作為色譜配體的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種苯並咪唑化合物及其作為色語配體的用途。技術背景免疫球蛋白或抗體是一類極其重要的蛋白質，它存在於哺乳動物、鳥類和魚類的各種體液中，起到對抗攻擊動物的物質、細菌和病毒的動物保護劑的作用。免疫球蛋白通常存在於動物的血液、乳液和唾液以及其它體液和分泌物中。現已在有關人類和獸類診斷、健康護理和治療部門的多種不同應用中開發免疫球蛋白所具有的生物活性。所有上文所提及的免疫球蛋白的應用都需要在一定程度上將抗體從對粗原材料中分離，但各類應用對於抗體產物的最終純度和可允許的成本都有其自身不同的需要。一般說來，存在許多種可用於分離免疫球蛋白從而得到具有多種最終純度、產率和成本的產物的不同方法。分離免疫球蛋白的傳統方法是基於選擇性可逆沉澱包含免疫球蛋白的蛋白質片斷，同時使其它類別的蛋白質留在溶液中。典型的沉澱劑為乙醇、聚乙二醇、易溶(lyotropic)(抗離液(anti—chaotropic))鹽(諸如碌u酸銨和磷酸鍾)，以及辛酸(caprylicacid)。典型地，這些沉澱方法將提供極其不純的產物，同時還費時費力。此外，將沉澱劑加到原材料中將使得難以將上清液用於其它目的並且會產生處理的問題。當論及從(例如)乳清和血漿中大規模純化免疫球蛋白時，上述弊端將尤其明顯。離子交換色譜法是另一種眾所周知的通常用於分離免疫球蛋白的蛋白質分級分離方法。然而，由於為確保抗體有效結合以及不同免疫球蛋白的不同等電點所需的離子強度和pH值存在限制，故這種方法通常並不適用。蛋白質A和蛋白質G親和色譜法主要由於使用簡便性和所獲得的高純度而成為分離和純化免疫球蛋白、尤其分離單克隆抗體的極其流行和普遍的方法。儘管十分流行，但普遍認為蛋白質A和蛋白質G會給用戶帶來若干問題，其中包括極高的成本、不同單克隆抗體(尤其小鼠IgG,)的變化的結合效率、蛋白質A/蛋白質G漏入產物中和基質於典型清洗溶液(例如，1M的氫氧化鈉)中的低穩定性。上述每個缺點都會在個別應用中引起特定結果，包括可忽略的到極其嚴重的並且超限的結果。因此，需要分離和純化免疫球蛋白的新穎方法。本發明是基於一種發現，即，可將通過使某些經取代苯並咪唑配體與固相材料連接所形成的固相基質用於從多種不同原材料中分離和/或純化不同種類免疫球蛋白的方法中，這將提供高效率並且對於結合過程中使用少量鹽或不使用鹽(尤其易溶鹽)以及對於結合多種免疫球蛋白的能力而言，提供特殊優勢。此外，這些基質對於在NaOH中的穩定性也特別有益，這一益處在使用後使固相基質再生時尤為明顯。本發明的一個實施例是針對一種用於從含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液中分離免疫球蛋白的方法，其包含a)使所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液與通式M-SP-L的固相基質接觸；b)將結合有免疫球蛋白的固相基質與所述溶液分離；c)視情況洗滌所述固相基質；和d)使所述固相基質與洗脫液接觸以便將所述一種或一種以上免疫球蛋白從所述固相基質釋放。M表示基質主鏈，SP表示間隔基，並且L表示由結構式(I)所示的配體或其互變異構體，其中Ri為-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-0R3;R2為-H、-卣素(例如，-F、-Cl、-Br或-I)、-0R4、-NH2、-烷基、-N02、-S03H、-N(R3)C(0)N(R3)2，
發明內容R3在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Rs在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Z為單鍵、視情況經取代的亞烷基、視情況經取代的亞烯基或視情況經取代的亞炔基；n為0到4的整數；條件是L不為2-巰基-5-硝基-苯並咪唑、2-氨基-苯並咪唑、2-巰基苯並咪唑和2-氨曱基-苯並咪唑。本發明另外提供一種包含具有多個官能團的官能化基質主鏈的固相基質，由式M-SP-L表示。本發明還針對一種由以下結構式表示的化合物本發明的固相基質和方法可用於以高效率和高純度分離和/或純化免疫球蛋白。無具體實施方式本發明針對一種分離和/或純化免疫球蛋白的方法，其包含使含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液與本文所述的固相基質接觸。本發明還針對本文所述的固相基質。因此，下文的定義將涉及根據本發明的方法以及根據本發明的固相基質。本發明還針對用於製備本文所述的固相基質的某些配體。塔被#如上文所述，根據本發明的方法包括使用固相基質，其中所述固相基質包含具有多個官能團的官能化基質主鏈，如下式所示M-SP-L，其中M表示基質主鏈，SP表示間隔基，並且L表示由以下結構式(I)所示的配體或其互變異構體，其中'.K為-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-0R3;R2為-H、-卣素、-0R4、-NH2、-烷基、-N02、-S03H、-N(R3)C(0)N(R3)在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R5在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Z為單鍵、視情況經取代的亞烷基、視情況經取代的亞烯基或視情況經取代的亞炔基；n為0到4的整數；條件是L不為2-巰基-5-硝基-苯並咪唑、2-氨基-苯並咪唑、2-巰基苯並咪唑和2-氨曱基-苯並咪唑。在一個實施例中，R!為-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-0R3。在另一個實施例中，R,為-NH2、-SH、-CH2SH或-CH廣NH2。在一個實施例中，Z為單鍵、視情況經取代的亞烷基、視情況經取代的亞烯基或視情況經取代的亞炔基。在另一個實施例中，Z為C1-C10亞烷基。在另一個實施例中，Z為C1-C5亞烷基。在另一實施例中，Z為單鍵。在一個實施例中，R2在每次出現時獨立地為-H、-卣素、-0R4、-NH2、-烷基、-N02、-S03H、—N(R3)C(0)N(R3)2，formulaseeoriginaldocumentpage13或'"。優選Rs為H。在另一個實施例中，R2為-H。在另一個實施例中，R2為CI-C1Q烷基。在另一個實施例中，R2為Cl-C5烷基。在一個實施例中，R3在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基。在一個實施例中，R3為-H。在另一個實施例中，R3為C1-C10烷基。在另一個實施例中，R3為CI-C5烷基。在一個實施例中，R4在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基。在一個實施例中，R4為-H。在另一個實施例中，^為C1-C10烷基。在另一個實施例中，R4為C1-C5烷基。在一個實施例中，Rs在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基。在一個實施例中，Rs為-H。在另一個實施例中，Rs為C1-C10烷基。在另一個實施例中，Rs為Cl-C5烷基。在一個實施例中，n為0到4的整數。在另一實施例中，n為l。在另一實施例中，n為0。在特定實施例中，Z為C1-C1Q烷基；1在每次出現時獨立地為-H或C1-C10烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或C1-C10烷基；Rs在每次出現時獨立地為-H或C卜C10烷基。在另一特定實施例中，Z為CI-C5烷基；R3在每次出現時獨立地為-H或CI-C5烷基；114在每次出現時獨立地為-H或Cl-C5烷基；115在每次出現時獨立地為-H或CI-C5烷基。在另一特定實施例中，配體L是由結構式(I)表示，其中Z為單鍵；n為1並且其它變量如上文關於結構式(I)所述。在更特定的實施例中，Z為單鍵；n為l;R3在每次出現時獨立地為-H或C1-C10烷基；114在每次出現時獨立地為-H或CI-C10烷基；Rs在每次出現時獨立地為-H或CI-C10烷基。