生物型骨修復材料的製作方法

2023-05-16 02:25:16 2

專利名稱：生物型骨修復材料的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種骨修復材料，用於對骨缺損的修復，屬於植入類醫療 器械，具體為生物型骨修復材料。
背景技術：
外科手術或病變所引起的骨缺損是外科常見病之一，骨缺損的治療需用到 大量骨修復材料，即通常所說的人工骨材料。目前被研究及應用的骨修復材料 主要有兩大類 一類是由合成材料製成的骨修復材料，主要有羥基磷灰石、磷
酸三鈣、聚乳酸(PLA)、聚羥乙酸(PGA)、聚己內酯(PCL)、聚己內醯胺(PA6) 等。以上所述的人工骨材料除羥基磷灰石、磷酸三鈣與骨組織中的無機骨架組 成相似外，其餘高聚物與骨的組成毫無共同點，只是作為一種形狀支架應用。 羥基磷灰石及磷酸三鈣，無論燒結成型或以上所述高聚物作粘結劑粘接成型， 其力學強度均不理想。燒成陶瓷不但性脆，且過于堅硬，宿主骨組織難於長入， 因此難與骨組織融為一體。所以，H能的羥基磷灰石及磷酸三鈣，多以粉狀、 顆粒或膏體用作骨填料，應用受到限制；第二類是以天然骨為原料的骨修復材 料。最早被應用的是動物骨，經600 80(TC焙燒去有機質後應用。焙燒的作用 是除去有強免疫排異原性的有機質，同時殺滅病菌病毒。但焙燒的骨質很脆， 力學強度變差，且燒去骨基質後，誘導骨組織生長的能力差，只能作為填充料 在小範圍內應用。目前被用得最多的是屍體骨， 一般只作低溫冷凍及簡單的酒 精、射線滅菌或戊二醛浸泡滅菌處理後應用，常發生免疫排異反應而影響治療 效果。更主要的是屍體骨的來源大多不是自願捐贈的，即使有少量是自願捐贈， 按各國有關法律，捐贈的器官是不能用於以盈利為目的的交易的，目前市場上， 作為商品的屍體骨存在一個倫理、人權、法律的問題。隨著法律法制的健全， 屍體骨的來源將十分有限。近年來有不少試圖用動物骨代替屍體骨的研究，有 些只是照屍體骨的簡單深冷及酒精浸泡處理就應用；有些進行稍微複雜的處理
如脫脂、氫氟酸處理、戊二醛浸泡等，均未能針對骨基質較強的免疫排異原性 而設計相應的去抗原措施。因此，目前以動物骨為原料的人工骨修復材料，大 多存在著不可忽略的免疫排異原性而難以誘導宿主的骨組織生長癒合，修復效 果欠佳的問題，因而未被用戶接受。儘管許多研究者都聲稱自己處理過的動物 骨是去抗原異種骨或無抗原異種骨，但是由於對免疫原性的本質認識不夠，未 能有針對性地去封閉或破壞抗原表位(又稱抗原決定簇)，誤以為簡單的深冷或 戊二醛浸泡就可有效去除抗原。其實不然，根據對免疫反應的分子生物學研究 及免疫化學的研究結果認為，異種骨組織的免疫原性是由骨基質中某些處於特 異敏感位置的活性基團或特異構象引起的，這些特異活性基團或特異構象被稱 為抗原表位或抗原決定簇。要有效去除其抗原性必須有針對性地設法封閉或破 壞抗原表位的結構，而不能靠簡單的冷凍、脫脂、戊二醛處理，也不能只靠脫 細胞，因為無細胞的結締組織，甚至提純的膠原都有一定的抗原性。
實用新型內容
本實用新型的目的是針對以上所述人工骨材料存在的不足，提供一種以動 物骨為原料，組成(含有機和無機組成)及結構(包括微孔貫穿結構的多維結 構)與天然骨相似，無抗原、無病毒、組織相容性好，可誘導受體骨組織生長 癒合的生物型骨修復材料。
本實用新型的技術方案是這樣的生物型骨修復材料由動物骨經脫脂、脫 細胞、固定處理、多方位除抗原、朊病毒殺滅等步驟處理後形成生物型骨修復 材料基體，以及偶聯在基體表面的誘導活性修飾層組成。
所述的誘導活性修飾層是在基體上偶聯的可非特異性粘附生長因子的多肽 活性表面層。
所述的誘導活性修飾層是在基體上偶聯的糖胺聚糖複合物活性表面層。 本實用新型的生物型骨修復材料是以動物骨為原料，經如下製作步驟製作而成-
A、 選取適用的動物骨包括密質骨和松質骨等；
B、 預處理進行消毒、除雜質、機械切割成型等；
