漿細胞鑑定和分離用螢光探針以及使用該探針的漿細胞的鑑定或分離方法
2023-05-16 05:57:16
專利名稱：漿細胞鑑定和分離用螢光探針以及使用該探針的漿細胞的鑑定或分離方法
技術領域：
本發明涉及漿細胞和漿母細胞的鑑定和分離用螢光探針以及使用該探針的漿細胞和漿母細胞的鑑定或分離方法。
背景技術：
抗體通過與靶抗原特異性結合，在生物體防禦中發揮重要的作用。近年來，利用抗 體對抗原的特異性結合性的抗體藥物是作為自身免疫疾病或癌症等疑難病的治療藥開發，其有用性得到很高評價。近年來，對於可製成這樣的抗體藥物的、高特異性·高親和性單克隆抗體的高效製作技術的開發需求日益增高，因此，正在建立使用基因克隆法，由人和小鼠的抗體生成細胞製作抗原特異性單克隆抗體的方法。該方法主要包含以下3個步驟(I)由完成了免疫的動物的末梢血、淋巴組織分離抗體生成細胞，(2)由抗體生成細胞克隆免疫球蛋白基因，(3)通過免疫球蛋白基因導入宿主細胞來生成抗體。為了採用本技術高效率地製作單克隆抗體，首先必須高純度地分離抗體生成細胞。抗體生成細胞通常採用B淋巴細胞或其最終分化而成的漿細胞和漿母細胞。漿細胞和漿母細胞是B淋巴細胞最終分化所得，是為抗體生成而特化的細胞。由於已經進行了被稱為親和力成熟的抗體基因的體細胞突變和由抗原進行的選擇，因此，這些細胞對於結合能力高的抗體的分離特別有用。但是，漿細胞和漿母細胞是含有若干亞型的不均一的細胞群，在淋巴組織內的存在率低，為O. 1%以下，因此難以高純度分離。目前，對於從末梢血或淋巴結中鑑定·分離漿細胞和漿母細胞，必須進行至少將3種以上的細胞表面標記物的抗體組合的多個階段的正向·反向篩選操作(非專利文獻I)。現有技術文獻 非專利文獻
非專利文獻 I :Sanderson, R. D. , Lalor, P. , Bernfield, Μ. B lymphocytesexpress and lose syndecan at specific stages of differentiation: CellRegulation 1: 27-35 (1989)
非專利文獻 2 :Horst，A. Hunzelmannj N. Arcej S. Herberj M. Manzj R. A.Radbruchj A. Nischtj R. Schmitz, J. Assenmacherj M. Clin. Exp. Immunol. 130:370—378 Detection and characterization of plasma cells in peripheral blood:correlation of IgE+ plasma cell frequency with IgE serum titre (2002)
非專利文獻I和2的全部記載均作為特別公開引用到本說明書中。
發明內容
如上所述，從末梢血或淋巴結中鑑定·分離漿細胞和漿母細胞時，必須進行多個階段的正向·反向篩選操作，因此，漿細胞和漿母細胞的鑑定·分離需要時間和繁雜的步驟。並且，使用細胞表面標記物抗體進行的漿細胞和漿母細胞的分離方法在目前階段僅在人和小鼠中建立(非專利文獻1、2)。因此，目前在採用基因克隆法製作單克隆抗體時，只使用來自人和小鼠的漿細胞和漿母細胞。但是，大部分作為抗體藥物靶標的人蛋白質的功能性抗原表位在人-小鼠間的同源性高，因此，即使用其對小鼠免疫，由於免疫耐受，大多也難以獲得特異性高的抗體。因此，為了避免免疫耐受的限制，作為新的抗體藥物開發的目標，由使用小鼠以外的動物種類進行的免疫得到的單克隆抗體正顯示其重要性。但是，由於尚未製作出兔、大鼠、綿羊、山羊、雞等動物的抗體生成細胞表面標記物抗體，從這些動物中鑑定·分離抗體生成細胞一·漿細胞和漿母細胞的方法尚未建立。因此本發明的目的在於提供無需利用細胞表面標記物，可高效率、高純度地從包括人和小鼠在內的哺乳類直至鳥類的各種動物中分離漿細胞和漿母細胞的方法。漿細胞和漿母細胞具有其它細胞中未見的以下的特徵形態。(I)與蛋白質的翻譯·摺疊·成熟有關的細胞器一內質網異常發達，佔有細胞質的大部分。(2)細胞核小型且偏於細胞的一側存在，核內有染色體聚集，可見車輪輻狀的異染色質的結構。本發明人認為，這些特徵是漿細胞和漿母細胞由於為大量的抗體生成而特化的原因出現的形態，因此利用該形態，不管動物種類如何，均具有可分離漿細胞和漿母細胞的可能性。基於上述考慮，本發明人對於很多的螢光探針、對於對漿細胞和漿母細胞的選擇性染色進行了篩選。結果發現，存在這樣的螢光探針(螢光探針I):其對於漿細胞和漿母細胞強烈染色，而對於可能與漿細胞和漿母細胞共存的其它細胞的染色程度低，兩者間所得的螢光強度比顯示可識別程度的差異。進一步發現，存在這樣的螢光探針(螢光探針2):其對於可能與漿細胞和漿母細胞共存的其它細胞的核強烈染色，但對於漿細胞和漿母細胞的核則親和性低。在此基礎上發現，通過使用這些螢光探針，無需使用細胞表面標記物抗體，即可高效率地從淋巴結組織或血細胞試樣中鑑定漿細胞和漿母細胞，並且可以將鑑定的漿細胞和漿母細胞分離，從而完成了本發明。本發明如下所述。[I]螢光探針，該螢光探針是對細胞的內質網的染色選擇性比對內質網以外的細胞器的染色選擇性高的螢光探針，通過用該螢光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用於漿細胞和/或漿母細胞的鑑定或分離。[2] [I]的螢光探針，該螢光探針選自(1)兩親性和陽離子性、並且具有中等程度的脂溶性的物質；以及(2)對於顯示內質網定位的蛋白質具有一定以上的親和性的物質。[3] [2]的螢光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數在O. ΙμΜ-O. InM的範圍。