在另一個更特定的實施例中，Z為單4建；n為1;R3在每次出現時獨立地為-H或Cl-C5烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或CI-C5烷基；Rs在每次出現時獨立地為-H或CI-C5烷基。在另一個特定實施例中，配體L是由結構式(II)表示或其互變異構體，其中各變量如上文關於結構式(I)所述。在更特定的實施例中，Rs為-H。在另一個更特定的實施例中，Z為單鍵或C1-C5烷基；且Rs為-H。在另一個特定實施例中，配體L是由結構式(III)表示或其互變異構體，其中各變量如上文關於結構式(I)所述。在更特定的實施例中，Rs為-H。在另一個更特定的實施例中，Z為單鍵或Cl-"烷基;且R5為-H。在某些實施例中，L是由以下結構式所示formulaseeoriginaldocumentpage15或其互變異構體。儘管配體是通過本文中的結構式且在下文中使用與得到所述配體的個配體L是所述化合物的一個基團。配體可在所述配體的不同連接位置處與基質主鏈連接。所述連接位置視配體本身而不同。配體的連接位置是在用於連接配體與基質主鏈的反應條件下配體中最具反應性的位置。舉例來說，由以下結構式所示，配體可在苯並咪唑的氮處連接，其中連接位置以"v/ww，，表示formulaseeoriginaldocumentpage15在某些實施例中，當R,是由-Z-NHR3、-Z-SH或-Z-0H(其中Z不為單鍵)表示時，-L可由以下結構式表示IO(TC的油浴中，氮氣保護下攪拌反應24小時。降到室溫，二氯甲烷萃取，合併有機相併用無水MgS04乾燥，過濾，旋蒸濃縮，殘液以石油醚為展開劑，用矽膠薄層色譜分離得到純的2-苯基噻酚78mg，分離收率97.5%。Whiteplates,m.p.39-41°C，lit.40-41°C.'HNMR(CDC13):57.09(t,4.2Hz，lH，C4H3S)，7.29(m,3H，C4H3S,Ar-H)，7.38(t，《/=7.6Hz，2H,Ar畫H),7.62(d,/=7.6Hz，2H,Ar-H).實例十二對甲基聯苯的合成向10mL的Schlenk反應管(一種玻璃儀器)加入0.005mmol(2.70mg)的2-(3,5-二甲基吡唑-l-基甲基)-6-(二環己基膦氧)苯基氯化鈀(II)催化劑、lmmol(212mg)磷酸鉀、0.5mmol(59.2(il)的對甲基氯苯、0.6mmol(73.2mg)苯基硼酸及2mL的DMF，用氮氣置換反應管4次，然後將反應管放入溫度為IO(TC的油浴中，氮氣保護下攪拌反應48小時。降到室溫，二氯甲烷萃取，合併有機相併用無水MgS04乾燥，過濾，旋蒸濃縮，殘液以石油醚為展開劑，用矽膠薄層色譜分離得到純的對甲基聯苯59mg，分離收率70.2。/。。Whiteplates,m.p.47-49°C,lit.48-50oC.實例十三對硝基聯苯的合成向10mL的Schlenk反應管(一種玻璃儀器)加入0.005mmol(2.64mg)石；金屬矽酸鹽，可控孔度玻璃和陶資；金屬氧化物和硫化物；或這些天然或合成的有機或無機材料的組合。基質主鏈優選是選自瓊脂-瓊脂、瓊脂糖、纖維素、纖維素醚(諸如羥丙基纖維素、羧曱基纖維素)、聚醯胺(諸如聚(曱基)丙烯醯胺)、聚乙烯醇、矽石和可控孔度玻璃。作為基質主鏈的特別值得關注的固相材料為(例如)瓊脂或瓊脂糖珠4立，"^3口來自瑞典PharmaciaBiotech乂>司的Sepharose禾口Superose$朱4立和來自美國Biorad公司的BiogelA;葡聚糖基珠粒，諸如PharmaciaBiotech公司的Sephadex;纖維素基珠粒和膜，諸如來自捷克斯洛伐克Secheza7>司的Perloza纖維素；複合J朱4立，it^口PharmaciaBiotech乂>司的Sephacryl和Superdex;合成有機聚合物的珠粒，諸如來自美國Toso—Haas乂>司的Fractogel;來自美國PerceptiveBiosystems公司的P0R0S介質、來自Biorad公司的Bio-Rex、Bio-GelP和MacroPrep，以及來自TESSEK公司的HEMA和S印aron，和來自美國BioS印ra公司的HyperD和Trisacryl介質，來自美國3M公司的Enzacryl和Azlactone;含珪材料的珠粒，諸如可控孔度玻璃，來自英國Bioprocesing公司的PR0SEP和來自BioS印ra公司的Spherocil;和J朱粒或膜形式的塗覆二氧化矽複合物，諸如來自美國ArborTechnologies公司的ACTI-DISK、ACTI-MOD和CycloSep。典型地，基質主鏈以及所得官能化固相基質可例如為不規則顆粒或球形珠粒、膜或薄片、模製表面或杆的形式。此外，固相材料可完全或部分滲透蛋白質或完全不滲透蛋白質。在本發明的特別值得關注的實施例中，基質為尺寸在1-10000um、優選為10-1000um(諸如為10-60um以用於高效能應用，且諸如為50-500um、優選50-300um以用於製備目的)的範圍內的不規則球形珠粒的形式。特別值得關注的基質形式為包含密度控制顆粒的集聚體形式的密度受控基質。WO92/00799中描述了這些集聚體，它們特別適用於在非填充柱中進行的流化床或膨脹床色譜以及不同分批式色譜技術(例如，在攪拌罐中進行的簡單分批吸附)的大規模操作，所述專利全部併入本文用作參考。可通過本質上已知適用於連接目的的任何類型的共價鍵將配體L與固相材料連接在一起，這可通過配體與固相材料之間的直接化學反應或用本質上已知的可能將基質主鏈與配體連接一起的適當試劑進行固相材料或配體的先前活化來完成。所述適當活化劑的實例為表氯醇、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚；雙環氧化物類(bis-印oxide)，-渚如丁二醇二縮水甘油醚；滷素取代的脂肪族化合物類，諸如二氯丙醇、二乙烯基碸；羰基二咪唑；醛類，諸如戊二醛醌類；溴化氰；高碘酸鹽類，諸如偏高碘酸鈉；碳化二醯亞胺類；氯代三口秦類(chloro-triazine)，諸如三聚氯氰(cya匿icchloride);石黃醯氯類，諸如曱苯石黃醯氯和三氟代乙烷石黃醯氯(tresylchloride);N-羥基琥珀醯亞胺類；2-氟-1-曱基吡啶錄曱苯-4-磺酸鹽；惡哇酮類；順丁烯二醯亞胺類；二硫代吡啶類(pyridyldisulfide);醯肼類；和烯丙基溴/溴。其中，活化試劑留下不同於單鍵的間隔基團SP,例如表氯醇、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚、雙環氧化物、卣素取代的脂肪族化合物、二乙烯基碸、醛、醌、溴化氰、氯代三。秦、惡唑酮、順丁烯二醯亞胺、二硫代吡啶和醯肼。在特定實施例中，間隔基SP是以式-(0-CH2CH2(OH)-CH》m-表示，其中m為1到10的整數。更具體說來，m為1到5的整數。甚至更具體地說，m為1到3的整數。在某些情況中，例如在將二乙烯基碸用作活化試劑的情況下，活化試劑甚至可以是官能團的一部分，有助於使免疫球蛋白與固相基質結合。在其它情況中，在官能團與基質反應的過程中，活化試劑從基質中釋放出來。當使用羰基二咪唑(carbodiimidazole)和碳化二醯亞胺時，情況就如此。在特定實施例中，活化劑為烯丙基溴/溴。上文所提及的可能性使得有必要對使基質M與配體L連接的可選間隔基SP的存在加以定義。在本文中，可將間隔基SP視作使基質與配體之間形成連接的活化試劑的一部分。因此，間隔基SP與所涉及的活化試劑和偶合反應相應。在某些情況中，例如當使用碳化二醯亞胺時，活化試劑將形成基質或配體試劑的活化形式。偶合後，配體與基質之間沒有活化試劑的部分存留，周而SP只是一個單鍵。在其它情況中，間隔基SP為影響結合特徵的完整官能團部分(即配體)，並且當間隔基SP包含功能活性位點或取代基(諸如硫醇、胺、酸性基團、碸基、硝基、羥基、腈基或能夠通過氫鍵、靜電鍵合或靜電排斥、電荷轉移等相互作用的其它基團)時，這將特別明顯。在其它情況中，間隔基SP可包含芳香族或雜芳族環，對於固相基質的結合特徵起到顯著作用。將醌類或氯代三嗪類用作固相基質或配體的活化劑即為這種情況的實例。在某些實施例中,間隔基SP為單鍵或得自選自以下物質的活化試劑的雙自由基基團(biradical):表氯醇、烯丙基縮水甘油醚、雙環氧化物類(諸如丁二醇二縮水甘油醚)、卣素取代的脂肪族化合物類(諸如，1,3-二氯丙-2-醇)、醛類(諸如戊二醛)、二乙烯基碸、醌類、溴化氰、氯代三嗪類(諸如三聚氯氰)、2-氟-l-曱基吡啶鐺曱苯-4-磺酸鹽、順丁烯二醯亞胺類、惡唑酮類和醯肼類。