C、 脫脂用有機溶劑抽提動物骨內部的脂肪雜質；
D、 脫細胞用表面活性劑或者蛋白酶脫除其中的細胞；
E、 固定處理:用環氧化物作為交聯固定劑將材料中的骨膠原進行交聯固定;
F、 多方位除抗原多種試劑破壞或封閉抗原表位；
G、 朊病毒殺滅殺滅可能存在的朊病毒；
H、 誘導活性修飾將可粘附生長因子及細胞的活性組分，引入生物骨表面;
I、 包裝；
J、 射線輻射滅菌； K、經檢驗後即得成品。
以上B步驟中，所述的消毒所用的消毒劑主要是通用的廣譜消毒劑，如苯 扎溴銨、洗必泰、疊氮化鈉等；
以上C步驟中，抽提動物骨內部的脂肪雜質的有機溶劑可以是乙酸酯類、 氯仿、四氯化碳、乙醚、丙酮、無水乙醇等；
以上D步驟中，脫細胞是用表面活性劑洗脫法和在膠原保護劑的存在下酶 解法，兩者單獨應用或兩者同時應用來實現；表面活性劑可以是乙二胺四乙酸、 苯甲基氟磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonxlOO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 酶解法所用的酶可以是胰蛋白酶和胃蛋白酶。
以上E步驟中，所述的環氧固定是指用環氧化物作為交聯固定劑將材料中
的骨膠原進行交聯固定。這裡環氧化物可以是碳鏈環氧化物 2 ，式中CH廣CH——(CH2)n—
R=H、 CH3 (CH2) n-或V ， n=0， 1， 2，…n ;也可以是碳氧鏈環
r—O—(CHR'—CH—0〗x—CH—ch2—ch—
氧化物 \< ，式中R=CnH2n+1-、V ， R， 二H、
CH3-(C2H5)n-， n二O、 1、 2…n， x=0、 1、 2…x。環氧交聯固定比傳統戊二醛交聯 固定的好處是.由於環氧基較活潑，交聯可進行得很充分，且易通過交聯劑的 用量控制交聯度及相關性能，交聯產物較穩定，不輕易降解，在細胞增殖、組 織生長需要的驅動下，由細胞分泌出激肽釋放酶協同膠原酶作用，才將其降解 吸收，呈被動降解狀態，可使降解與組織生長同步，且其降解產物無殘留毒性， ,織相容性好。
以上F步驟中，所述的多方位除抗原是指用多種試劑破壞或封閉抗原表位。 包括用親核試劑與引起抗原的特異活性基團結合將其封閉，以及用強氫鍵試劑 改變引起抗原的特異構象，其中膠原分子的構象主要是由氫鍵形成引起的，這 裡所述的活性基團主要是-0H*， -NH/， -Sf等。所述的親核試劑可以是醯氨
R—C—Cl ，式中R=CnH2n+1- ， n=0， 1， 2…n;醯胺R_c—nh2 ，式中R=CnH2n+1-, n=0， 1， 2…n;酸酐r — c一o—c一r ，式中R=CnH2n+「， n = l l0;或環氧
R — CH—CH2 ，"H—(CH>—
化物 ，式中I^CnH2n+「 、 Y ， n=0， 1 10等，所述的
強氫鍵試劑主要是胍類化合物。
以上F步驟中，所述的朊病毒殺滅是殺滅可能存在的朊病毒，可以用IN氫
氧化鈉浸泡骨材料不少於1小時。
以上G步驟中，所述的誘導活性修飾是指將可粘附生長因子及細胞的活性組
分，如某些特定多肽或糖胺聚糖的複合物引入製品表面(含微孔內表面)，使植 入體內後能粘附富集機體自我修復機制釋放的生長因子和種子細胞，高效地誘
導骨組織生長；.也可在體外先粘附BMP再植入，這裡BMP為骨形態發生蛋白。這 裡所述的特定多肽是一類可非特異性粘附生長因子的多肽類物質，多肽之一由 為含有16個賴氨酸(K)和甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、 脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)聚合成的多肽K (16) GRGDSPC;糖胺聚糖複合 物可以是透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素、乙醯肝素等的複合物。 引入的方法，可以是偶聯劑偶聯方式，也可以化學吸附。偶聯劑主要是一些易 與-NH2， -OH， -SH基團的活潑氫起反應的雙官能團物質，例如可以是二醯二胺、 二醯二氯、二酸內酐、雙環氧化物、碳化二亞胺等。
