用組培獲得100％不育群體的白菜制種技術的製作方法
2023-05-16 16:40:01 4
專利名稱：用組培獲得100％不育群體的白菜制種技術的製作方法
技術領域：
本發明是一種通過白菜雄性不育系組織培養的方法生產一代雜種種子的技術。屬於組織培養與大白菜雜種優勢利用領域。國際專利分類為C12N5/00。
目前國內外大白菜雜優利用的主要途徑是自交不親和系和雄性不育兩用系。
1、自交不親和系日本從五十年代初期開始應用自交不親和系配製雜交種，近年日本育成的大白菜雜交種幾乎全部都是自交不親和系雜交種。國內，青島市農科所於一九六八年首先採用自交不親和系法育成了「青雜早豐」，此後自交不親和系逐漸成為國內大白菜雜優利用的主要途徑之一。自交不親和系法的缺點，一是雜種純度不理想，真雜種率不可能達到100%，二是自身繁殖困難，成本高。
2、雄性不育兩用系這是我國獨創的大白菜雜優利用方法。在一九七四年的全國蔬菜科研協作會議上，中國農科院、瀋陽農業大學、瀋陽市農科所、鄭州市蔬菜所同時發表了「大白菜雄性不育兩用系研究和利用的研究報告」，此後，雄性不育兩用系亦逐漸成為國內大白菜雜優利用的主要途徑之一。雄性不育兩用系的缺點是只有50%不育株率，制種時需加密定植母本行，隨之在開花前又必須拔除佔50%株數的可育株。
鑑於大白菜自交不親和系和雄性不育兩用系尚不盡理想，所以，一九七八年至一九八二年國家農業部曾組織全國大白菜雄性不育系攻關協作組，攻關協作組利用從法國和美國引進的具有蘿蔔細胞質和aa染色體組的雄性不育系R1轉育大白菜不育系，但始終未能克服R1的葉片黃化、密腺退化和雜種優勢不強的嚴重缺陷。此後，一九八七年黑龍江省園藝所鑑定了「王兆紅蘿蔔×白菜」遠緣雜交，回交育成的134大白菜胞質不育的育種材料，但該不育材料亦因葉片黃化尚不能用於生產。另據《四川農業科學》報導(1988年第五期)，成都市農科所育成大白菜「早皇白」雄性不育系，並育成不育系雜交種「六十天早」推廣應用。該不育系採用屬間遠緣雜交，回交育成不育株率雖達到97.56%。但不育性尚欠穩定。
在組織培養方面，目前還未見大白菜組織培養的報導關於植物組織培養的報導較多，分別概述如下1、專利文獻中有關組織培養的報導。日本專利JP58-28278至JP58-28282，JP58-116677，JP59-28471，JP60-2183，JP60-16589，JP60-105491，JP61-78379至JP61-78381，JP61-88876，JP60-166281，JP60-186281，JP60-105491，蘇聯專利SU1036306，SU1076034，SU810160，歐洲專利EP-183-973A20，EP-111-664-A24，英國專利GB208983T，GB2112-413A，中國專利申請CN87101002，CN86103374，CN87104202，CN87107542，CN86104756，CN86103448，CN86108050，CN87104410，CN87107227均報導了有關植物組織培養技術，其培養基大部分選擇MS培養基，在培養基中加進一定微量元素，培養材料選擇有原生質體、植物各種器官等。消毒培養條件根據植物特點選定。
2、PlantcellRepts1986.5期5-8頁報導了《用組織培養法進行LeptospermamSPP的無性繁殖》研究了促進三種Leptospermam(L.brachyandrum，L.petersonii和L.flavescens)的繁殖條件。將腋芽的外植體和軸外植體置於含有常量元素、微量元素、維生素、胺基酸、蔗糖(0.06克分子)和苄氨基嘌呤(0.04-1.0微克分子)的培養基上，在16小時照明條件下培養。降低培養基中的瓊脂濃度(由0.8降至0.2%)，能大大刺激腋芽的發育和L.flavescens和L.brachyandrum的生長。2.4-D和對氯苯氧基乙酸在L.flavescens中當濃度分別為5和1微克分子時，能刺激腋芽生根。在L.petersonii中，刺激根萌發及其發育的是β-萘乙酸(1微克分子)，而在L.brachyandrum中則是吲哚丁酸和α萘乙酸。
PlantcellRepts19865期17-18頁報導了《用腋芽組織培養繁植薄荷屬的種》介紹了利用腋芽進行6種薄荷的快速繁殖方法。將一年生植物薄荷(M.arvensis)辣薄荷(M.piperita)，唇萼薄荷(M.pulegium)，留蘭香(M.spicata)和薄荷(M.viridesl.)的節片接在含有6苄胺基嘌呤(10.2毫克/升)和激動素(10毫克/升)的MS培養基上，於28℃靜置，並照明12小時。經過30天在外植體上生成若干枝(平均每個外植體15-20個枝)和根，將獲得的再生植體移入土壤中作進一步培養。列舉了關於2.4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、激動素和6-苄胺基嘌呤對再生過程的影響資料。
本發明的目的是採用組織培養技術快速繁殖大白菜雄性不育系，從而簡化制種程序獲得100%的不育群體，用於雜交制種。
本發明是一種利用組織培養獲得白菜100%不育群體生產一代雜種種子的方法，其特徵是取雄性不育系的白菜種子，或不育株的其他器官和組織，經過組織培養快速繁殖，形成試管苗，將試管苗移栽形成100%不育群體，用該不育群體生產雜種一代種子。
