防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法
2023-05-16 05:51:46 1
專利名稱：防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法
技術領域：
本發明屬於生化工程技術中植物培養的方法，特別涉及一種防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法。
在植物組織培養中，比如，在香石竹、花椰菜及矮牽牛等幾十種植物培養中都發現了玻璃化現象。玻璃化現象特徵是培養物矮小腫脹、呈半透明玻璃狀；葉片為淺綠色或黃綠色，葉片厚而狹長，有時基部較寬，脆弱易碎，葉表面缺少角質層和蠟質或蠟質發育不完全；莖短粗扁平，節間很短；通過解剖進一步發現發生玻璃化的培養物，由於其葉片無功能性氣孔，從而導致保衛細胞的功能失調不能關閉氣孔，同時其葉片中僅有海綿組織，無柵欄組織；在莖內雖可見疏導組織，但其導管和管胞木質化不完全(王關林、方宏筠主編，植物基因工程原理與技術，科學出版社，1998)。所以玻璃化發生會造成植物組織畸形和變異，進而影響到植物在培養過程對營養物地吸收和光合作用的效率。
玻璃化現象的產生與很多因素有關，如植物組織畸形且木質素含量過低，植物體內會發生乙烯過飽和、細胞通透性降低或關閉氣孔等，從而導致細胞內多餘水份不能及時排出，發生玻璃化現象；
已有研究證明發生玻璃化的植物苗體內水份含量高，乾物質、葉綠素、木質素含量低，角質層、柵欄組織發育不全，吸收與光合功能不全。採用增加光強、提高培養基中瓊脂濃度，降低細胞分裂素的用量，對減輕植物培養過程發生玻璃化有明顯效果(肖玉蘭等。克服香石竹試管苗玻璃化現象的研究。雲南農業大學學報。1997，12(3)188-193)。比如，在香石竹組織培養中，隨培養基中6-BA激素濃度的增加、培養基含水量的增加，植物玻璃苗含水量高於正常苗，因此玻璃化發生與植物體內含水量過高有關。植物排除體內多餘水份方式之一就是靠蒸騰作用。在玻璃化的植物苗中只有一個保衛細胞，而且呈畸形，形狀狹窄，氣孔關閉，所以蒸騰作用減少，引起體內水份積累，細胞體積膨脹，液泡程度加劇，細胞質變薄，這一系列變化造成對細胞的擠壓，促使氣孔進一步關閉(李瑤等。影響香石竹試管苗玻璃化的因素。植物生理學通訊。1997，33(4)256-258)。
蘋果組織培養時出現玻璃化現象是由於過氧化物酶-吲哚乙酸氧化酶系統控制的乙烯過飽和的影響，細胞激動素或NH3+離子過剩是一種最初的脅迫，由於在乙烯過剩的空氣中生長抑制了體內乙烯的生物合成，降低了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酸性過氧化物酶的活性，從而阻礙組織的木質化，發生玻璃化現象(程家勝等。蘋果組織培養中的玻璃苗問題。植物生理學通訊。1990，26(1)33-35)。
利用中子活化分析研究珠美海棠(Malus zumi)的玻璃化發生過程發現在玻璃化發生過程中，玻璃苗每個部位纖維素及木質素含量均低於正常苗，其中葉片減少最突出，其次是莖尖段，同時在整株中不同部位纖維素、木質素含量分布亦發生了改變，造成生長旺盛部位纖維素、木質素含量太低，滿足不了正常代謝的需要，玻璃化現象並首先表現在莖尖段(李雲等。玻璃苗中纖維素、木質素及元素含量的研究。核農學報。1997，11(1)103-111)；
玻璃化現象發生後，培養物在結構、形態及生化特性上都發生了很多變化，如葉肉中的葉綠素含量、蛋白質含量、一些酶的活性及乙烯合成能力均相繼發生變化。對玻璃化組織與其培養環境的關係研究表明低溫處理及Cl-、NO3-、Ca2+等離子對洋薊玻璃化無影響，玻璃化的形成與植物組織生長環境中的水分、營養條件、激素水平等有關；一旦形成玻璃化有時改善某一條件可能對玻璃化程度有所緩解，但難以徹底解決。