上述的主要製備步驟C、 D、 E、 F、 G、 H中，均同時應用了高滲透技術，在 高滲透反應器中進行。所謂高滲透技術就是一個超聲振蕩與真空脈衝連動的高 滲透反應器，通過超聲振蕩及真空脈衝可有效地將骨材料微孔中的氣體及顆粒 雜質排出，使相應的試劑能滲入微孔深處起作用，確保內外作用完全。
製得的產品包裝後，用不小於25KGy的鈷一60廠射線輻照滅菌，可有效殺 滅除朊病毒之外其他已知動物源性病毒。這樣，便製得組成及結構與天然骨相 似的，無菌，無病毒，不會引起免疫排異反應，生物相容性好，可以誘導骨組 織再生的新型人工骨材料。
本實用新型的生物型骨修復材料可根據需要製成多種人工骨(即骨替代 體)，包括人工肋骨，指骨，胸骨，顱骨等，也可製成骨螺釘，骨板，髓內針， 脊椎融合器等骨固定器件，還可製成骨粒，骨塊，骨條等骨填充材料，應用於 骨科治療中。
本實用新型的生物型骨修復材料的優點是直接以動物全骨為原料，通過 環氧固定、多方位除抗原及誘導活性修飾等先進技術處理，並應用了高滲透工 藝，製得了有效去除免疫原性，又保留了含眾多活性組分的骨質基，具有骨誘 導活性的新型人工骨材料，在有機、無機組成及多維結構上都與人體骨更接近，
能更好地誘導骨組織再生。並且同時應用NaOH殺滅朊病毒及應用Y-射線輻照 殺滅己知病毒，使應用更安全。對比去有機質(脫蛋白)動物骨，本實用新型 的人工骨在組織相容性、力學性能上都更勝一籌。對比未經專門除抗原處理和 環氧固定處理，以及滅朊病毒處理，只作簡單的酒精浸泡、脫脂、戊二醛固定、 Y-射線滅菌的動物骨，本實用新型的人工骨在組織相容性及安全性、去免疫原 性、骨誘導性方面更勝一籌。

圖1為本實用新型生物型骨修復材料製成人工骨肋骨的剖面結構示意圖； 圖2為本實用新型生物型骨修復材料製成骨螺釘示意圖； 圖3為本實用新型生物型骨修復材料製成脊椎融合器的示意圖。
具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例對本實用新型進行詳細的說明。 生物型骨修復材料，如圖1所示，由動物骨經脫脂、脫細胞、固定處理、 多方位除抗原、.朊病毒殺滅後形成的生物型骨材料基體1，以及偶聯在基體表 面的誘導活性修飾層2組成。誘導活性修飾層可以是在基體上偶聯的可非特異 性粘附生長因子的多肽活性表面層；所述的多肽可以是由16個賴氨酸(K)和 甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)、半胱氨
酸(C)聚合成的多肽K (16) GRGDSPC。也可以是在基體上偶聯的糖胺聚糖復 合物活性表面層。本實用新型的生物型骨修復材料可根據需要製成多種人工骨 (又稱骨替代體)，包括人工肋骨、指骨、胸骨、顱骨等；也可製成骨板、髓內 針、骨螺釘、脊椎融合器等骨固定器件，還可製成骨粒、骨條、骨塊、骨填充 料等。(見圖1、圖2、圖3)
以下為生物型骨修復材料的具體製作工藝的實施例。 實施例l
生物型骨修復材料是以動物骨為原料，經如下製作步驟製作而成
A、 選取動物骨；
B、 預處理用0. 1%苯扎溴銨消毒30分鐘，洗淨後用專用工具，如刮骨刀 等，削除肌肉組織及骨膜，洗乾淨；
C、 脫脂在高滲透反應器內用乙酸酯浸提其中脂肪，然後洗淨；
D、 脫細胞在高滲透反應器中用表面活性劑脫細胞，然後洗淨；
R —CH—CH，
E、 固定處理在高滲透反應器中用環氧化試劑 / 進行固定處理，
CH廣CH—(CH2)n—
然後洗淨，式中R《nH2n+廠、V , n=0， 1， 2…n;
F、 多方位除抗原在高滲透反應器中用醯氯親核試劑B — C一d封閉引起
