用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙及其製備方法
2023-05-16 15:13:21
專利名稱：用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，尤其涉及一種免疫層析試紙，具體來說是 一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙及其製備方法。
技術背景-
鼠疫的致病菌鼠疫耶爾森氏菌(r^w'm'" 是人們早已熟知的烈 性病原微生物，具有容易獲得，致病性強，致死率高，對自然環境的抵抗 力較強的特點，不同性別和年齡的人都是易感人群，因而被公認為是經典 的生物戰劑。"9.11"事件以後，美國國家反恐預案將鼠疫耶爾森氏菌列為 生物恐怖紅色警報(最高級)中的烈性病原微生物，對環境中鼠疫耶爾森 氏菌的快速檢測現已成為反生物恐怖的重要內容。
鼠疫耶爾森氏菌經典的檢測程序一般分為四步，包括顯微鏡塗片檢查、 細菌培養、鼠疫噬菌體裂解實驗和動物實驗。塗片檢査和細菌培養的標本 一般是採集疑似病人或動物的淋巴結吸出物、痰、腦脊液或死者的肺部組 織材料。鼠疫耶爾森氏菌是杆狀、不形成芽孢、革蘭氏呈陰性且兩端濃染 的厭氧菌。腺鼠疫中80%以上的血液標本培養為陽性，初代培養需要觀察 3-5天。噬菌體裂解實驗用於細菌鑑定，動物實驗用於汙染材料中病原的分 離及毒力的測定。將被檢材料製成懸液，通過腹腔、皮下和經皮等途徑接 種0,2-0.5mL於小白鼠或豚鼠，材料中若果有一定數量的鼠疫耶爾森氏菌， 動物一般在接種2天後死亡。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的 免疫層析試紙及其製備方法，所述的這種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫 層析試紙要解決現有技術中的檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法靈敏度低，檢測方法複雜，時間長的技術問題。
本發明一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙，包括一個纖維 膜，所述的纖維膜上設置有測試帶和對照帶，所述的測試帶中噴塗有鼠疫 耶爾森氏菌Fl抗原抗體溶液，所述的對照帶上噴塗有抗鼠疫耶爾森氏菌
Fl抗原抗體的抗抗體，在所述的纖維膜上靠近對照帶的一側設置有吸水
墊，在所述的纖維膜上靠近測試帶的一側設置有金標墊，所述的金標墊為
玻璃纖維膜、樹脂或無紡布，所述的金標墊中設置有抗耶爾森氏菌Fl抗 原抗體的免疫膠體金探針溶液，所述的金標墊上設置有樣品墊，所述的樣 品墊設置在遠離測試帶的金標墊的一側。
進一步的，所述的纖維膜的另外一側設置有背板。
本發明還提供了一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的製備 方法，包括員一個製備鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體和抗鼠疫耶爾森氏菌 Fl抗原抗體的抗抗體的過程，將鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體溶液噴到纖 維膜上形成測試帶，將抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的抗抗體噴到所述 纖維膜的另一區域形成對照帶，然後將吸水紙墊粘貼在所述纖維膜的遠離 所述測試帶的一端；包括一個製備抗耶爾森氏菌Fl抗原抗體的免疫膠體 金探針溶液的過程，將玻璃纖維膜、樹脂或無紡布進入該免疫膠體金探針 溶液，得到金標墊，將其粘貼在纖維素膜的靠近所述測試帶的一端，然後 在金標墊的遠離所述測試帶的一端粘貼樣品墊，得到檢測鼠疫耶爾森氏菌 的免疫層析試紙。
進一步的，所述測試帶上抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的濃度為 2.0-2.26mg/mL。
進一步的，所述對照帶上抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的濃度為 2.5-3.0 mg/mL。
進一步的，所述鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的免疫膠體金探針的制
備方法如下3) 將0.0in/。HAuCU水溶液，加熱煮沸，每100mLHAuCU溶液進行如 下操作攪動下加入1.6mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定 成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；
4) 配製含有濃度為28pg/mL的抗鼠疫耶爾森氏菌F1抗原的抗體的免 疫膠體金探針溶液。
本發明還提供了一種試劑盒，所述的試劑盒中設置有上述的用於檢測 鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙。
在實際應用中，所述纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，寬度 控制在20-2.5mm為宜；所述金標墊寬度為5-10mm;所述樣品墊為玻璃纖 維膜，寬度為20-40mm。
本發明的免疫層析試紙可達到與反向血凝實驗同樣的特異性和敏感 性，並且更加簡便快速，是檢測鼠疫流行及早期檢測的有效方法。
本發明與其他檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法相比，優勢在於檢測過程中 標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書 即可操作，並可迅速觀察結果，具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的 優點，適於臨床和現場使用。
具體實施例方式
實施例1 製備抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體
選用體重2Kg的健康大耳白家兔，皮下注射福氏完全佐劑鼠疫耶爾森 氏菌Fl抗原2mg/只(購於長春生物製品研究所)，並分別於初次免疫後的 第20日、第30日和第40日追加免疫水劑一針，劑量和途徑與初次免疫相 同，末次免疫後IO天測試血清中的抗體效價，經瓊脂雙向擴散法檢測抗體 效價達到l: 32以上採血。
採用飽和硫酸銨鹽析法對血液中的抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體 進行純化，經瓊脂雙向擴散法鑑定獲得的抗體具有較好的特異性和親和性。實施例2 製備免疫膠體金探針
1) 製備膠體金溶液採用檸檬酸鹽還原法製備膠體金顆粒，具體方法
為將HAuCU配置成0.0P/。水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準確 加入1.6mL的1%檸檬酸三鈉(Na3C8H507'2H20)水溶液，液體顏色穩定 成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。