在某些實施例中，間隔基SP選自短鏈脂肪族雙自由基基團，例如式-CH廠CH(OH)-CH廠(得自表氯醇)、—(CH2)廠O-CH廣CH(OH)-CH2-(得自烯丙基縮水甘油醚)或-CH廣CH(OH)-CH廠O-(CH2)4-O-CH廠CH(OH)-CH2-(得自丁二醇二縮水甘油醚)的基團；或單鍵。由於存在材料(例如配體和/或間隔基)從固相基質漏入洗脫產物(例如免疫球蛋白)中的風險，故有利地選擇分子量儘可能小的配體(或配體+可選間隔基)。使用蛋白質A、蛋白質G、合成肽和其它具有相對較高分子量的配體(例如，染料)的主要缺點在於，由於各組分的各自分子量和各組分彼此結合的自然傾向之間差異較小，故可能很難或者甚至不可能將任何釋放的配體(視情況包括間隔基)與洗脫的免疫球蛋白分離。這在打算將免疫球蛋白用作治療劑的情況中可能具有有害作用，可能會引起患者過敏性休克或其它嚴重症狀。配體(包括其間隔基)的分子量越小，那麼將任何洩露的配體與免疫球蛋白產物分離就越有效。具有最小可能分子量的配體(或配體-間隔臂結合物)的另一顯著優勢在於，在注入/攝入患者體內之前，可能未與免疫球蛋白分離的任何洩露的材料將引起最小抗原性，因此一般來說，與較高分子量的配體相比，較小分子量的配體所引起的抗原性相對更易於為生物體所接受。因此，優選配體L具有低於500道爾頓(Dalton)、優選低於400道爾頓、更優選低於300道爾頓，諸如低於250道爾頓或甚至低於200道爾頓的分子量。對於配體-間隔臂結合物(-SP-L)來說，優選分子量低於500道爾頓，更優選低於400道爾頓，諸如低於300道爾頓或甚至低於260道爾頓。根據本發明，基質包含單獨或與間隔基SP(甚至和基質主鏈)組合從而使得可能結合免疫球蛋白的配體。已發現，配體的重要部分為經取代的苯並。米唑。上可能對免疫球i白的高結合;i率和/或高純度具有某些益處:然^,、在本發明的重要實施例中，固相基質上的所有官能團都實質上相同。還發現，通過將配體與已包含帶負電荷或帶正電荷的部分(諸如帶正電的氨基或帶負電的羧酸基、磺酸基或膦酸基)的基質偶合將增強產物的結合效率和純度。配體濃度對於本發明基質的功能特徵也具有重要意義，例如，在一種配體濃度下，配體可展現對免疫球蛋白的較高程度的結合選擇性，而增加配體濃度將導致結合選擇性降低。如所屬領域技術人員眾所周知，過高的配體濃度可能通過多個結合點的機制而導致不合需要的雜質的強結合，這是由所述配體在固相主鏈上過於接近所引起。如果保持較低的配體濃度，那麼各配體將間隔較大的距離，且因此不會因多個位點處的結合而引起雜質的結合。過高配體濃度的另一負面影響在於通過多個結合位點結合所需蛋白質(例如，免疫球蛋白)的風險。所述多處結合可能導致難以用適當洗脫緩沖液釋放蛋白質(例如免疫球蛋白)。在某些情況中，甚至可能需要利用較強的變性條件和/或有機溶劑來使產物從高度取代的固相基質釋放出來，但這將以損失生物活性為代價。固相基質的配體濃度可以幾種不同的方式表示。一種描述配體濃度的方式是以每克乾物質中存在的配體的量(例如，微摩爾/克乾物質)表示。舉例來說，當通過固相基質的乾燥(例如，冷凍乾燥)樣本的元素分析來測量配體濃度時，所述濃度是直接獲得的結果。然而，配體濃度還可以1毫升潮溼沉降固相基質(通常也稱為1毫升填料床基質)上存在的配體的量表示。如果同時已測定水合固相基質的乾物質含量(即，乾物質克數/潮溼沉降固相基質的毫升數)，那麼所述配體的量為易於根據幹固相基質的測定值(例如，微摩爾/克千物質)計算的數值。另一種表示配體濃度的方式是以1克潮溼但經抽吸排乾的基質中存在的配體的量表示。如果同時已測定每克潮溼但經抽吸排乾的基質的固相干物質含量，那麼這一數值也易於根據乾物質的測定值計算。因此，本發明固相基質的配體濃度優選在10-990umol/g固相基質乾物質的範圍內，諸如為100-990ymol/g，更優選為200-980umol/g，尤其250-975timol/g;或本發明固相基質的配體濃度優選在1-145umol/ml水合沉降固相基質的範圍內，諸如10-120umol/ml，更優選為15-100umol/ml，尤其20-80umol/ml;或本發明固相基質的配體濃度優選在1-130umol/g潮溼但經抽吸排千的固相基質的範圍內，諸如為10-110ymol/g,更優選為20-100timol/g,尤其20-90umol/g。軸差者的合成一般來說，可根據本質上已知的方法，對固相基質進行衍生化從而使其包含共價連接的本發明的配體，例如通過以下步驟完成用本質上已知的適當試劑活化基質主鏈，隨後使配體與經活化的基質主鏈偶合，視情況通過首先將間隔基與經活化的基質主鏈偶合，隨後經由適當的縮合試劑使所述配體與間隔基偶合，或甚至再次活化間隔基隨後偶合配體，將間隔基SP併入配體與基質主鏈之間。所述次序和試劑的選擇可視待偶合的實際配體和待衍生化的基質主鏈而定，並且應考慮(例如)反應性基團(諸如羥基、氨基、巰基和矽烷醇)的含量。在某些情況中，可優選活化或衍生化配體而非基質主鏈，隨後使衍生化配體與固相基質主鏈反應。因此，在根據本發明合成固相基質的優選方法中，首先使基質主鏈與能夠與基質主鏈反應的試劑反應，且由此使基質主鏈活化以進一步與配體反應，視情況洗去活化試劑，隨後使活化的基質主鏈與包含配體的溶液反應，並且視情況隨後用一種或一種以上適當溶液洗滌包含共價固定配體的固相基質，以清洗掉基質中過剩的反應物。在某些情況中，可能通過混合兩種試劑來組合配體的活化和偶合反應並且使所述反應平行發生。由於這種方式節約成本和時間，並且使廢水的體積減到最少，故特別有益。因此，優選以一個組合步驟進行活化和偶合步驟。此外，如果能夠在無需向反應介質中添加有機溶劑加的情況下進行活化和/或偶合反應，那麼這種方式將更為有益。這些有機溶劑通常用於溶解反應性試劑或者確保將反應性物質的水解保持在最低限度。然而，使用有機溶劑將因爆炸風險、健康損害風險、廢料問題和溶劑本身的相對高成本而使所述方法的成本和風險增加。因此，優選在不向反應介質中添加任何有機溶劑的情況下進行活化和/或偶合程序。在某些實施例中，本發明針對一種由上文所述的結構式(I)、(II)和(III)所示的化合物。在特定實施例中，本發明的化合物選自以下結構式:formulaseeoriginaldocumentpage21formulaseeoriginaldocumentpage22一般說來，用於分離免疫球蛋白的本發明的方法可分成若干個步驟:(a)平衡固相基質；(b)使固相基質與免疫球蛋白溶液接觸；(c)洗滌固相；(d)使固相與溶液分離；(d)洗脫已結合的免疫球蛋白；(e)使固相基質再生。然而，是否每次或完全地進行所有步驟可視特定應用而定。因此，必須進行的步驟只是接觸、分離和洗脫步驟，而平衡、洗滌和再生步驟可根據與實際應用相關的特定需求進行或不進行。分離步驟的類型將視實際配置(set-up)(見下文)而定。^餘在使固相基質與含有免疫球蛋白的溶液接觸之前，優選確保基質與溶液都處於引起所需的免疫球蛋白結合的條件下。就這點看，因此可能需要調節諸如pH值、離子強度和溫度等參數，並且在一些情況中，可能需要加入不同類物質以促進免疫球蛋白的結合和/或防止雜質結合。因此，通過用溶液(例如，用於調節pH值、離子強度等或用於引入清潔劑的緩衝液)洗滌固相基質從而賦予固相所需的特性來進行固相基質的平衡是一個可選步驟。當固相基質為球形顆粒或不規則的顆粒形式時，含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液的接觸可在含有固相基質的填充床柱或流化床/膨脹床柱中進行。所述接觸還可以在簡單的分批式操作中進行，其中將固相基質與溶液混合一段時間以使免疫球蛋白結合。只要固相基質為滲透或半滲透膜或薄片的形式，那麼通常可通過以下步驟實現接觸抽吸含有免疫球蛋白的溶液/向含有免疫球蛋白的溶液施加壓力使其穿過膜或薄片的表面和/或通過膜或薄片的多孔結構，以確保免疫球蛋白與固定於表面上和/或多孔結構中的配體緊密接觸。關於本方法的其它準則才是供於"PurificationToolsforMonoclonalAntibodies",Gagnon,P.，ValidatedBiosystems,1996中。遂漆在使固相基質與含有免疫球蛋白的溶液接觸之後，視情況進行洗滌程序以便去除基質中未結合或鬆散結合的物質，諸如其它蛋白質、脂質、核酸或其它雜質。