細胞粘附分子5單克隆抗體、製備方法及應用的製作方法
2023-05-16 22:10:01
專利名稱：細胞粘附分子5單克隆抗體、製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及到一種單克隆抗體及其製備方法，具體地說是細胞抗粘附分子5(ICAM5)單克隆抗體及其製備方法。
背景技術：
細胞粘附分子5 (Intercellularadhesionmolecule5, ICAM5)是人 ICAM5 基因編碼蛋白，屬於免疫球蛋白超家族成員中的ICAM家族成員。所有ICAM蛋白是I型跨膜糖蛋白，擁有2-9個免疫球蛋白C2區樣結構域，可結合白細胞整合相關抗原(LFA-1)。ICAMl在大腦中的非神經細胞表面表達，而ICAM5隻在神經細胞表面表達，具有神經元之間同種粘附和神經元與淋巴細胞之間異種粘附兩種粘附活性。ICAM5可表達於神經細胞胞體和突起表面，通過與LFA-1結合發揮粘附依賴性功能。ICAM5可通過相鄰神經元單體之間的相互作用，誘導神經突起形成；同時，可通過粘附依賴性作用激活淋巴細胞，參與中樞神經免疫反應。因此，ICAM5對於中樞神經發育，突觸傳遞及免疫等具有重要作用；ICAM5也因此成為開展中樞神經發育、功能及免疫機制研究的重要靶位。然而，目前市場上銷售的商品化的ICAM5抗體均為多克隆抗體，活性較低且試驗結果很不穩定，直接影響到實驗研究的深入開展。
發明內容
本發明的首要目的在於提供一種能與細胞粘附分子5 (ICAM5)特異性結合的單克隆抗體。本發明的第二目的在於提供生產上述單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本發明的第三目的在於提供利用上述細胞株製備抗體的製備方法。本發明的再一目的 在於提供製備所述單克隆抗體的抗原多肽。為了達成上述的發明目的，本發明採用如下具體技術方案:一種雜交瘤細胞株，其於2012年2月17日保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編:100101，保藏編號為CGMCCN0.5798。細胞粘附分子5單克隆抗體，所述單克隆抗體由所述的保藏編號為CGMCCN0.5798的雜交瘤細胞株產生的。所述單克隆抗體重鏈可變區序列如序列表SEQIDN0.2所示，輕鏈可變區序列SEQIDN0.3 所示。一種用於製備細胞粘附分子5單克隆抗體的抗原多肽，所述多肽的胺基酸序列如SEQIDN0.1 所示。所述的單克隆抗體在製備檢測細胞粘附因子5試劑盒中的應用。所述試劑盒組成如下:ICM5單克隆抗體I支，包裝100μ 1，抗體來源:小鼠亞型IgGl，大小:約140KD ；免疫螢光染色常用試劑I份；和/或
蛋白印跡試驗常用試劑I份。利用所述細胞株製備所述的單克隆抗體的方法，所述方法步驟如下:(I)擴增保藏編號為CGMCCN0.5798的雜交瘤細胞株；(2)腹腔注射動物，回收腹水；(3)從腹水中分離得到抗細胞粘附因子5單克隆抗體。本發明的有益效果如下:1.本發明提供ICAM5單克隆抗體，可用於針對ICAM5抗原的免疫螢光和蛋白印跡(Westernblotting)檢測以及科學研究等用途,經試驗驗證在人及小鼠神經細胞表面有很高的表達並且表達穩定。2.抗體特異性強，並且效價高，ELISA檢測效價可達1:400000，因此試驗中ICAM5抗體使用濃度較低，抗體用量少。2.1CAM5抗原位於神經細胞胞體及神經纖維表面，因此免疫螢光染色可清晰展示神經細胞胞體及神經纖維結構。
圖1為小鼠融合前血清ELISA檢測結果曲線圖(橫坐標為表I所示的9個不同的效價梯度，縱坐標為0D450值)；圖2為免疫螢光顯示3株ICAM5單克隆抗體均可在小鼠神經細胞表面表達(三株ICAM5抗體免疫螢光(C y3標記二抗)在小鼠神經細胞胞體和突起顯著表達，DAPI染細胞核為藍色(100X油鏡下))；圖3為Westernblotting顯示3株ICAM5單克隆抗體均可在人腦組織蛋白表達，分子量為140KD，β -actin為陽性對照。