目前預防玻璃化發生一般採用降低培養基激素水平，防止不正常的脫分化；減少培養基中水份含量；避免高溫和純化培養物等方法，但這些方法在不定芽培養及種苗繁殖中往往不適用於減輕和防止玻璃化現象的發生，例如在青蒿叢生芽的液體懸浮培養中，發生培養物玻璃化現象是普遍存在的問題，青蒿芽生長的適宜溫度在25-28℃，青蒿素合成的適宜溫度在30℃左右，而且激素NAA和6-BA是分化所需要的，無法採用降低培養溫度、取消或減少激素用量等傳統辦法來減少或防止玻璃化現象的發生，因而需要探索新的防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法。
在植物芽苗的培養中，以青蒿叢生芽的培養為例青蒿叢生芽的培養在1-20天均呈現快速生長，並且沒有明顯的延遲期。細胞膜滲透性在0-10天呈快速下降趨勢，在隨後的11-25天逐漸上升，在26-30天又逐漸下降，30天以後又快速上升。在芽生長和青蒿素合成的1-35天內細胞膜滲透性始終低於初始(0天)細胞膜滲透性，這可能是造成青蒿芽產生玻璃化的重要原因之一。因此可知，通過調節植物芽苗生長過程中細胞膜滲透性，使細胞內外水份及時達到平衡，可減輕或消除玻璃化現象發生。
玻璃化產生的一個重要因素是培養基中存在植物激素，如NAA和6-BA等，特別是6-BA，但是這些激素對植物芽的分化、生長均具有至關重要的作用，如果能降低或取消培養基中的植物激素，勢必會影響芽苗的生長，若能尋找到有機植物激素的替代物，而減少激素用量，將是解決植物芽玻璃化問題的有效途徑之一。
本發明的目的在於提供一種簡單、易行，而且可減少甚至完全替代培養基中植物激素的一種防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法
技術領域：
本發明的技術方案如下
本發明提供的防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，步驟如下
1.配製培養基
A.配製液體培養基
在MS液體培養基中添加20-30g/L的蔗糖，0-2.0mg/L 6-BA，0-0.2mg/L NAA，再加入含單一或混合稀土元素化合物溶液或海帶硫酸酯多糖溶液，並進行高壓滅菌處理，或者採用除菌過濾器將含單一或混合稀土元素化合物溶液或海帶硫酸酯多糖溶液直接加入滅菌後的培養液中；所加入的單一或混合稀土元素在培養基中的濃度0.0001-0.5mmol/L；所述海帶硫酸酯多糖在培養基中濃度為0-1％；
B.配製固體培養基在上述液體培養基中加入6-10g/L瓊酯，並進行高壓滅菌處理；
2.將植物器官種苗接入上述液體或固體培養基中，在溫度為25-30℃，光照為2000-5000lux的條件下，培養20-30天。
所述的單一或混合稀土元素的化合物包括鑭、鈰、鐠、釹或釤的硝酸鹽、氯化物、氧化物；所述海帶硫酸酯多糖為海帶多糖、巖藻糖；所述植物器官為植物芽或植物毛狀根。
用本發明提供的含稀土元素的培養基對植物芽苗進行培養的實驗證明，培養基所含適宜的濃度的稀土元素可促進植物芽苗生長，以青蒿芽苗的培養為例，還可促進青蒿素的合成，這是由於稀土元素不但可以改變培養物細胞膜滲透性，而且具有激素樣作用，可以部份取代NAA或完全取代6-BA，從而防止青蒿芽苗培養過程中發生玻璃化現象。
青蒿芽生長過程中含水量的變化在細胞膜滲透性快速增長的0-5天芽的含水量增加很少，在第5天以後含水量就快速上升，實驗中亦同時觀察到芽的玻璃化程度在第5天以後變得越來越嚴重。因而芽的含水量可以作為玻璃化程度的一個重要的度量指標。
