老芒麥種質的快速鑑定方法及其est-ssr分子標記特異引物組和專用試劑盒的製作方法
2023-05-16 06:09:21 2
老芒麥種質的快速鑑定方法及其est-ssr分子標記特異引物組和專用試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組，包括3對EST-SSR分子標記特異引物，還提供了老芒麥種質的快速鑑定方法及專用試劑盒。本發明的有益效果為：本發明提供了用於鑑定老芒麥種質的特異EST-SSR分子標記引物組、快速檢測試劑盒及檢測方法，採用本發明提供的引物及相應的PCR擴增程序和電泳產物檢測方法，可以利用植物組織準確的對不同來源的老芒麥進行快速、準確鑑定，和現有的形態鑑定相比，該方法操作簡單、周期短，鑑定準確率高，同時通用型PCR擴增程序大大避免了傳統SSR引物擴增需要設定不同退火溫度的麻煩，且擴增效率大大提高，電泳產物快速檢測方法，在30分鐘內即可獲得清晰可辨的電泳條帶。
【專利說明】老芒麥種質的快速鑑定方法及其EST-SSR分子標記特異引物組和專用試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物種質鑑定領域，具體涉及老芒麥種質的快速鑑定方法及其EST-SSR分子標記特異引物組和專用試劑盒。
【背景技術】
[0002]老芒麥sibiricusL.)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)披鹼草屬的多年生疏叢型中旱生植物，為披鹼草屬的模式種。老芒麥在北半球溫帶地區分布較廣，是歐亞大陸的廣布種，尤其是我國草甸草原和高寒草甸群落的重要組成部分，能形成優勢種和建群種。由於其具有抗寒性強、粗蛋白含量高、適口性好、易栽培等優點，老芒麥已成為國家「天保工程」和「退牧還草工程」中廣泛使用的優良牧草之一。
[0003]我國野生老芒麥資源非常豐富，現已廣泛分布於我國的西北、華北、東北和青藏高原等地區，這為我國老芒麥資源的收集、評價和育種提供了極為重要的前提和基礎。但自然界野生老芒麥由於形態多樣、生態類型豐富往往很難快速鑑定，這給資源的收集、鑑定、保存和利用帶來諸多困難。傳統上對於老芒麥種質的分類和鑑定常依耐株高、穗長、分櫱數等形態學指標，其種植成本高、鑑定周期長；另外形態指標受環境因素影響大，具有不穩定性，在測定過程中也存在較大的人為誤差，從而影響鑑定結果的可靠性。
[0004]隨著分子生物學技術的快速發 展，特別是分子標記和基因標記技術的建立和成熟，為發展簡便、快速、準確的種質鑑定技術提供了有效手段。SSR (Simple sequencerepeat，簡單重複序列)標記因具有數量豐富、多態性高、共顯性、擴增穩定、引物序列易於交流等優點，已在水稻iOryza satira )、玉米iZea mays L.)、棉花SGossypiumherbaceum L)、甜瓜(Ci/cawis melo L)、西瓜lanatus.)等作物的種質鑑定中應用。而在草業上SSR分子標記應用不多,僅見於披鹼草JaAtfricw1S)、柱花草(Stylosanthess^.)、紫花苜猜(ifet/icago 55/<3 japoniCa、等少數阜種。而有關不同來源老芒麥種質的SSR分子標記鑑定未見報導。
【發明內容】
[0005]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種老芒麥種質的快速鑑定方法及其EST-SSR分子標記特異引物組和專用試劑盒。
[0006]本發明是利用5份來至於甘肅南部不同地域的老芒麥種質對前期開發的披鹼草屬、鵝觀草屬EST-SSR引物進行擴增，獲得一批多態性引物，如圖1所示。再通過對鑑定材料的進一步擴增，篩選出3對EST-SSR引物，能通過擴增的特異性條帶將來自於不同生境和地域的老芒麥種質快速鑑定，並由此提供了老芒麥種質快速檢測試劑盒及鑑定方法。
[0007]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組，包括3組核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標記特異引物:
第一組引物對，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二組引物對，其序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示；
第三組引物對，其序列如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；
第四組引物對，其序列如SEQ ID NO:7和SEQID NO:7所示。
[0008]老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組具體如表1所示:
表1
【權利要求】
1.一種老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組，其特徵在於，包括3組核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標記特異引物: 第一組引物對，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 第二組引物對，其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示； 第三組引物對，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示； 第四組引物對，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:7所示。
2.權利要求1所述的引物組在老芒麥種質快速鑑定中的應用。
3.—種老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)提取老芒麥種質DNA； 2)以步驟I)得到的DNA為模板，利用如權利要求1所述的老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組中的成對 引物分別PCR擴增EST-SSR分子標記，得到PCR產物； 3)將步驟2)得到的PCR產物進行檢測。
4.根據權利要求3所述的老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，所述步驟I)中，是取生長良好的老芒麥幼嫩葉片採用CTAB方法提取DNA，用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA濃度和純度，OD26(i/OD28(i在1.7-1.9之間的DNA樣品為合格樣品，每份樣品稀釋成25 ng/μ I置於4 °C冰箱中保存備用。
5.根據權利要求4所述的老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，所述步驟2)中， PCR擴增的反應體系為:25ng/y I的模板DNA 2μ 1，PCR預混液2XReaction Mix7.5 μ 1,10 μ M/μ I 的 PF 上遊引物 0.5 μ I，10 μ M/μ I 的 PR 下遊引物 0.5 μ I，2.5 υ/μ I 的Taq 酶 0.2 μ I,滅菌水 4.3 μ I ； SSR-PCR擴增的反應程序為:94°C變性30 sec, 65 - 60 °C退火30 sec，72°C延伸Imin，共5個循環，每個循環退火溫度降低1°C;94 V變性30 sec, 60 °C退火30 sec, 72 V延伸I min,共30個循環；72 °C延伸IOmin,4°C保持。
6.根據權利要求5所述的老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，所述步驟3)中，PCR擴增產物的檢測方法採用聚丙烯醯胺凝膠電泳結合銀染色的方法，具體過程為:採用6%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳，膠版採用質量百分濃度為0.08 %-0.1 %的銀染液進行染色10-15分鐘，以蒸餾水水洗1-2次後加入至顯影液中顯影至條帶清晰即可。
7.根據權利要求6所述的老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，所述顯影后的膠版置於質量百分濃度為7 %的冰醋酸溶液中進行停顯。
8.根據權利要求6或7所述的老芒麥種質的快速鑑定方法，其特徵在於，所述銀染液為硝酸銀染色液；所述銀染液的質量百分濃度為0.09% ;所述染色時間為10分鐘；所述顯影液的配方比例為每升顯影液含有氫氧化鈉15g、甲醛4ml、四硼酸鈉0.19g ;所述顯影時間為5分鐘。
9.一種老芒麥種質EST-SSR特異性分子標記鑑定方法及快速檢測的專用試劑盒，其特徵在於，所述專用試劑盒中包含有PCR預混液2 X Reaction Mix、Taq酶、如權利要求1所述的老芒麥種質EST-SSR分子標記特異引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK103923910SQ201410142555
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】謝文剛, 劉勇, 王彥榮, 劉文獻, 張建全 申請人:蘭州大學