然而，在不需要免疫球蛋白具有極高純度的一些情況中，可省略洗滌程序，^v而節省工序以及洗滌溶液。在需要具有極高純度的免疫球蛋白的其它情況中，可以在進行洗脫之前，用不同洗滌緩沖液進行若干個不同的洗滌程序。所使用的洗滌緩沖液將視色譜吸附劑和結合免疫球蛋白的配體的性質而定。洗滌緩衝液應當不幹擾免疫球蛋白與吸附劑的結合，即，應對pH值、鹽濃度和其它添加劑進行調節，從而使得通過用洗滌緩沖液簡單地替代含有存在於吸附劑中和吸附劑周圍的雜質的溶液，或者同此方法結合還釋放與吸附劑結合的雜質，僅去除非所需的雜質。可通過改變pH值和/或離子強度，或通過將與吸附劑或雜質竟爭性相互作用的物質加到洗滌緩沖液中，從而將雜質從吸附劑中置換出來，來實現與基質結合的雜質的釋放。優選進行洗滌(本發明方法中的操作(c))以便從含有免疫球蛋白的溶液中去除其餘物質，並且去除其它類型的生物分子。遂應所結合的免疫球蛋白的洗脫通常是通過使包含已結合免疫球蛋白的固相基質與將免疫球蛋白從基質上的配體釋放出來的溶液接觸來進行。由此將免疫球蛋白釋放到溶液中並且能夠將其從基質中洗出來。用於釋放免疫球蛋白的溶液通常應具有與用於結合免疫球蛋白的溶液所不同的特徵，例如，所述溶液可具有不同的pH值、不同的離子強度、不同的溫度和/或其可包含有機溶劑(優選僅包含少量)、清潔劑、離液劑或其它變性試劑。通常還使用這些不同參數的變化組合。還可以通過施加將條件從結合逐漸變為不結合條件的溶液來進行洗脫，這種程序通常稱為梯度洗脫。將免疫球蛋白從固相基質釋放到洗脫溶液中後，可通過可選的本質上已知的不同方式從洗脫溶液回收免疫球蛋白。在最簡單的情況中，可直接使用免疫球蛋白而不需要進行任何改變，但在許多情況中，優選進行某種濃縮程序，例如超濾、冷凍乾燥或沉澱(例如，鹽析)。也可以在具有可選特性的另一處理步驟中對免疫球蛋白溶液進行徹底純化。在洗脫免疫球蛋白之後，可視情況對固相基質進行清洗，即再生。通常定期進行這一程序以使汙染固相表面的雜質的積累減到最少，和/或使基質滅菌以避免產物被固相和所述過程中所使用的設備中增殖和從固相和設備中逃逸的微生物所汙染。進行所述再生步驟的標準方法為用能夠清洗基質和/或殺死微生物的溶液洗滌固相基質。用於這些目的的典型溶液例如為，0.1-1.0M的氫氧化鈉；高酸溶液或過氧化氫；變性劑，諸如鹽酸胍；包含活性氯的溶液，諸如次氯酸鹽溶液；有機溶劑，諸如乙醇；清潔劑等。用於這一目的的特別優選的方法是使用0.1-1.QM氫氧化鈉，這是因為它具有極高的效率、低成本、易於用鹽酸中和並且無廢料問題。在本發明的特定實施例中，所述方法包括(i)平衡(可選步驟)、(ii)接觸、(iii)洗滌(可選步驟)、(iv)分離、(v)洗脫和(vi)再生，其中在再生之前可重複步驟(i)-(v)的循環一次或數次，並且在再生後將固相基質重複使用。在結合、洗滌和洗脫步驟中使用的條件對於所得免疫球蛋白結合效率、產率和純度極為重要。根據本發明的不同固相基質可能需要不同的結合、洗滌和洗脫條件以確保最佳結果。同樣，原材料的性質將對選擇用於特定分離程序的條件具有極為顯著的影響，例如，在雜交瘤細胞培養物上清液中極稀的單克隆抗體溶液(通常為10-100ug/ml)與存在於較濃溶液(諸如，腹水，l-5mg/ml)中的相同類型的抗體具有不同的表現，並且例如存在於乳清(1-2mg/ml)中的免疫球蛋白需要不同於血漿/血清(5-20mg/ml)等中的免疫球蛋白的條件。而且，不同類雜質的組成(即含量)可隨不同原材料而顯著不同，例如與雜交瘤細胞培養物上清液相比，蛋黃具有極為不同的組成。如上文所提及，通常可能將不同物質加到含有免疫球蛋白的溶液中以增強抗體與固相基質的結合。在某些實施例中，本發明涉及分離免疫球蛋白從而得到純度為至少10%,諸如至少30°/。，優選為至少50%，諸如至少70%,更優選為至少80%，諸如90%,尤其為至少99%的經分離免疫球蛋白的方法。如上文所提及，據悉固相基質最大結合效率pH值在2.0到10.0的範圍內，最可能在3，0到9.0的範圍內。因此，在接近所述最大值(當然，不同免疫球蛋白/固相基質組合的最大值可能不同)處進行分離過程最為適合。因此，含有免疫球蛋白(或一^L說來，蛋白質)的溶液的pH值優選在2.0到10的範圍內，諸如在3.0到9.0的範圍內。然而，^L配體類型和基質主鏈而定，pH值的範圍優選為3.0到7.0或6.0到9.0。據悉，當配體含有酸性基團時，含有免疫球蛋白的溶液的pH值優選在2.0到6.Q的範圍內，更優選在2.5到5.5的範圍內，諸如在3.0到5.5的範圍內，或在4.0到5.5的範圍內，這與所述特定類型基質的預期最大結合效率相對應。如本文所使用，"酸性基團"是指pKa值小於約6.0的基團。對於上述接觸步驟，已發現，不需要加入過量的易溶鹽來使免疫球蛋白與基質結合。因此，含有免疫球蛋白的溶液的總含鹽量(包括例如NaCl)只需要與至多2.0、優選在0.05到2.0的範圍內，諸如為0.05到1.4，尤其在0.05到1.0的範圍內的離子強度相對應。因而，作為另一個替代性要求，易溶鹽的濃度應儘可能低，由此，經證實，用易溶鹽的濃度為至多0.4M，優選為至多0.3M,尤其為至多0.2M，諸如為至多0.1M的含有免疫球蛋白的溶液操作是可能的。在特定實施例中，不使用易溶鹽。易；容鹽的實例4是供於"PurificationToolsforMonoclonalAntibodies"，Gagnon,P.,ValidatedBiosystems，1996中，其中提供霍夫邁斯特系歹'J(Hofmeisterseries)感膠離子(lyotropicion)。在特定實施例中，含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液的pH值在2.0到10.0的範圍內並且總含鹽量與至多為2.0的離子強度相對應。對於溶液中免疫球蛋白的濃度，據悉固相基質能夠在極寬的濃度範圍內操作，因此，認為對於含有免疫球蛋白的溶液中免疫球蛋白的濃度而言，固相基質在濃度在0.001到0.2mg/ml、優選0.01到0.1mg/ml的範圍內的雜交瘤細胞培養物上清液中操作與其在濃度範圍為0.2到2.0mg/ml的乳液和乳清中以及濃度範圍為5.O到20mg/ml範圍內的不同動物血清和血漿中並且甚至在濃度範圍為20-80mg/ml的初乳中操作同樣有效。已發現，本發明尤其適於包含每克固相基質免疫球蛋白在0.1到30mg的範圍內，諸如每克固相基質免疫球蛋白在0.2到2mg的範圍內或在5.0到25mg的範圍內的溶液。因此，含有免疫球蛋白的溶液可以是通過人工方法以及生物學方法衍生化等得到的免疫球蛋白溶液，諸如粗發酵肉湯；哺乳動物細胞培養物，諸如雜交瘤細胞培養物；來自經基因工程設計的微生物(諸如大腸桿菌(Aco7門)培養物的發酵肉湯；腹水，諸如小鼠和大鼠腹水；人類、小鼠、大鼠、牛、豬、兔、山羊、豚鼠和驢的乳液、乳清、血液、血漿和血清；和蛋黃，諸如雞蛋黃。此外，當含有免疫球蛋白的溶液包含帶負電的清潔劑時，可獲得高純度免疫球蛋白。不希望受任何理論的束縛，據悉清潔劑將抑制其它生物分子粘附到基質上。所述清潔劑的實例為硫酸辛酯、溴酚藍、辛烷磺酸鹽、月桂醯肌氨酸鈉和己烷磺酸鹽。在某些實施例中，不使用帶負電的清潔劑。同樣，在本發明方法的洗滌步驟中，可能出於相同的原因而有利地使用帶負電的清潔劑。所述清潔劑可單獨使用或與緩沖劑(例如，易溶鹽緩沖劑)組合使用。與在結合過程(操作(a))中使用易溶鹽相比，洗滌步驟中使用易溶鹽(小體積)僅產生極小廢物問題(因為在大多數情況中，結合過程包括使用大體積易溶鹽)。在某些實施例中，並未將清潔劑和易溶鹽用於洗滌步驟中。而且，甚至在洗脫步驟中不使用有機溶劑的情況下，也可表現用於本發明方法中的固相基質的優良特性，因此，優選所使用的洗脫液包含小於10%(v/v)、更優選小於5%的有機溶劑。最優選根本不使用有機溶劑。或者，可使用較大量的無毒溶劑(例如，丙二醇)，例如多達40%的丙二醇。可以各種方式進行接觸步驟以及後續步驟，即分離、洗滌和洗脫。所選擇的物理措施通常受規模和是否需要重複所述過程支配。根據本發明的固相基質可用於幾乎任何用於研發和工業目的的配置中。因此，可(例如)在經攪拌的分批方法、填充床色譜柱方法或流化床方法中使固相基質與含有免疫J求蛋白的溶液接觸。其它準則提供於"PurificationToolsforMonoclonalAntibodies"，Gagnon，P.，ValidatedBiosystems,'1996中。根據本發明進行免疫球蛋白分離的其它必需措施將遵循常規方法。