(1)取雄性不育株的白菜種子，或不育株的其他器官和組織，經表面消毒，在無菌條件下接種在88-13或88-52或CC-1、或CC-1A基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%，培養5-15天後生長成幼苗。
(2)在無菌條件下，將幼苗頂芽切下，接種在88-13或88-52或CC-1、或CC-1A基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L，誘導產生不定芽，以後每隔10-20天繼代一次。
(3)在無菌條件下，將不定芽轉移到88-13或88-52或CC-1A或CC-1基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。培養20天後，形成具根可移栽的試管苗。
(4)將試管苗移栽到裝有營養土的培養缽內，在氣溫＞-5℃的條件下，試管苗可直接移植到陽畦中。經過栽培管理，形成正常開花的不育群體。制種技術採取適期移栽和定植、合理密植、適宜行比，從而提高種子產量。
為了克服自交不親和系繁殖困難、不親和性穩定度差和退化問題，以及克服不育系拔除有粉株的麻煩，本發明利用組織培養方法繁殖不育株獲得了100%不育群體。與現有方法比較，它有下列優點1、由於獲得的群體達到100%的不育率，可保證100%的雜交率;
2、不會因自交而出現生活力退化;
3、由於可容易地從自然群體或通過轉育獲得不育株，所以該方法簡單易行，且親本來源廣泛;
4、有利於工廠化生產;
5、由於制種群體實際為一個單株的無性系，因此有可能利用未完成純化的材料生產優質的一代雜種，擴大了白菜一代雜種親本的利用範圍，從而簡化制種程序。
下面詳細敘述
具體實施例方式(一)不育組培苗的生產取一粒雄性不育株種子，經表面消毒，在無菌條件下接種在選定的種子培養基中。在一定環境條件下培養5-15天，生長成幼苗，切其頂芽轉入到另一選定的不定芽培養基上，誘導產生不定芽。以後每隔15天左右繼代一次。不定芽可以每月平均為5倍的速率繁殖。
將不定芽移到已選定的生根成苗培養基上20天後，可形成具根、可移栽的正常植株。其植株分化速率每月平均為7倍。即1個芽培養5個月後可繁殖1.6萬棵正常植株。
在我們選用的小白口兩用系試材中，首次培養出15、29、57、174等株系。試管苗經春化後，每個系移栽40棵，開花後觀察它們的育性。結果表明，15、29和57號的全部植株都是不育株，174號的植株都是可育株。在以後的培養過程中，除掉可育株系，保留不育株系。
種子培養基、不定芽培養基、生根培養基都是以88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A為基本培養基。初代培養基還要另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%;不定芽培養基還要另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L;生根培養基還要另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。
1、消毒藥劑和方法的選擇通過對多種消毒藥劑的試驗，篩選出一種既可保證種子消毒接種後培養基不汙染，又不影響種子發芽和幼苗生長的消毒藥劑和方法。具體為用70%酒精浸泡種子表面5-30秒後用0.3%新潔爾浸泡種子5-6分鐘，然後用0.2%氯化高汞浸泡種子8分鐘。最後用無菌蒸餾水衝洗種子3-4次。
2、基本培養基篩選自我設計和選用了共9種培養基進行基本培養基的篩選。通過多次對比試驗，選擇出4種培養基為適宜的培養基。分別為88-13，88-52，C.C-1，C.C-1A。其培養基成分附後。
3、激素種類和濃度的選擇激素是培養基的重要成分，以3種生長素，9種生長素濃度，2種激動素，6種激動素濃度進行激素種類和濃度的對比試驗。試驗結果表明6BA(6-卞基嘌呤)2.0-4.0mg/L，NAA(萘乙酸)0.1-1.0mg/L，為誘導芽最合適的激素種類和濃度。6BA(6-卞基嘌呤)3.0-5.0mg/L，NAA0.1-0.5mg/L為初代培養最合適的激素種類和濃度。6BA1.0-4.0mg/L，NAA0.5-1.0mg/L，為成苗最適宜的激素種類和濃度。對於上述兩種激素，可用KT(激動素)代替6BA，可用IAA(吲哚乙酸)代替NAA，濃度相同。
4、種子萌發成苗芽分化成株2個階段對活性炭的依賴性通過試驗證明將種子播入培養基到萌發成苗這一階段，培養基必須附加活性炭，否則影響種子萌發階段的下胚軸伸長和頂芽的發生。
通過試驗證明將不定芽轉入到附加活性炭的培養基中，可使其發育成為具有根、莖、葉，可移栽的正常植株，不加活性炭的相應培養基，只能產生大量不發芽，不能發育成為正常植株。
5、培養條件的選擇通過試驗和觀察，幼苗、頂芽、不定芽、試管苗的培養溫度白天為18-24℃，夜間為10-15℃，光照為1000-2000勒克司，每天光照10小時為合適的培養條件。當溫度超過25℃時，試管苗極易發生玻璃化。
(二)不育系組織培養苗的移植將試管苗移植到培養缽內，每缽一株，成活率可達85%以上。具體移栽技術如下1、培養基將試管苗分別移栽到裝有土、土+蛭石和花卉營養土三種培養基的營養缽內。試驗表明，以蛭石∶土＝1∶1為最佳培養基，既通風又保水，適合幼苗生長。在園土和土+蛭石培養基質中加入1公斤複合肥/立方米。