[4] [1]-[3]中任一項的螢光探針，其中，上述內質網以外的細胞器是質膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質基質、吞噬體、內體或聚集體。[5] [1]-[4]中任一項的螢光探針，其中，上述螢光探針選自螢光標記格列本脲、螢光標記布雷菲德菌素A、螢光探針和螢光蛋白。[6]螢光探針，該螢光探針是對細胞核的染色選擇性比對細胞核以外的細胞器的染色選擇性高的螢光探針，通過用該螢光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用於漿細胞和/或漿母細胞的鑑定或分離。[7] [6]的螢光探針，其中，螢光探針是對DNA具有結合性的物質。[8] [7]的螢光探針，其中，上述對DNA具有結合性的物質是如下的物質兩個氮通過聚亞甲基鏈連接，各個氮獨立形成芳環，至少一個氮具有正電荷作為季銨基。[9] [8]的螢光探針，其中，對於上述物質，兩親性指數(Al)〈8，疏水性指數(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。[10] [6]-[9]中任一項的螢光探針，其中，上述螢光探針為SYTO(註冊商標)59或SYTO (註冊商標)24。[11] [1]-[5]中任一項的螢光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞為選自紅細胞、血小板、單核細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。[12] [6]-[10]中任一項的螢光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞是選自單核細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。[13] [1]-[12]中任一項的螢光探針，該螢光探針用於來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的漿細胞和漿母細胞的分離。[14]鑑定淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用[1]_[5]中任一項的螢光探針或其組合對來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[15]漿細胞和漿母細胞的製備方法，該方法包括收集按照[14]所述方法鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[16] [15]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞的收集。[17]鑑定淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項的螢光探針或其組合對來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[18]漿細胞和/或漿母細胞的製備方法，該方法包括收集按照[17]所述方法鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[19] [17]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞的收集。
[20]漿細胞和/或漿母細胞的製備方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項的螢光探針或其組合對[15]或[16]中收集的細胞實施染色，接著，根據來自細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞，收集所鑑定的細胞，將剩餘的細胞作為漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞進行收集。[21] [20]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞的收集、以及剩餘細胞的收集。[22][13]-[21]中任一項的方法，其中，淋巴結組織、血細胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、犛牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負鼠、臭駒鼯(suncus)、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。 在本發明中，無需使用細胞表面標記物的抗體，而是關注於螢光探針對細胞器等的染色選擇性，即可鑑定漿細胞和漿母細胞。因此，不需要用於漿細胞和漿母細胞鑑定的細胞表面標記物的抗體本身，不限於特定的動物的種類，即可以鑑定且分離漿細胞和漿母細胞。因此，根據本發明，可製成不依賴特定的動物種類的單克隆抗體。目前，只有人和小鼠抗體應用於抗體藥物的開發，但採用本發明，則可以將由很多動物種類得到的單克隆抗體用於抗體藥物的開發。繼而，本發明對於佔新藥開發主流的抗體藥物開發提供了新的的有力的技術。附圖
簡述