具體實施例方式實施例1ICAM5單克隆抗體製備1.多肽抗原合成從人ICAM5蛋白序列中細胞粘附分子I第二免疫球蛋白樣區域(Ig2-1CAM-l-like, ICAMl-⑶54)間斷選擇6段胺基酸序列進行多肽合成(第30-220位胺基酸)。多肽合成由艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司完成，6段多肽序列如下:RCARRT\LQARARGLIRT\FQRGLRWLARQL\VRASLTLTLLRTSLR\RNGTQRLQPRVAFV\ERRRSFAGEPPR,分子量 34KD，純度 >90%。合成的多肽序列如SEQ ID N0.1所示:RCARRTLQARARGLIRTFQRGLRWLARQLVRASLTLTLLRTSLRRNGTQRLQPRVAFVERRRSFAGEPPR2.動物免疫將合成的多肽抗原免疫鼠齡為8 12周的雌性BALB/C健康小鼠3隻。採取小鼠快速免疫方式。初次免疫:抗原50ug/只，加福氏完全佐劑(抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀)皮下多點注射，體積1.5ml。
第二次免疫:初次免疫後間隔3周行第二次免疫，劑量途徑同上，加福氏不完全佐劑。第三次免疫:第二次免疫後間隔3周行第三次免疫，劑量同上，不加佐劑，腹腔注射，7天後採血測其效價，檢測免疫效果(見表I和圖1)。1小鼠融合前血清ELISA檢測數據表
權利要求
1.一種雜交瘤細胞株，其特徵在於，其保藏編號為CGMCC No. 5798。
2.細胞粘附分子5單克隆抗體，其特徵在於，所述單克隆抗體由權利要求I所述的保藏編號為CGMCC No. 5798的雜交瘤細胞株產生的。
3.如權利要求2所述的細胞粘附分子5單克隆抗體，其特徵在於，所述單克隆抗體重鏈可變區序列如序列表SEQ ID No. 2所示，輕鏈可變區序列SEQ ID No. 3所示。
4.一種用於製備細胞粘附分子5單克隆抗體的抗原多肽，其特徵在於，所述多肽的胺基酸序列如SEQ ID No. I所示。
5.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測細胞粘附因子5試劑盒中的應用。
6.利用權利要求I所述細胞株製備權利要求2所述的單克隆抗體的方法，其特徵在於，所述方法步驟如下 ⑴擴增保藏編號為CGMCC No. 5798的雜交瘤細胞株； ⑵腹腔注射動物，回收腹水； ⑶從腹水中分離得到抗細胞粘附因子5單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了細胞粘附分子5(ICAM5)單克隆抗體、製備方法及應用，其雜交瘤細胞株保藏編號為CGMCC No.5798。本發明提供ICAM5單克隆抗體，可用於針對ICAM5抗原的免疫螢光和蛋白印跡(Western blotting)等科學研究，經試驗驗證在人及小鼠神經細胞表面有很高的表達並且表達穩定。抗體特異性強，並且效價高，ELISA檢測效價可達1400000，因此試驗中ICAM5抗體使用濃度較低，抗體用量少。ICAM5抗原位於神經細胞胞體及神經纖維表面，因此免疫螢光染色可清晰展示神經細胞胞體及神經纖維結構。
文檔編號C12R1/91GK103255108SQ20131006546
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者陳德喜, 張玉林, 李寧, 石英, 宋鳳麗, 丁謂, 喬錄新, 侯慶生, 徐樹瑩 申請人:首都醫科大學附屬北京佑安醫院