對於免疫球蛋白的一些應用來說，免疫球蛋白極純，例如具有大於99%的純度，顯得特別重要。在打算將免疫球蛋白用作治療劑時，更是如此，而且極高純度也是其它應用所必需的。在診斷領域中，所需純度可視多種因素而定，諸如是否使用未衍生化的抗體，在使用未衍生化抗體的情況中，可能不需要高純度，即小於50%的純度；或是否用信號分子(諸如，酶，例如-束才艮過IU匕物醉(horseradishperoxidase))才示i己所述^元體，在才示i己4元體的情況中，通常需要抗體具有至少80°/。或更高的純度。對於其它應用來說，對於純度的需要可能相應地不同。不過，免疫球蛋白的純度以乾物質計為至少10%從而能夠適當使用所述產物似乎為一般的要求。然而，因為應當清楚明了，所以本發明提供解決這些問題的準則。如從上文所了解，本發明的目標是提供具有高結合效率的固相基質。此外，本發明的固相基質具有高穩定性。更具體來說，本發明的固相基質在能使基質再生的1MNa0H中穩定。在用於分離免疫球蛋白的方法中，含有蛋白質的溶液的總含鹽量優選與至多2.0，諸如在O.05到2.0的範圍內、尤其在0.05到1.4的範圍內、尤其在0.05到1.0的範圍內的離子強度相對應，和/或易溶鹽的濃度優選為至多0.4M，諸如為至多0.3M、尤其為至多0.2M,特別為至多0.1M。在某些實施例中，不使用易溶鹽來分離免疫球蛋白。用於分離蛋白質和其它生物分子的方法可用於多種蛋白質，所述蛋白質的實例為蛋白酶，諸如酶原(proenzyme)、胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酵(chytnotrypsin)、才古草^幹菌蛋白酵(subtilisin)、胃蛋白酵(pepsin)、血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)、木瓜蛋白酶(papain)、腎素(renin)、凝血酶(thrombin)和彈性蛋白酶(elastase);脂肪酶(lipase)、葡糖苦酶(glucosidase);木聚糖酶(xylanase);凝集素(lectin);白蛋白；來自發酵肉湯的蛋白質；來自乳液和乳清的蛋白質；來自血液、血漿和血清的蛋白質；來自魚類廢棄物的蛋白質；來自屠宰場廢棄物的蛋白質，諸如器官和組織提取物，例如來自牛腸的鹼性磷酸酶；和來自植物(諸如馬鈴薯、番茄、椰子)提取物的蛋白質，諸如辣根過氧化物酶。如本文所使用，術語"烷基"是指飽和直鏈、支鏈或環狀烴。優選烷基為C1-C10烷基。甚至更優選烷基為Cl-C5烷基。術語"CI-C10烷基"是指具有1-IO個碳原子的烷基，其可為直鏈、支鏈或環狀，諸如曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、十二烷基、環戊基、環己基、十氫化萘基等。術語"CI-C5烷基，，是指具有1-5個碳原子的烷基，其可為直鏈、支鏈或環狀，諸如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環戊基等。本發明化合物中所包括的烷基可一見情況經一個或一個以上取代基取代。術語"視情況經取代"旨在表示可經一個或一個以上、優選1-3個選自以下基團的基團取代的烷基羧基；經保護羧基，諸如羧酸酯，例如(Cl-C6)烷氧羰基；氨基羰基；單-和二((CI-C6)烷基)-氨基羰基；氨基-(CI-C6)烷基-氨基羰基；單-和二((Cl-C6)烷基)氨基-(CI-C6)烷基-氨基羰基；氨基；單-和二((C1-C6)烷基)氨基；(Cl-C6)烷基羰基氨基；羥基；經保護羥基，諸如醯氧基，例如(C1-C6)烷醯氧基；碸基；(Cl-C6)烷基磺醯氧基；硝基；苯基；苯基-(Cl-C6)烷基；卣素；次氮基；和巰基。如本文所使用，術語"亞烷基"是指具有兩個連接點的烷基。術語"(C1-C10)亞烷基"是指具有1到10個碳原子的亞烷基。亞烷基的非限制性實例包括亞甲基(-CH廣)、亞乙基(-CH2CH2-)、亞正丙基(_CH2CH2CH2-)、亞異丙基(-CH2CH(CH3)-)等。術語"(C1-C5)亞烷基，，是指具有1到5個碳原子的亞烷基。亞烷基的非限制性實例包括亞曱基(-CH廣)、亞乙基(-CH2CH2-)、亞正丙基(-CH2CH2CH2-)、亞異丙基(-CH2CH(CH3)-)等。亞烷基可視情況經一個或一個以上取代基取代。如本文所使用，術語"烯基"表示具有至少一個碳碳雙鍵的飽和直鏈、支鏈或環狀烴。優選烯基為C2-C1Q烯基。術語"C2-C10烯基"是指具有2到10個碳原子的烯基。代表性直鏈和支鏈(C2-C10)烯基包括乙烯基、烯丙基、l-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1_戊烯基、2-戊烯基、3-曱基-l-丁烯基、2-曱基-2-丁烯基、2，3-二曱基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、l-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、l-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基等。烯基可視情況經一個或一個以上取代基取代。如本文所使用，術語"亞烯基"是指具有兩個連接點的烯基。亞烯基可視情況經一個或一個以上取代基取代。如本文所使用，術語"炔基"表示具有至少一個碳碳三鍵的飽和直鏈、支鏈或環狀烴。優選炔基為C2-C10炔基。術語"C2-C10炔基"是指具有2到10個碳原子的炔基。代表性直鏈和支鏈炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-曱基-1-丁炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2_己炔基、5-己炔基、l-庚炔基、2-庚炔基、6-庚炔基、1-辛炔基、2_辛炔基、7-辛炔基、l-壬炔基、2-壬炔基、8-壬炔基、l-癸炔基、2-癸炔基、9-癸炔基等。炔基可視情況經一個或一個以上取代基取代。如本文所使用，術語"亞炔基，，是指具有兩個連接點的炔基。亞炔基可視情況經一個或一個以上取代基取代。如本文所使用，術語"卣素，，是指-Cl、-F、-Br或-I。實例實例1配體的合成(1)(lH-苯並[d]咪唑-2-基)-曱烷疏醇(4)formulaseeoriginaldocumentpage28向在50%v/v鹽酸(20ml)中的1，2-苯二胺(1.88g，17隱ol)中加入2-巰基乙酸(1.3ml,1.7g，19mmol)。在氮氣氛下，在60。C下將反應混合物加熱，隨後在9(TC下加熱，歷時48小時。此時再加入2-巰基乙酸(400ul,530mg,6mmol)。通過HPLC分析樣本。將反應混合物冷卻並且用40%v/vNaOH中和到pH5。將所得固體用水(50ml)洗滌並且在真空下乾燥得到(1H-苯並[d]咪唑-2-基)-曱烷硫醇l."g,93%產率，Rt=7.6min,純度>95%;以及二硫化物(Rt=8.0min)4%。力畫R(d6-DMSO，400MHz)14.3ppm(bs,0.5H),7.46ppm(m，2H)，7.13(m，2H),4.17ppm(s0.1H)。MS(電噴霧+)164mz(M+)，131m/z(M-SH)。(2)5-(2H-四唑-5-基)-1,3-二氫苯並咪唑-2-碌l嗣向在2-丙醇(15ml)和水(30ml)中的4-氨基-3-竭基千腈(4.98g，36mol)中加入溴化鋅(13.80g，61mmol)，隨後加入疊氮化鈉(5.81g，89mmol)。在80°C下將反應混合物加熱10小時。將反應冷卻且隨後通過HPLC進行分析。加入水(15ml)並且用50%(v/v)HC1將^f登色混合物調到pH3.0。將固體用水(50ml)洗滌並且在烘箱中於90。C下乾燥得到橙黃色固體2-硝基-4-(2H-四唑-5-基)-苯胺(6.59g)，Rt=8.8min，]H麗R(d6-DMSO,40謹Hz)8.47ppni(1H，d，2Hz)，7.86ppm(1H,dofd，9Hz，2Hz)，7.58卯m(2.3Hbs)，6.96ppm(1Hd,9Hz)。MS(電噴霧+)206m/z(M+)，228m/z(M+Na)。向在曱醇(450ml)和40%(v/v)鹽酸(20ml)中的2-硝基-4-(2H-四唑-5-基)-苯胺(6.80g)中加入碳載鈀(10%)。