圖I表示實施例I中使用選擇性染色內質網的螢光探針鑑定漿細胞和漿母細胞的試驗結果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細胞群用ER-Tracker (註冊商標)Blue-White DPX/lipid染色，通過螢光顯微鏡觀察的結果。圖2表示實施例2中使用選擇性染色內質網的螢光探針和常染色質親和性螢光探針鑑定漿細胞和漿母細胞的試驗結果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細胞群用SYTO (註冊商標)59以及ER-Tracker (註冊商標)Blue-White DPX/lipid染色，通過螢光顯微鏡觀察的結果。圖3表示實施例3中存在於通過細胞分選儀分選的Blue-White DPX/lipid強陽性且SYTO(註冊商標)59弱陽性細胞群中的免疫球蛋白的檢測結果。圖4表示實施例4中存在於通過細胞分選儀分選的ER-Tracker (註冊商標)Blue-White DPX/lipid強陽性大鼠細胞群中的免疫球蛋白的檢測結果。圖5表不實施例5中存在於通過細胞分選儀分選的ER-Tracker(註冊商標)Blue-White DPX/lipid強陽性豚鼠細胞群中的免疫球蛋白的檢測結果。實施發明的方案
本發明的方案I的螢光探針(螢光探針I)是用於漿細胞和漿母細胞的鑑定或分離的螢光探針，對細胞的內質網的親和性比對其它細胞器的親和性高，換言之，是選擇性染色細胞的內質網的螢光探針。漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞相比，內質網異常發達，結果，通過螢光探針I的染色所得到的螢光強度與漿細胞和漿母細胞以外的細胞用螢光探針I染色時的螢光強度相比，顯示出可以識別漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的程度的差異。螢光探針I所顯示的上述螢光強度比(漿細胞和漿母細胞的螢光強度/漿細胞和漿母細胞以外的細胞的螢光強度)例如為3倍以上。漿細胞和漿母細胞的內質網與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內質網對於螢光探針I的親和性沒有很大差異，但內質網的發達程度的不同產生了上述螢光強度的差異。因此，根據上述螢光強度比、通過用螢光探針I染色，可以識別漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞。用螢光探針I染色，則可以通過來自漿細胞和漿母細胞以外的細胞的螢光強度與來自漿細胞和漿母細胞的螢光強度的強弱差異，來將共存有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的漿細胞和漿母細胞兩者進行識別。因此，通過用螢光探針I染色，可以容易地從共存有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的細胞群中鑑定出漿細胞和漿母細胞，並且可以收集所鑑定的漿細胞和漿母細胞，由此可以獲得較多含有漿細胞和漿母細胞的細胞群。 如果來自染色的漿細胞和漿母細胞的螢光強度為來自染色的漿細胞和漿母細胞以外的細胞的螢光強度的3倍以上，則螢光探針I可以識別兩者，從容易識別的角度考慮，優選4倍以上，進一步優選5倍以上。不過，根據漿細胞和漿母細胞以外的細胞的種類不同，內質網的發達程度也不同，因此，該螢光強度比隨著漿細胞和漿母細胞以外的細胞的種類不同而變化。上述螢光強度比越高，則可以更高效率地從含有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的細胞群中鑑定漿細胞和漿母細胞。漿細胞和漿母細胞以外的細胞例如可舉出紅細胞、血小板、T淋巴細胞、B淋巴細胞、粒細胞、巨曬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等。本發明中，使用本發明的螢光探針I的漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別可如下進行。將螢光探針I加於細胞懸液中，在37 °C下進行30分鐘染色。適合染色的螢光探針I的濃度根據螢光探針I的種類而不同，例如IOOnM-I μ M0染色後，將細胞用PBS洗滌。洗滌後的細胞例如可以(I)使用螢光顯微鏡觀察細胞中螢光探針的定位，或者(2)根據細胞發出的螢光的強度來判別是漿細胞和漿母細胞，或者是漿細胞和漿母細胞以外的細胞。漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別方法在漿細胞和漿母細胞的鑑定·分離方法中詳述。可以進一步應用上述漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別方法，由對漿細胞和漿母細胞的內質網以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內質網的染色選擇性未知的物質篩選可用作螢光探針I的物質。對細胞的內質網的染色選擇性高、適合作為本發明的螢光探針I的螢光探針的篩選可利用以下方法進行通過後述的定位於內質網中的蛋白質的免疫染色(在漿細胞和漿母細胞中為免疫球蛋白)，或者使內質網轉移性的重組螢光蛋白在培養細胞中表達，由此鑑定細胞的內質網，利用該方法求出細胞全體的螢光強度A與來自內質網的螢光強度B的比例(Β/Α)。篩選可用作螢光探針I的物質的方法中，既可以只使用漿細胞和漿母細胞，也可只使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞實施。不過，漿細胞和漿母細胞的內質網發達，可通過染色獲得高螢光強度，因此，使用漿細胞和漿母細胞更容易進行物質對細胞的內質網的染色選擇性的評價。但是，漿細胞和漿母細胞的獲得並不容易，因此也可以使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞，評價對內質網的染色性(染色力)，篩選可用作螢光探針I的物質。例如，在使用常規的培養細胞(例如Hela細胞)的染色試驗中，通過求出上述細胞全體的螢光強度A和來自內質網的螢光強度B的比例(B/A)，可以篩選可用作螢光探針I的物質。