2、溫度幼苗在10-30℃下都能生長，以日/夜＝25/10℃為宜。移植於溫室或塑料大棚後，澆足水，上蓋塑料薄膜1-3天，3-7天後即可移栽到陽畦中。在氣溫為＞-5℃的條件下，試管苗可直接移植到陽畦中。
3、密度適宜的父母本行比為1∶3-18，合理的密度為每畝定植密度3500-5000株。
4、適期移栽和定植保證苗期有20-40天的小於5℃天氣，定植時氣溫要≥0℃。
(三)雜交組合父本苗的獲得1、可利用常規小株採種技術獲得父本群體2、可利用上述組培技術，獲得父本單株無性系群體(四)雜交種生產技術制種技術主要採取安全隔離、適期移栽和定植、合理密植、適宜行比、適期收穫。現以小白口XE9的制種技術為例敘述1、安全隔離雜種制種要求周圍1公裡以上的距離沒有其它白菜、蔓菁、油菜等十字花科作物同時採種。
2、適期移栽和定植北京地區1月下旬到2月上旬移載不育試管苗，同時移栽或播種可育父本，3月下旬定值。
3、適期收穫終花期提前剷除父本行，以利種子採收和田間通透。種株進入黃莢後期進行收穫，後熟、脫粒。
附錄88-13培養基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸噻胺0.5mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L葉酸0.5mg/L肌醇100mg/L煙酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8
88-52培養基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 8.6Mg/LH3BO36.2Mg/LMnSO4·4H2O 22.3Mg/LKI0.83mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸硫胺素0.4mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L煙酸0.5mg/L肌醇100mg/L甘氨酸2mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8C.C-1培養基成分化合物毫克/升NH4NO3450Mg/LCaCl2·2H2O 600Mg/L
MgSO4·7H2O 250Mg/LKNO3300Mg/LKH2PO4300Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸噻胺0.5mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L葉酸0.5mg/L肌醇100mg/L煙酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8C.C-1A培養基化合物毫克/升NH4NO31500-1800Mg/L (或NH4SO4) 120-500mg/LCaCl2·2H2O 150-650Mg/LMgSO4·7H2O 250-450Mg/LKNO3300-2500Mg/LKH2PO4150-400Mg/L (或Na2PO4) 120-175mg/LZnSO4·7H2O 4-15Mg/LH3BO33.8-15Mg/L
MnSO4·4H2O 10-35Mg/LCuSO4·5H2O 0.01-0.04Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.1-0.35Mg/LKI0.5-0.9mg/LCoCl0.01-0.04mg/L
鹽酸噻胺0.2-0.7mg/L鹽酸吡哆素0.2-0.75mg/L葉酸0.25-0.80mg/L肌醇80-120mg/L煙酸2.0-7.0mg/L甘氨酸0.50-4.00mg/L生物素0.02-0.09mg/L蔗糖(或葡萄糖)3%瓊脂0.4-0.8%PH5.8
權利要求
1.一種利用組織培養獲得白菜100%不育群體生產一代雜種種子的方法，其特徵是取雄性不育的白菜種子，或不育株的其他器官和組織，經過組織培養快速繁殖，形成試管苗，將試管苗移栽形成100%不育群體，用該不育群體生產雜種一代種子；(1)取雄性不育株的白菜種子，或不育株的其他器官和組織，經表面消毒，在無菌條件下接種在88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%，培養5-15天後生長成幼苗；(2)在無菌條件下，將幼苗頂芽切下，接種在88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L，誘導產生不定芽，以後每隔10-20天繼代一次；(3)在無菌條件下，將不定芽轉移到88-13或88-52或C.C-1A或C.C-1基本培養基中，該培養基另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。培養20天後，形成具根可移栽的試管苗；(4)將試管苗移栽到裝有營養土的培養缽內，經過栽培管理，形成正常開花的不育群體。制種技術採取適期移植和定植、合理密植、適宜行比，從而提高種子產量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是消毒藥劑用70%酒精浸泡種子表面5-30秒後用0.3%新潔爾浸泡種子5-6分鐘，然後用0.2%氯化高汞浸泡種子8分鐘，最後用無菌蒸餾水衝洗種子3-4次。