通過研究發現植物激素在植物芽、苗生長過程中具有重要的作用，但同時它們其中的某些成分是玻璃化產生的重要因素，本發明用稀土元素部份或完全取代培養基中的植物激素，可大大減輕甚至有效防止玻璃化。如在青蒿叢生芽和苗的培養中，用含鑭、鈰、釹及混合稀土元素Re同時取代培養基中的植物激素NAA和6-BA時，對芽的含水量影響較小；僅取代NAA時，對芽的含水量幾乎無影響；僅取代6-BA時，對芽含水量的影響很明顯。青蒿芽培養基中6-BA是造成芽含水量過高，產生玻璃化的重要因素。稀土元素可以取代6-BA，降低青蒿芽的含水量，從而大幅度減輕芽的玻璃化程度。
海帶多糖是從海帶中分離提取出來的一種混合多糖，它含SO42-約30％，巖藻糖約30％，半乳糖10-15％，總糖含量大於50％，平均分子量約2萬，含水量小於10％。不同濃度海帶多糖對芽的含水量有所影響，在較低濃度下，芽的含水量有所降低，經過25天培養後，懸浮培養的芽其形態基本能恢復到固體培養的水平。研究芽含水量動力學結果表明加入海帶多糖在培養20天以後，含水量急劇下降，而對照樣品卻是急劇上升。這說明海帶多糖對青蒿芽培養過程中玻璃化現象具有良好的抑制作用，為解決植物芽玻璃化問題提供了一條嶄新的方法。
下面結合附圖及實施例進一步描述本發明
實施例1
配製培養基1、2、3及對照，培養基1、2、3及對照中蔗糖含量均為2％，加入6-BA，NAA及再加入三氧化二鑭的硝酸溶液後鑭在培養基中的濃度如表1所示，將培養基經高壓蒸汽滅菌處理後，接入青蒿芽進行培養，其培養條件為溫度28℃，光照3000lux，懸浮培養25天，懸浮培養後青蒿芽含水量結果見表1。
表1
實施例2
配製培養基1、2、3及對照，培養基1、2、3及對照中蔗糖含量均為2％，加入的6-BA，NAA及再加入鈰氧化物的硝酸溶液後，鈰在培養基中的濃度見表2，將培養基經高壓蒸汽滅菌處理後，接入青蒿芽進行培養，培養條件同實施例1，其懸浮培養後的青蒿芽含水量結果見表2。
表2
實施例3
配製培養基1、2、3及對照，培養基1、2、3及對照中蔗糖含量均為2％，加入6-BA，NAA及再加入混合稀土Re的硝酸溶液後，混合稀土Re在培養基中的濃度見表3，將培養基經高壓蒸汽滅菌處理後，接入青蒿芽進行培養，培養後青蒿芽含水量結果見表3，其培養條件同實施例1，經過25天培養發現顯著減輕青蒿芽的玻璃化程度，青蒿芽含水量結果見表3。
表3
注混合稀土Re(71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.44％Pr6O11+0.3％Sm2O3，w/w)。
實施例4在加入了2％蔗糖，0.8％瓊脂，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA的MS固體培養基中分別加入含鑭、鈰、釹或混合稀土Re的化合物溶液，配製四種培養基，培養基1中鑭的含量為0.2mmol/L；培養基2中鈰的含量為0.05mmol/L；培養基3中釹(加入的是三氯化二釹水溶液)的含量為0.1mmol/L；培養基4中混合稀土Re(71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.44％Pr6O11+0.3％Sm2O3，w/w)的含量為0.5mmol/L；將青蒿芽分別接入上述四種培養基中進行培養，其培養溫度為28℃，光照為3000lux，培養25天，發現顯著減輕青蒿芽的玻璃化程度，青蒿芽培養物的含水量分別降低了2.8％、2.3％、2.6％和2.7％。
實施例5培養條件同實施例1，在培養基中加入不同濃度的海藻硫酸酯多糖後減輕了青蒿芽的玻璃化程度，結果如
圖1所示。
圖1中橫坐標為培養基中多糖的百分含量，縱坐標為青蒿芽含水量
為青蒿芽含水量隨培養基中多糖含量而變化的變化曲線。由
圖1可以看出經過25天培養後，懸浮培養的青蒿芽培養物的形態基本恢復到固體培養的水平。