將反應容器排空並且使用氣^^向其中裝入氫氣。4小時後，通過HPLC分4斤反應。加入水(100ml)並且過濾反應混合物。用50%v/v曱醇水溶液(100ml)洗滌催化劑。在減壓(175毫巴(mBar)，隨後50毫巴)下於40°C下蒸發溶劑得到褐色固體4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺二鹽酸鹽(6.45g),Rt=4.9min。'HNMR(d6-DMS0，400MHz,)7.82卯m(1Hd，2Hz),7.67卯m(1H，dofd，8.5Hz，2Hz),7.03卯m(1H,d，8.4Hz)，MS:(電噴霧+)176,8m/z(M+)，198.7m/z(M+Na)。向在乙腈(100ml)中的4-(2H-四。坐-5-基)-苯-l，2-二胺二鹽酸鹽(6.40g，25mmol)中力口入石克代羰基二咪峻(4.86g，28mmol)。再力口入100ml乙腈。隨後將反應攪拌5小時並且通過HPLC分析反應。減壓去除溶劑並且加入水(100ml)。將反應混合物的pH值調到pH2.0並且將固體過濾並用水(50ml)洗滌。乾燥所述物質得到5-(2H-四唑-5_基)-1,3-二氫苯並咪唑-2-硫酮(3.35g,61°/。產率)。將所述物質懸浮於水(300ml)中並且用40%(v/v)NaOH將pH值調到11.0。接著加入曱醇(15ml)，隨後加入活性碳(0.38g)並且將混合物攪拌1小時。過濾混合物並且在減壓下將溶劑去除到其體積的一半。用50%(v/v)鹽酸將pH值調到2.0得到灰白色固體。將固體濾出並且用水洗滌。通過HPLC分析，純度>98%，Rt=7.8min。乾燥所述物質得到5-(2H-四唑-5-基)-1,3_二氫苯並咪唑-2-疏S同(2.37g)。)HNMR(d6—DMSO，400MHz)12.88ppm(lH，s),12.84ppm(1H，s)，7.82卯m(lH，dd，8.4Hz,1.6Hz)，7.78卯m(1H，m),7.30ppm(1H,d，8Hz)。MS(高解析度EI):實驗值218.036514m/zC8H6N6S,質量準確度+4卯m。(3)5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑-2-基-胺(1)將在水(45ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-苯-l,2-二胺鹽酸鹽(8.56g，34mmol)調到pH6.0。加入溴化氰(3.91g,37mmol)並且將混合物攪拌4小時。通過HPLC分析反應混合物。用40%(v/v)氫氧化鈉將反應混合物的pH值調到pH4.0。將混合物冷卻到4。C並且將褐色固體過濾並用水洗滌。乾燥所述物質得到褐色固體5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯並咪。坐-2-基-胺(4.10g)，純度為88%,Rt=7.3min。用50%(v/v)鹽酸將粗品5-(2H-四唑-5_基)-111-苯並咪唑-2-基胺(4.10g)於水(40ml)中的懸浮液的pH值調到1.2。隨後加入活性碳(0.2g)並且將混合物攪拌18小時。過濾混合物並且將濾液的pH值調到pH3.7得到棕褐色固體。將所述物質(3.01g)乾燥並且通過HPLC分析，純度大於97%。WNMR(d6-DMSO，400MHz)13.04卯m(0.3H，s)，12.99卯m(O.3H，s)，8.85ppm(1H,s)，8.074ppm(lH，s)，7.96卯m(dd，8.4Hz，1.2Hz),7.55ppm(d，8.4Hz)。MS(電噴霧+)201.8m/z(M+)，223.7rn/z(M+Na)。(4)[5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑-2-基]-曱烷硫醇鹽酸鹽(3)向在50°/。(v/v)(50%)鹽酸(105ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-笨-l，2-二胺二鹽酸鹽(9.40g，37.7mmol)中加入2-巰基乙酸(2.4ml，3.18g，34.5mmol)並且在氮氣氛下於ll(TC下將反應混合物加熱48小時。24小時後再加入5充基乙酸(0.5ml,0.66g，7.20mmol)。將反應混合物;令卻且通過HPLC分析樣本。將綠色固體濾出並用水洗滌。在真空(90毫巴)下於50。C下乾燥固體得到[5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑_2-基]-曱烷硫醇鹽酸鹽(5.27g,65%產率)，Rt=7.4min，通過HPLC分析，純度大於97%。H麗R(d6-DMS0，400MHz)8.49ppm(1H，m)，8.22卯m(1H，dd，8.8Hz，1.6Hz),7,95卯m(lH，m，9.2Hz)，4.67ppm(0.3H,s)，4.24ppm(2H，s)。MS:(電噴霧+)233.Om/z(M+H)，463.Qm/z(2M-H)。(5)[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯並咪唑-2-基]-曱胺(2)向在50%(v/v)鹽酸(50ml)中的4-(2H-四哇-5-基)-苯-1,2-二胺二鹽酸鹽(6.40g，25.7mmol)中加入甘氨酸(2.60g，34隱ol)並且將混合物加熱到13(TC歷時120小時。在所述時間過半時再加入甘氨酸(2.01g,26.7,ol)。此後，通過HPLC分析反應。用40%v/vNaOH將反應混合物的pH值調到4.0。將反應混合物冷卻到4。C並且將深色產物濾出並用水(100ml)洗滌。將粗產物(5.62g)乾燥並且純度為93%,Rt=7.0min。將所述粗產物懸浮於水(50ml)中並且用50%v/v鹽酸將pH值調到1.4。隨後加入活性碳(0.59g)並且在20-25。C下將混合物攪拌18小時。將碳濾出並用水洗滌。用40%(v/v)NaOH將pH值調到4.0得到淺橙色固體，在真空下進行乾燥得到[5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑1-2-基]-曱胺(4.22g)。通過HPLC分析，純度大於98%。'HNMR(d6-腿SO,400MHz)8.31ppm(lH，s)，7.96卯ra(1H,d，6.4Hz),7.70ppm(1H，d,6.4Hz)，4.38(2H，s)。MS:(電噴霧+)216.2m/z(M+H)，239.2m/z(M+Na)。MS(高解析度EI):實驗值215.092339m/zC,H具,質量準確度-1.8卯m。實例2配體在固相主鏈上的固定通用程序向在麗P(2ml)中的配體(4，1隱ol)中加入水(7ml)，隨後加入溴活化的烯丙基化交聯瓊脂糖(10ml，150wmol/ml烯丙基)。隨後加入10M氫氧化鈉(1ml)並且在20-25。C使混合物翻滾18小時。[對於含有石克醇官能團的配體，加入少量NaBH丄用10cvNMP、水、0.5MHC1、水、0.5MNaOH且隨後2Qcv水洗滌凝膠。通過HPLC分析濾液配體。將凝膠懸浮於含有0.5MHC1的5W乙醇中，隨後用10cv乙醇、水、0.5MNaOH和20cv水洗滌。通過酸量滴定和元素分析來分析凝膠。5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑-2-基-胺(1)向在畫P(2ml)和水(7ml)中的5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯並咪唑-2-基-胺(838mg，4.1隱ol)中加入10ml溴活化的烯丙基化[150umol/ml烯丙基]交聯6%瓊脂糖，隨後加入IOM氳氧化鈉(1ml)。20-25。C下使混合物翻滾18小時。用10cvNMP、水、0.5MHC1、水、0.5MNaOH且隨後20cv水洗滌凝膠。通過HPLC分析濾液配體。將凝膠懸浮於含有0.5MHC1的50%乙醇中，隨後用10cv乙醇、水、.5MNaOH和20cv水洗滌。滴定得到77ymol/ml的值，基於氮進行元素分析得到61iimol/ml。