不過，在使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞作為細胞時，根據細胞中內質網的發達程度，將作為閥值的B/A的值適當設定為比在使用漿細胞和漿母細胞的篩選方法中所採用的閥值B/A的值低的值(例如為50%左右)是適當的。漿細胞和漿母細胞以外的細胞的例子可舉出紅細胞、血小板、T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞等作為其它的細胞。並且，上述方法中的篩選也可以使用雜交瘤細胞、漿細胞瘤或多發性骨髓瘤細胞代替漿細胞和漿母細胞。這是由於，雜交瘤細胞、漿細胞瘤和多發性骨髓瘤細胞也生成免疫球蛋白，因此內質網發達，因此可通過染色獲得高螢光強度，更容易進行物質對細胞內質網的染色選擇性的評價。作為對漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內質網的染色選擇性高的螢光探針I的物質的例子，可舉出(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性 的物質，以及(2)對顯示內質網定位的蛋白質具有一定以上的親和性的物質。具有上述(I)或(2)的性質的物質對於漿細胞和漿母細胞的內質網的染色性、以及對於漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內質網的染色性兩者均比對於細胞的其它細胞器的染色性高。上述(I)中的「兩親性和陽離子性」具體來說是指兩親性指數(Al)例如為+6>AI>0。其中，兩親性指數是通過計算分子的脂溶性結構域表觀上的IogP值所得到的值。具體來說，是根據Hansch等人提出的碎片值，考慮碳鏈的長度及其位置關係與陽離子性季銨基的極性效果，根據Morrall等人的模型計算的值。[Hansch C，Leo AJ. ExploringQSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, p.160， AmericanChemical Society: Washington, DC, 1995. ， Morrall SWj Herzog RRj Kloepper-SamsPj Rosen MJ. Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance totoxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress, vol.3. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227。上述⑴中的「中等程度的脂溶性」是指疏水性指數(IogP)例如為+6>logP>0。疏水性指數是根據Hansch等人的碎片推算法計算的分子全體的疏水性值。具體來說，是在以Al所示的疏水基團上加上其附帶的結構的影響而得出的。上述(2)中的「對顯示內質網定位的蛋白質具有一定以上的親和性」具體來說是指具有解尚常數為O. I μ Μ-0. InM的未和性。對顯不內質網定位的蛋白質具有一定以上的親和性的物質也是選擇性染色細胞內質網的螢光探針。(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性的物質的例子可舉出下述Α、Β或C所示的化合物。式A所示的化合物是Di0C6 (3) ( 3，3』 - 二己基氧雜碳菁碘化物)，在低濃度下聚集於線粒體，但在高濃度聚集於內質網。式B所示的化合物是羅丹明B己酯，在低濃度下聚集於線粒體，在高濃度下聚集於內質網中。式C所示的化合物是ER-Tracker Blue whiteDPX，主要聚集於內質網，在高濃度也對高爾基體染色。是實施例中使用的螢光探針。這些A、B或C所示的化合物均為兩親性和陽離子性，具有中等程度的脂溶性(參考文獻，參照Whyfluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental andQSAR-modeling study)。A所示的化合物的兩親性指數(Al)和疏水性指數分別為4. 5和4. 4，具有I價陽離子。B所示的化合物的兩親性指數(Al)和疏水性指數分別為4. 8和5. 9，具有I價陽離子。C所示的化合物的兩親性指數(Al)和疏水性指數分別為5. I和O. 7，具有I價陽離子。C所示的化合物如實施例所示，對漿細胞和漿母細胞染色時的螢光強度為對漿細胞和漿母細胞以外的細胞染色時的螢光強度的4倍以上。[化I]
權利要求
1.螢光探針，所述螢光探針是對細胞的內質網的染色選擇性比對內質網以外的細胞器的染色選擇性高的螢光探針，通過用該螢光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用於漿細胞和/或漿母細胞的鑑定或分離。
2.權利要求I的螢光探針，其中，所述螢光探針選自(1)兩親性和陽離子性、並且具有中等程度的脂溶性的物質；以及(2)對於顯示內質網定位的蛋白質具有一定以上的親和性的物質。
3.權利要求2的螢光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數在O. I μ M-ο. InM 的範圍。
4.權利要求1-3中任一項的螢光探針，其中，上述內質網以外的細胞器是質膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質基質、吞噬體、內體或聚集體。
5.權利要求1-4中任一項的突光探針,其中，上述突光探針選自突光標記格列本脲、螢光標記布雷菲德菌素Α、螢光探針和螢光蛋白。