實施例6培養條件同實施例1，在加了2％蔗糖、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA的MS培養基中再通過除菌過濾器加入0.2％海帶多糖後；將青蒿芽接入培養基進行培養，結果如圖2所示。圖2中橫坐標為培養時間(天數)，縱坐標為青蒿芽含水量
為青蒿芽含水量隨培養時間而變化的變化曲線
為對照組含水量隨培養時間而變化的變化曲線。從圖2可知在0-10天沒有降低青蒿芽的含水量，在10-20天青蒿芽的含水量開始略低於對照組(對照組是指在MS培養基中培養的結果)，在20天以後加入海帶多糖的青蒿芽培養物含水量快速下降，而對照組青蒿芽培養物的含水量卻快速上升，即加入海帶多糖後青蒿芽培養物的玻璃化程度受到有效抑制，芽生長良好，形態正常，而對照組樣品的玻璃化程度越來越嚴重，表現出莖葉水腫，呈半透明狀。
實施例7培養條件同實施例1，在加了2％蔗糖、1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS培養基中再通過除菌過濾器加入0.1％海帶多糖後，再分別加入0.1mmol/L鑭(培養基1)、0.02mmol/L鈰(培養基2)、0.06mmol/L釹(培養基3)、0.1mmol/L混合稀土(培養基4)，將青蒿芽分別接入培養基中進行培養，經過25天培養，發現顯著減輕青蒿芽的玻璃化程度，芽的含水量分別降低了3.3％、2.8％、2.9％和3.1％。
權利要求
1.一種防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，步驟如下
(1)配製培養基
A.配製液體培養基
在MS液體培養基中添加20-30g/L的蔗糖，0-2.0mg/L 6-BA，0-0.2mg/L NAA，再加入含單一或混合稀土元素化合物溶液或海帶硫酸酯多糖溶液，並進行高壓滅菌處理，或者採用除菌過濾器將含單一或混合稀土元素化合物溶液或海帶硫酸酯多糖溶液直接加入滅菌後的培養液中；所加入的單一或混合稀土元素在培養基中的濃度0.0001-0.5mmol/L；所述海帶硫酸酯多糖在培養基中濃度為0-1％；
B.配製固體培養基在上述液體培養基中加入6-10g/L瓊酯，並進行高壓滅菌處理；
(2)將植物器官種苗接入上述液體或固體培養基中，在溫度為25-30℃，光照為2000-5000lux的條件下，培養20-30天。
2.按權利要求1所述的防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，其特徵在於所述的單一或混合稀土元素的化合物包括鑭、鈰、鐠、釹或釤的硝酸鹽、氯化物、氧化物；
3.按權利要求1所述的防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，其特徵在於所述植物器官種苗為植物芽或植物毛狀根。
4.按權利要求1防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，其特徵在於，所述海帶硫酸酯多糖為海帶多糖、巖藻糖。
全文摘要
本發明涉及的防止植物不定芽及種苗培養玻璃化的方法，在對傳統的MS培養基進行改進後，再加入單一/混合稀土元素化合物或和海帶硫酸酯多糖，所述單一或混合稀土元素的化合物包括鑭、鈰、鐠、釹或釤的硝酸鹽、氯化物、氧化物，減少或替代培養基中NAA、6－BA激素，在這種培養基對植物器官進行培養，可有效地減輕和防止植物不定芽和種苗玻璃化現象的發生。
文檔編號A01H4/00GK1391796SQ0111597
公開日2003年1月22日 申請日期2001年6月15日 優先權日2001年6月15日
發明者趙兵, 王玉春, 歐陽藩, 王曉東 申請人:中國科學院化工冶金研究所