抗原的活性基團，然後洗淨，式中R《nH2n+廠，n=0， 1， 2…n;
G、 朊病毒殺滅在高滲透反應器中用1N氫氧化鈉浸泡不少於60分鐘，洗
淨；
H、 誘導活性修飾在高滲透反應器中用偶聯劑碳化二亞胺(R_N=C=N-R，) 將非特異性粘附生長因子的多肽K (16) GRGDSPC偶聯到製品中，洗淨；I、包裝用滅菌生理鹽水作保存液溼態包裝；
J、 y-射線輻射滅菌用鈷60 Y-射線滅菌，y-射線劑量不低於25Kgy; K、經檢驗後即得成品。 實施例2
F、多方位除抗原在高滲透反應器中用醯胺親核試劑formula see original document page 10封閉引起 抗原的活性基團，然後洗淨，式中R二CJ^+廣，n=0， 1， 2…n;
H、誘導活性修飾在高滲透反應器中用偶聯劑二酸內酐將多肽K (16) GRGDSPC偶聯到製品中；
其餘步驟類似，不再累贅。 實施例3
B、預處理用0. P/。過氧乙酸消毒30分鐘，洗淨後用削除肌肉組織及骨膜， 洗乾淨；
R—0—(CHR'—CH—。》x—CH—OHt
E、 固定處理在高滲透反應器中用環氧化試劑 formula see original document page 10 ，
進行固定處理，然後洗淨，式中R=CnH2n+1-、 formula see original document page 10 ， R' =H、 CH3-(C2H5)n-， n=0、 1、 2…n， x二O、 1、 2…x;
R — CH—CH，
F、 多方位除抗原在高滲透反應器中用環氧化物 formula see original document page 10和胍類化合
物封閉引起抗原的活性基團，然後洗淨，式中1 =(^211+1- 、formula see original document page 10 ，n=0，
1 10;
H、誘導活性修飾在高滲透反應器中用偶聯劑二醯二氯將多肽K (16) GRGDSPC偶聯到製品中；
其餘步驟類似，不再累贅。本實用新型生物型骨修復材料的製備方法中，專門設計了應用多種活潑試
劑從多方面封閉及破壞抗原表位的多方位除抗原技術，此外，還設計了用25KGy
以上的Y-射線輻射殺滅動物原性病毒，以及增加成骨誘導活性的表面活性修飾 步驟。另外還考慮到骨基質主要存在骨的微孔中，為使各步反應的試劑能深入 微孔內與骨基質作用，專門設計了一套超聲振蕩加真空脈衝的高滲透反應器， 確保反應試劑能滲入微孔深處與骨基質起反應，確保作用更充分更有效。使得 本實用新型的生物型骨修復材料在組織相容性、成骨誘導活性、實用性方面都 比現有的，以動物骨為原料的製品優越。
權利要求1、生物型骨修復材料，其特徵在於由生物型骨修復材料基體，以及偶聯在基體表面的誘導活性修飾層組成。
2、 根據權利要求1所述的生物型骨修復材料，其特徵在於所述的誘導活 性修飾層是在基體上偶聯的可非特異性粘附生長因子的多肽活性表面肽層。
3、 根據權利要求1所述的生物型骨修復材料，其特徵在於所述的誘導活 性修飾層是在基體上偶聯的糖胺聚糖複合物活性表面層。
專利摘要本實用新型提供了一種生物型骨修復材料，由動物骨經脫脂、脫細胞、固定處理、多方位除抗原、朊病毒殺滅等步驟後形成的生物型骨材料基體，以及偶聯在基體表面的誘導活性修飾層組成；誘導活性修飾層可以是在基體上偶聯的可非特異性粘附生長因子的多肽活性表面層；也可以是在基體上偶聯的糖胺聚糖複合物活性表面層。本實用新型生物型骨修復材料有效的去除了免疫原性，又保留了含眾多活性組分的骨質基，具有骨誘導活性，在有機、無機組成及多維結構上都與人體骨更接近，能更好地誘導骨組織再生，並且應用更安全，組織相容性、力學性能優良。
文檔編號A61L27/36GK201182778SQ200720059688
公開日2009年1月21日 申請日期2007年11月16日 優先權日2007年11月16日
發明者斌 徐, 徐國風 申請人:廣州知光生物科技有限公司