2) 確定膠體金偶聯抗體飽和濃度用0.2MK2CO3或0.1MHC1溶液 調節膠體金溶液pH值至9.0，將抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體稀釋為 lmg/mL濃度，分別取5pL、 10nL、 15pL、 20pL、 25pL、 30|iL加入到lmL 膠體金溶液各管中，混勻後於室溫下放置5min，加入10%NaCl水溶液 O.lmL，混勻，靜置，10-20min後觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時 所含最少抗體量，即為穩定lmL膠體金溶液所需抗體的最適濃度，結果表 明該最適濃度為25pg/mL，在此基礎上增加20%抗體量，即為膠體金歐聯 抗體飽和濃度，該飽和濃度為28嗎/mL。
3) 製備免疫膠體金探針溶液按上述方法配製含有濃度為28jig/mL 的抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體的免疫膠體金探針溶液。
實施例3檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的製備
1) 用濃度為O.OIM， pH7.2的PBS分別將質控抗體(羊抗兔IgG)稀 釋至終濃度為2.5-3.0mg/mL，將步驟一製備的抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原 的抗體稀釋至終濃度為2.0-2.26mg/mL，用BioDot公司XYZ3000點樣儀將 經稀釋的羊抗兔IgG噴塗在300mm長，25mm寬的NC膜上形成一條對照 帶，將經稀釋的抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體噴塗在上述NC膜的另一 區域形成測試帶，室溫晾乾，然後將吸水紙墊貼在NC膜的遠離測試帶的
—端o
2) 將300mm長、10mm寬的玻璃纖維膜進入步驟2製備的膠體金探針 溶液，得到金標墊4， 4。C放置30min， -5(TC冷凍抽乾後，將其貼在步驟l)
7得到的NC膜的靠近測試帶1的一端。
3)在步驟2)中的金標墊的遠離測試帶的一端粘貼300腿長、30mm寬 的玻璃纖維膜樣品墊，得到鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙。
權利要求
1.一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙，包括一個纖維膜，其特徵在於所述的纖維膜上設置有測試帶和對照帶，所述的測試帶中噴塗有鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體溶液，所述的對照帶上噴塗有抗鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體的抗抗體，在所述的纖維膜上靠近對照帶的一側設置有吸水墊，在所述的纖維膜上靠近測試帶的一側設置有金標墊，所述的金標墊為玻璃纖維膜、樹脂或無紡布，所述的金標墊中設置有抗耶爾森氏菌F1抗原抗體的免疫膠體金探針溶液，所述的金標墊上設置有樣品墊，所述的樣品墊設置在遠離測試帶的金標墊的一側。
2. 如權利要求1所述的一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙，其特徵在於所述的纖維膜的另外一側設置有背板。
3. —種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的製備方法，特徵在於包括員一個製備鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體和抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗 原抗體的抗抗體的過程，將鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體溶液噴到纖維 膜上形成測試帶，將抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的抗抗體噴到所述纖維膜的另一區域形成對照帶，然後將吸水紙墊粘貼在所述纖維膜的遠離所述測試帶的一端；包括一個製備抗耶爾森氏菌F1抗原抗體的免疫 膠體金探針溶液的過程，將玻璃纖維膜、樹脂或無紡布進入該免疫膠體 金探針溶液，得到金標墊，將其粘貼在纖維素膜的靠近所述測試帶的一 端，然後在金標墊的遠離所述測試帶的一端粘貼樣品墊，得到檢測鼠疫 耶爾森氏菌的免疫層析試紙。
4. 如權利要求3所述的一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的制 備方法，特徵在於所述測試帶上抗鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體的濃 度為2.0-2.26mg/mL。
5. 如權利要求3所述的一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的制 備方法，特徵在於所述對照帶上抗鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體的濃度為2.5-3.0 mg/mL。
6. 如權利要求3所述的一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的制 備方法，特徵在於所述鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原抗體的免疫膠體金探 針的製備方法包括如下步驟，1) 將0.0iy。HAuCl4水溶液，加熱煮沸，每100mLHAuCU溶液進行如 下操作攪動下加入1.6mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定 成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2) 配製含有濃度為28嗎/mL的抗鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原的抗體的免 疫膠體金探針溶液。
7. —種試劑盒，特徵在於所述的試劑盒中設置有權利要求1所述的的用 於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙。
全文摘要
一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙，包括一個纖維膜，纖維膜上設置有測試帶和對照帶，測試帶中噴塗有鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體溶液，對照帶上噴塗有抗鼠疫耶爾森氏菌F1抗原抗體的抗抗體，在纖維膜上靠近對照帶的一側設置有吸水墊，在纖維膜上靠近測試帶的一側設置有金標墊，金標墊中設置有抗耶爾森氏菌F1抗原抗體的免疫膠體金探針溶液，金標墊上設置有樣品墊，樣品墊設置在遠離測試帶的金標墊的一側。本發明還提供了一種用於檢測鼠疫耶爾森氏菌的免疫層析試紙的製備方法。本發明的免疫層析試紙可達到與反向血凝實驗同樣的特異性和敏感性，並且更加簡便快速，是檢測鼠疫流行及早期檢測的有效方法。
文檔編號G01N33/569GK101676725SQ20081020002
公開日2010年3月24日 申請日期2008年9月18日 優先權日2008年9月18日
發明者葛海鵬 申請人:上海海泰金芯生物分子檢測技術有限公司