基於量子點標記敵百蟲仿生免疫吸附檢測方法與流程

2023-05-16 15:09:06 1

本發明涉及食品安全檢測技術領域，特別是一種基於量子點標記敵百蟲仿生免疫吸附檢測方法。

背景技術：

敵百蟲(trichlorphon，o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)膦酸酯)是一種應用廣泛地有機磷光譜殺蟲劑，具有高效、低毒、低殘留、水溶性好等特點，因此被廣泛應用於農業生產。然而敵百蟲在農藥生產過程中的不合理施用，也帶來了農藥殘留危害的問題，它對動物神經系統的損害以及致癌性和致突變性也越來越引起人們的重視。gb16319-1996規定食品中敵百蟲最大殘留量不得高於0.1mgkg-1。

目前國內外有關食品中敵百蟲檢測方法大都採用氣相色譜法、高效液相色譜法或液相、氣相色譜與質譜聯用的方法進行定性、定量的檢測，但上述幾種檢測方法所使用的設備價格昂貴，原材料消耗大，需要複雜樣品前處理技術。而酶聯免疫法雖然具有高靈敏度和低檢出限，但是酶是大分子物質，以酶標記抗原影響抗體對其的吸附性，且生物抗體存在製備周期長，保存不當易失活等問題，影響其對敵百蟲的檢測。以量子點標記抗原，分子印跡聚合物作為仿生抗體，不但提高了方法的吸附性和靈敏度，而且印跡聚合物製備周期短，不存在失活問題，因此以量子點作為標記物，印跡聚合物作為仿生抗體，建立仿生免疫吸附檢測技術，用於檢測農產品及食品中的敵百蟲，具有重要意義。本發明與現有免疫分析方面技術相比，創新點體現在用量子點代替酶建立仿生免疫分析，提高了仿生免疫分析的靈敏度。

技術實現要素：

本發明的目的在於克服傳統的敵百蟲檢測方法存在的靈敏度低、檢測時間長、儀器價格昂貴、前處理煩瑣等缺陷，提供了一種基於量子點標記敵百蟲仿生免疫吸附檢測方法。

本發明採取的技術方案是：

一種基於量子點標記敵百蟲仿生免疫吸附檢測方法，步驟如下：

1.量子點標記抗原的製備：將敵百蟲半抗原、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和cdse/zns氨基量子點按照200:4000:1～5的摩爾比例依次加入到反應容器中，充分混勻；加入50-100μlph7.4的硼酸鹽緩衝液，避光室溫反應2-10h。反應結束後，離心除團聚，將反應物超濾濃縮進行分離純化得到量子點標記抗原，2-8℃下保存。

2.親水性印跡聚合物膜的製備：將敵百蟲，功能單體，交聯劑按照1:2:2的摩爾比例混勻，96孔酶標板上每孔加入200μl反應液在氮氣環境下聚合反應18h；用7:1(體積比v/v)甲醇-醋酸混合溶液超聲8h除去敵百蟲，再用濃度為100％甲醇清洗4h，37℃乾燥2h後得到親水性分子印跡聚合物膜。

3.以親水性分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將所述量子點標記抗原用濃度為10％甲醇硼酸鹽溶液稀釋500倍作為量子點標記稀釋液用於競爭反應，具體步驟如下：

將96孔酶標板第1行設為空白組，每孔只加200μl濃度10％甲醇硼酸鹽溶液；第2行設為對照組，每孔加100μl量子點標記稀釋液和100μl濃度10％甲醇硼酸鹽溶液；第3-8行每孔均依次分別加入敵百蟲標樣梯度稀釋液和100μl量子點標記物稀釋液；室溫競爭反應1h，多功能酶標儀讀取螢光值，計算抑制率，繪製敵百蟲標準曲線。

4.樣品中加入濃度10％甲醇硼酸鹽溶液中超聲提取3次，定容後用0.45μm濾膜過濾得樣品提取液。將樣品提取液代替步驟3)中所述敵百蟲標準溶液，重複步驟3)操作，計算出待測物中敵百蟲含量。

本發明的優點和積極效果是：

1.本發明提供的量子點的光化學性質較好，具有光穩定性和生物相容性好，量子產率高等優點；該標記物為半導體納米晶體，分子小，可代替傳統的酶標記物應用於免疫技術，克服了傳統酶聯免疫標記物分子大，吸附性能差的缺點。