5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氫苯並咪唑-2-硫酮以與上述類似的程序，使用5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氫苯並咪唑-2-闢u嗣(676mg，4.1mmol)和NaBH4(3mg)進行製備。滴定得到133iimol/ml的值，基於氮進行元素分析得到177iimol/ml。[5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑-2-基]-曱烷硫醇鹽酸鹽(3)以與上述類似的程序，使用[5-(2H-四唑-5-基)-lH-苯並咪唑-2-基]-曱烷硫醇鹽酸鹽(1.142g，4.2mmol)和NaBH4(3mg)進行製備。滴定得到78ymol/ml的值，基於氮進行元素分析得到61pmol/ml。[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯並咪唑-2-基]-曱胺(2)以與上述類似的程序，使用[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯並咪唑-2-基]-曱胺(545mg,4.6mmol)進行製備。滴定得到76iimol/ml的值，基於氮進行元素分析得到49timol/ml。根據上文所述的程序製備具有2-氨基苯並咪唑或1H-苯並[d]咪唑-2，6-二胺(5)作為配體的固相基質。實例3免疫球蛋白結合容量和純度的測量靜,杏力/^7容J^^Wf用2mL配體-瓊脂糖樣本填充兩個一次性柱(柱燒結料(columnfrit)以上46mm)以供各基質樣本的測試，包括一個參考柱。使瓊脂糖在重力作用下在pH值為7.4的PBS緩衝液中沉降。對各柱進行適當標記。將350mg人類IgG溶解於7mlpH值為7.4的PBS緩沖液中以供各柱的測試。使人類IgG溶液濾過0.22um的過濾器。通過連續稀釋製備經過濾IgG溶液的1:50稀釋液並且如下計算IgG的濃度人類IgG濃度(mg/mL)=0D28。nmX50/1.38。IgG溶液的濃度為35-45mg/mL。用5mLPBS緩沖液洗滌各柱4次。將5mLIgG溶液裝載於各柱上並且將流出液(flowthrough，FT)收集於萬能玻璃容器(glassuniversal)中。用5mLPBS緩沖液洗滌各柱4次以去除任何未結合的IgG並且將洗滌液收集到含有流出液的萬能玻璃容器中。用10mL0.1M甘氨酸/HC1緩衝液(pH2)洗脫結合的IgG並且將洗脫液收集到萬能玻璃容器中。將兩個萬能玻璃容器混合約5分鐘。使用分光光度計和1.5mL石英比色管測量各萬能玻璃容器中IgG的OD28。m。當測量流出液和洗滌液時，將PBS用作空白對照，而當測量洗脫液時，將O.1M甘氨酸/HC1緩衝液用作空白對照。通過測量床高(mm)來測定所述柱中配體-瓊脂糖的體積。用流出液、洗滌液和洗脫液中IgG的總量除以所裝載IgG的總量，計算回收百分比。用洗脫液中IgG的量除以柱體積，計算IgG容量(mg/mL)。用基質中配體的量(mg)除以所洗脫IgG的量，計算配體利用值(mg/ml)。>^磬動,悉容#^源/#使用標準動態容量方法(20%穿透(breakthrough,BT),10%BT+10°/。非結合)和標準緩沖液，將2ml各樣本填充到0mnifit柱中並且將hlgG施加到20。Z。穿透。隨後洗脫蛋白質並且清洗柱，測量洗脫液的OD訓並且記錄所施加hlgG的體積。測量條件如下流速2.5min葉亭留時間(0.8ml/min)平衡緩沖液PBSpH7.4裝載量1mg/mlIgGPBSpH7.4洗滌液PBSpH7.4洗脫液Q.1M甘氨酸，pH2清洗液Q.5MNaOH通過以下程序測定為達到20%BT所需的IgG的量。使IgG溶液以旁通模式通過含有所關注的固相基質的測試柱，直到達到平穩水平。測量IgG的量(以mAU為單位)。將等於流出液中IgG量的20%的量的IgG裝載於填充有固相基質的另一個柱上，隨後洗滌柱並將IgG從4主上洗脫。絲容#翁、浙使用標準進料方法和標準緩衝液，將2ml各樣本填充到Omnifit柱(0.66cm)中並且施加Anti-nip進料直到達到20%穿透(如通過單獨蛋白質A柱所測定)。隨後洗脫蛋白質並且清洗柱。分析條件如下流速2.5min停留曰寸間(0.8ml/min)平衡緩沖液PBSpH7.4裝載量Anti-nip(波動74&75)pH7.4洗滌液PBSpH7.4洗脫液Q.1M檸檬酸鈉pH3清洗液G.5MNaOH通過以下程序測定為達到20%BT所需的Anti-nip進料的量。將AnU-nip進料裝載於含有所關注的固相基質的測試柱中直到流出液達到穩定。將流出液按等分試樣收集並且分析IgG含量(使用蛋白質A親和柱)。當開始進料中IgG的raAu(於蛋白質A親和柱上分析)等於測試柱流出液中IgG的mAu時，確定為100%BT。將與20%BT對應的Anti-nip進料的量裝載於填充有所關注的固相基質的另一個柱上，隨後洗滌柱並將IgG乂人;f主上洗脫。^j迷/f染^潛合^^:使用CHO培養基5研究本發明基質的顏色結合和雜質結合。收集穿透液(BT)和洗滌液、洗脫液、清洗液(含P/。十六烷基三曱基溴化銨(hexadecyltrimethylammoniumbromide,hexa),pH1.5)和最終0.5MNaOH洗滌液，並且記錄OD訓咖值。1.在小型重力進料柱中測量1ml各基質樣本並且使用15mlPBS(pH7.4)進行平衡。2.施加10ralCHO培養基5並使其滴過所述柱，將BT收集於萬能玻璃容器中，隨後施加IOmlPBS並且將此流出液(FT)收集於同一容器中。3.施加10ml洗脫緩沖液0.1M甘氨酸(pH2)並且收集FT。4.施加10mlhexa(pH1.5)並且收集起來用於清洗基質。5.隨後施加10ml0.5MNaOH並且收集起來以確保所有結合的汙染物都被洗掉，從而能夠進行質量平衡計算.6.隨後讀取所有樣本的OD28Qnm,以便進行直接比較。將OD飾m值轉換成佔所獲得總002,的百分比。1.在每個階段讀取各樣本的OD28ta，即BT+W、洗脫液、清洗液和NaOH洗滌液。2.隨後將此值乘以任何稀釋倍數。3.經稀釋倍數調整後，接著將OD值乘以所述部分的毫升數，即BT+W為20ml，其它步驟為10ml。4.然後將總OD計算為各部分的OD值乘以各部分的毫升悽t之後的總和。5.隨後使用總OD計算各階段中汙染物的百分比。實例4本發明基質的結合性能靜,悉容量根據上文所述的程序測量具有配體的基質1、2、3、4或5(樣本1、2、3、4或5)的靜態容量。還測量具有2-氨基苯並咪唑作為配體L的固相基質的靜態容量作為對照。表l-5概述靜態容量數據tableseeoriginaldocumentpage35表1.樣本1的靜態IgG結合容量tableseeoriginaldocumentpage35表2.樣本2的靜態IgG結合容量tableseeoriginaldocumentpage35tableseeoriginaldocumentpage36表3.樣本3的靜態IgG結合容量tableseeoriginaldocumentpage36表4.樣本4的靜態IgG結合容量tableseeoriginaldocumentpage36表5.樣本5的靜態IgG結合容量如表1-4中所示，樣本1-5具有可與對照樣本比擬或優於對照樣本的靜態結合容量。具體說來，樣本1和5具有比對照樣本高得多的配體利用值。絲容#使用Anti-nip進料測量樣本l-5的進料容量並且將數據概括於表6中。還測量具有2-氨基苯並咪唑作為配體的固相基質的進料容量作為對照。使用PrA柱測定所洗脫IgG的純度。通過用與PrA柱結合的IgG的量除以由測量OD騰J斤測定的經洗脫IgG的總量來計算純度百分比。tableseeoriginaldocumentpage36表6.樣本1-4的進料IgG結合容量。*基於兩次測定。如表6中所示，樣本1和5具有與對照品類似的Anti-nip容量。然而，從樣本1洗脫的IgG的純度高於從對照樣本洗脫的IgG的純度。樣本2和3具有與對照樣本類似的前沿分析值和較低的洗脫值，這表明，樣本2和3與IgG的結合比對照樣本與IgG的結合強。然而，從樣本2和3洗脫的IgG的純度顯著高於對照樣本。與對照樣本相比，樣本4具有略低的Anti-nip結合容量。還通過觀察洗脫溶液(用pH值為3的0.1M檸檬酸鈉洗脫的溶液)的顏色和解吸溶液(stripsolution)(用0.5MNaOH洗滌液收集的溶液)的顏色來比較樣本1-5的雜質結合與對照樣本的雜質結合。對照樣本的洗脫溶液和解吸溶液渾濁並且呈黃色。