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是試管苗培養條件為溫度白天為18-24℃，夜間為10-15℃，光照為1000-2000勒克司，每天光照10小時為合適的培養條件。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是培養缽內營養土為蛭石∶土＝1∶1為最佳培養基，或園土或蛭石培養基質中加入1公斤複合肥/立方米。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是栽培管理以日/夜＝25/10℃為宜。移植於溫室或塑料大棚後，澆足水，上蓋塑料薄膜1-3天，3-7天後，即可移栽到陽畦中，在氣溫為＞-5℃的條件下，試管苗可直接移植到陽畦中。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是適宜的父母本行比為1∶3-18，合
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是適期移載和定植，保證苗期有20-40天的小於5℃天氣，定植時氣溫要≥0℃。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是C.C-1A培養基成分為化合物毫克/升NH4NO31500-1800Mg/L(或NH4SO3) 120-500mg/LCaCl2·2H2O 150-650Mg/LMgSO4·7H2O 250-450Mg/LKNO3300-2500Mg/LKH2PO4150-400Mg/L (或Na2PO4) 120-175mg/LZnSO4·7H2O 4-15Mg/LH3BO33.8-15Mg/LMnSO4·4H2O 10-35Mg/LCuSO4·5H2O 0.01-0.04Mg/LNa3MoO4·2H2O 0.1-0.35Mg/LKI0.5-0.9mg/LCoCl0.01-0.04mg/L
鹽酸噻胺 0.2-0.7mg/L鹽酸吡哆素0.2-0.75mg/L葉酸0.25-0.80mg/L肌醇80-125mg/L煙酸2.0-7.0mg/L甘氨酸0.50-4.00mg/L生物素0.02-0.09mg/L蔗糖(或葡萄糖)3%瓊脂0.4-0.8%PH5.8
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵是88-13培養基為:化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸噻胺 0.5mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L葉酸0.5mg/L肌醇100mg/L煙酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵是88-52培養基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 8.6Mg/LH3BO36.2Mg/LMnSO4·4H2O 22.3Mg/LKI0.83mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸硫胺素 0.4mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L煙酸0.5mg/L肌醇100mg/L甘氨酸2mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8
11.根據權利要求1所述的方法，其特徵是C.C-1培養基成分為化合物毫克/升NH4NO3450Mg/LCaCl2·2H2O 600Mg/LMgSO4·7H2O 250Mg/LKNO3300Mg/LKH2PO4300Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH2BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa3MoO4·2H2O 0.25Mg/L
鹽酸噻胺0.5mg/L鹽酸吡哆素0.5mg/L葉酸0.5mg/L肌醇100mg/L煙酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%瓊脂0.8%PH5.8
全文摘要
一種白菜一代雜種制種新技術，取白菜不育株種子或植株任何部位，經表面消毒，在無菌條件下接種到培養基中，培養5—7天，切其頂芽轉入另一培養基，誘導產生不定芽，再將不定芽轉接到生根成苗培養基，形成根即可移栽。本發明可獲得100％的不育系，使雜交率達到100％，且方法簡單易行，親本來源廣泛，有利於工廠化生產，從而擴大了白菜一代雜種親本的利用範圍。
文檔編號C12N5/04GK1045991SQ8910171
公開日1990年10月10日 申請日期1989年3月28日 優先權日1989年3月28日
發明者鈕心恪, 李春玲, 蔣鍾仁, 孫日飛 申請人:北京市海澱區植物組織培養技術實驗室, 中國農業科學院蔬菜花卉研究所