2.本發明提供的敵百蟲吸附功能材料具有較高的選擇性，由化學方法製備，具有較高的穩定性、較長的使用壽命和較強的抗惡劣環境的能力，克服了生物抗體製備周期長，易失活等缺點。

3.本發明將分子印跡技術與免疫技術聯用建立對敵百蟲具有高靈敏度的仿生免疫吸附檢測方法(最低檢出限比現有酶聯免疫吸附檢測法低)，大大縮短了分析時間(比生物免疫分析縮短1.0h)，適用於快速檢測敵百蟲。

4.本發明成本低廉，前處理簡單，靈敏度高，實驗操作簡單，適用於各種食品中敵百蟲的快速檢測。

本發明與現在其他檢測方法的比較：

附圖說明

圖1為敵百蟲仿生免疫標準曲線

由圖1可知，該方法的靈敏度(抑制率50％值)為5mgl-1，最低檢測限(抑制率15％值)為9μgl-1。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。

本發明是將敵百蟲分子印跡聚合物膜作為仿生抗體與酶聯免疫技術聯用，從而建立對敵百蟲具有高靈敏度的快速檢測方法。其具體實施例為：

1.量子點標記抗原的製備：將16μl敵百蟲半抗原(1mm)、32μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(10mm)和10μlcdse/zns氨基量子點(8μm)依次加入到反應容器中，充分混勻；加入70μl的硼酸鹽緩衝液(ph7.4)，避光室溫反應2h。反應結束後，離心除團聚，並將反應物超濾濃縮進行分離純化，2-8℃下保存。

2.分子印跡聚合物膜的製備：1.028g(4mmol)敵百蟲溶於8ml水和12ml乙腈，然後加入0.688g(8mmol)甲基丙烯酸(maa)磁力攪拌30min後加入1.508ml(8mmol)二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)和0.08g偶氮二異丁腈(aibn)，磁力攪拌1h。在96孔酶標板上每孔加入200μl上述混合溶液氮氣環境下反應18h；用7:1(v/v)甲醇-醋酸溶液超聲8h除去敵百蟲，再用濃度100％甲醇洗4h至中性，37℃乾燥2h後得到分子印跡聚合物膜。

3.以所述分子印跡聚合物膜作為仿生抗體，將所述量子點標記抗原用濃度10％甲醇硼酸鹽溶液稀釋500倍作為量子點標記稀釋液用於競爭反應，具體步驟如下：

將96孔酶標板第1行設為空白組，每孔只加200μl濃度10％甲醇硼酸鹽溶液；第2行設為對照組，每孔加100μl量子點標記抗原稀釋液和100μl濃度10％甲醇硼酸鹽溶液；第3-8行每孔均依次分別加入100μl敵百蟲標樣梯度稀釋液和100μl量子點標記抗原稀釋液；室溫競爭反應1h，多功能酶標儀讀取螢光值，計算抑制率。

4.配製濃度為20000，4000，800，160，32，6.4μg/l的敵百蟲標樣梯度稀釋液。在室溫競爭反應條件下，按照仿生免疫分析流程得到不同的螢光值，按照下列公式計算不同濃度敵百蟲對抗原抗體結合反應的抑制率值：

式中：

ic％——敵百蟲對抗原抗體結合反應的抑制率；

f對照——對照孔平均螢光值；

f樣品——敵百蟲標樣梯度稀釋液或樣品提取液的平均螢光值(3-8行)；

f空白——空白孔的平均螢光值；

以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪製敵百蟲標準曲線。

5.準確稱取韭菜3g，加入15ml濃度10％甲醇硼酸鹽溶液超聲提取3次，合併提取液並定容到50ml，0.45μm濾膜過濾。將得到的樣品提取液代替敵百蟲標樣梯度稀釋液，重複步驟3)操作，得到樣品提取液的螢光值，根據上述公式計算得出韭菜提取液抑制率為25.9％。根據敵百蟲仿生免疫標準曲線求出敵百蟲提取液濃度140μgl-1，計算出韭菜中敵百蟲含量為2.3mgkg-1。