6.螢光探針，所述螢光探針是對細胞核的染色選擇性比對細胞核以外的細胞器的染色選擇性高的螢光探針，通過用該螢光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用於漿細胞和/或漿母細胞的鑑定或分離。
7.權利要求6的螢光探針，其中，螢光探針是對DNA具有結合性的物質。
8.權利要求7的螢光探針，其中，上述對DNA具有結合性的物質是如下的物質兩個氮通過聚亞甲基鏈連接，各個氮獨立形成芳環，至少一個氮具有正電荷作為季銨基。
9.權利要求8的螢光探針，其中，對於上述物質，兩親性指數(Al)〈8，疏水性指數(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。
10.權利要求6-9中任一項的螢光探針，其中，上述螢光探針為SYTO(註冊商標)59或SYTO (註冊商標)24。
11.權利要求1-5中任一項的螢光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞為選自紅細胞、血小板、單核細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。
12.權利要求6-10中任一項的螢光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞是選自單核細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。
13.權利要求1-12中任一項的螢光探針，其中，所述螢光探針用於來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的漿細胞和漿母細胞的分離。
14.鑑定淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，所述方法包括使用權利要求1-5中任一項的螢光探針或其組合對來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和/或漿母細胞或者眾細胞和/或眾母細胞的候選細胞。
15.漿細胞和漿母細胞的製備方法，所述方法包括收集按照權利要求14所述方法鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。
16.權利要求15的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和/或眾母細胞或者眾細胞和/或眾母細胞的候選細胞的收集。
17.鑑定淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，所述方法包括使用權利要求6-10中任一項的螢光探針或其組合對來自淋巴結組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和/或漿母細胞或者眾細胞和/或眾母細胞的候選細胞。
18.漿細胞和漿母細胞的製備方法，所述方法包括收集按照權利要求17所述方法鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。
19.權利要求17的方法，所述方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母 細胞的候選細胞的收集。
20.漿細胞和漿母細胞的製備方法，所述方法包括使用權利要求6-10中任一項的螢光探針或其組合對權利要求15或16中收集的細胞實施染色，接著，根據來自細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞，收集所鑑定的細胞，將剩餘的細胞作為漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或者漿母細胞的候選細胞進行收集。
21.權利要求20的方法，其中，所述方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑑定的漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞的收集、以及剩餘細胞的收集。
22.權利要求13-21中任一項的方法，其中，淋巴結組織、血細胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、犛牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負鼠、臭駒鼯、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。
全文摘要
本發明提供無需利用細胞表面標記物，可以高效率、高純度地由哺乳類或鳥類分離漿細胞和漿母細胞的方法。螢光探針，與對內質網以外的細胞器的染色選擇性相比，其對細胞的內質網的染色選擇性高。涉及鑑定漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用該螢光探針，對來自淋巴結組織等的細胞進行染色，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和漿母細胞。螢光探針，與對細胞核以外的細胞器的染色選擇性相比，其對細胞核的染色選擇性高。鑑定淋巴結組織等中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用該螢光探針，對來自淋巴結組織等的細胞染色，根據來自染色的細胞的螢光強度來鑑定漿細胞和漿母細胞。
文檔編號C12N5/078GK102947463SQ20118001581
公開日2013年2月27日 申請日期2011年3月22日 優先權日2010年3月25日
發明者黑澤信幸, 磯部正治 申請人:國立大學法人富山大學