樣本1的洗脫溶液和解吸溶液澄清並且略帶黃色。樣本2的洗脫溶液澄清並且略帶黃色。樣本3的洗脫溶液澄清並且無色。樣本4的洗脫溶液無色並且略顯渾濁。樣本5的洗脫溶液澄清並且無色。因此，樣本l-5都具有比對照樣本弱的顏色結合。)^/^動在潛合容#測量樣本1-4的多克隆動態結合容量並且與對照樣本(具有2-氨基苯並咪唑作為配體L的固相基質)相比較。室溫下用20%BT和2.5min的停留時間得到的結合容量數據列於表7中。tableseeoriginaldocumentpage37表7.樣本1-4和對照樣本的多克隆IgG動態結合容量數據。樣本1和4具有與對照樣本類似或略低的多克隆動態結合容量。^C朋5潛#差遽/尹染#趁^使用CH05培養基測量樣本1、2和4的雜質結合。還對對照樣本和XL烯丙基化瓊脂糖珠粒(未固定有配體但經歷固定程序的瓊脂糖珠粒)的雜質結合進行測量。將結合數據概述於表8-10中。tableseeoriginaldocumentpage38表8.使用CHO5培養基進行的樣本1、對照樣本和XL烯丙基化瓊脂糖的雜質結合。tableseeoriginaldocumentpage38表9.使用CHO5培養基進行的樣本1、對照樣本和XL烯丙基化瓊脂糖的雜質結合。formulaseeoriginaldocumentpage38表10.使用CHO5培養基進行的樣本4、對照樣本和XL烯丙基化瓊脂糖的雜質結合。如表8-IO中所示，與對照樣本相比，樣本l、2和4結合顯著較少的雜質。儘管已參考本發明的實例實施例特別展示和描述本發明，但所屬領域技術人員應了解，在不偏離隨附權利要求書所涵蓋的本發明範圍的情況下，可對形式和細節進行各種變更。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。權利要求1、一種從含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液中分離出免疫球蛋白的方法，其包含a)使所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液與以下通式的固相基質接觸M-SP-L，其中M表示所述基質的主鏈，SP表示間隔基，且L表示由結構式(I)所示的配體或其互變異構體，其中R1為-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3；R2為-H、-滷素、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2，或R3在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R5在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Z為單鍵、視情況經取代的亞烷基、視情況經取代的亞烯基或視情況經取代的亞炔基；n為0到4的整數；條件是L不為2-巰基-5-硝基-苯並咪唑、2-氨基-苯並咪唑、2-巰基苯並咪唑和2-氨基甲基-苯並咪唑；b)使結合有免疫球蛋白的所述固相基質與所述溶液分離；C)視情況洗滌所述固相基質；和d)使所述固相基質與洗脫液接觸以便將所述一種或一種以上免疫球蛋白從所述固相基質釋放，由此分離所述免疫球蛋白。2、根據權利要求1所述的方法，其中L表示由結構式(II)所示的配體或其互變異構體。3、根據權利要求3所述的方法，其中L表示由以下結構式所示的配體:formulaseeoriginaldocumentpage3或其互變異構體。4、根據權利要求3所述的方法，其中R5為-H。5、根據權利要求1所述的方法，其中Z為單鍵並且n為1。6、根據權利要求5所述的方法，其中R;為-H。7、根據權利要求1所述的方法，其中L表示由以下結構式所示的配體:formulaseeoriginaldocumentpage3或formulaseeoriginaldocumentpage48、根據權利要求1所述的方法，其中所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液的pH值在6.0到10.0的範圍內。9、根據權利要求1所述的方法，其中所述基質主鏈為瓊脂糖。10、根據權利要求1所述的方法，其中所述間隔基SP是由下式表示-(0-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m為1到10的整數。11、根據權利要求1所述的方法，其中所述基質主鏈為瓊脂糖；所述間隔基SP是由下式表示-(0-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m為1到3的整數；且所述配體L是由以下結構式表示formulaseeoriginaldocumentpage4或formulaseeoriginaldocumentpage4。12、根據權利要求1所述的方法，其中所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液具有在2.0到10.0的範圍內的pH值。13、根據權利要求12所述的方法，其中所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液具有與至多2.0的離子強度對應的總含鹽量，並且易溶鹽的濃度為至多0.4M。14、根據權利要求13所述的方法，其中所述含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液不具有易溶鹽。15、一種由以下通式表示的固相基質M-SP-L，其中M表示所述基質的主鏈，SP表示間隔基，且L表示由結構式(I)所示的配體或其互變異構體，其中Ri為-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-0R3;R2為-H、-卣素、-0R4、-NH2、-烷基、-N02、-S03H、-N(R3)C(0)N(R3)2,R3在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；R4在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Rs在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代的烷基；Z為單鍵、視情況經取代的亞烷基、視情況經取代的亞烯基或視情況經取代的亞炔基；n為0到4的整數；條件是L不為2-巰基-5-硝基-笨並咪唑、2-氨基-苯並咪唑、2_巰基苯並咪唑和2-氨基曱基-苯並咪唑。16、根據權利要求15所述的固相基質，其中L表示由結構式(II)所示的配體或其互變異構體。17、根據權利要求16所述的固相基質，其中L表示由以下結構式所示或其互變異構體。18、根據權利要求17所述的固相基質，其中Rs為-H。19、根據權利要求15所述的固相基質，其中Z為單鍵並且n為l。20、根據權利要求19所述的固相基質，其中R3為-H。21、根據權利要求15所述的固相基質，其中L表示由以下結構式所示《勺酉己#:formulaseeoriginaldocumentpage7或。22、根據權利要求15所述的固相基質，其中所述基質主鏈為瓊脂糖。23、根據權利要求15所述的固相基質，其中所述間隔基SP是由下式表示-(O-CH線卿-CfU"其中m為l到IO的整數。24、根據權利要求15所述的固相基質，其中所述基質主鏈為瓊脂糖；所述間隔基SP是由下式表示-(0-CH2CH2(OH)-CH2)m-,其中m為l到3的整數；且所述配體L是由以下結構式表示formulaseeoriginaldocumentpage7或25、一種由以下結構式所示的化合物:formulaseeoriginaldocumentpage8全文摘要本發明是關於一種苯並咪唑化合物及其作為色譜配體的用途，是使用由式M-SP-L所示的固相基質從含有一種或一種以上免疫球蛋白的溶液中分離和/或純化免疫球蛋白的方法，在所述式M-SP-L中，M表示基質主鏈，SP表示間隔基並且L表示經取代的苯並咪唑配體。文檔編號C07K1/14GK101220077SQ20081000233公開日2008年7月16日申請日期2008年1月8日優先權日2007年1月11日發明者凱薩琳·露易絲·安谷絲,安德魯·雷迪亞特,維多莉亞·珍·韓德森,高登·R·杜芬申請人:米勒波爾英國有限公司