殼聚糖磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法

2023-05-16 15:26:11 1

專利名稱：殼聚糖磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法
技術領域：
本發明涉及一種磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法。
技術背景傳統的酒精發酵工藝，採用玉米粉碎、液化、糖化、發酵連續進行的工藝， 此過程中使用的是游離酵母細胞，發酵完成後，酵母細胞隨發酵液排出系統， 不但造成資源浪費，還增加了廢水排放量和廢水處理難度。發明內容本發明的目的是為了解決傳統酒精發酵工藝中使用游離酵母細胞，酵母細 胞隨發酵液排出系統而消耗，造成發酵罐中酵母細胞濃度不夠大，酒精發酵速 度慢，發酵時間長，不但造成資源浪費，還增加了廢水排放量和廢水處理難度 的問題，而提供的殼聚糖磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法。殼聚糖磁性微球按以下步驟製備 一、按重量百分比將2%~5%的殼聚糖、 2%~3%的磁性納米Fe304顆粒和餘量的乙酸溶液攪拌均勻，製成殼聚糖溶液； 二、在攪拌速度為3000r/min的室溫條件下步驟一製備的殼聚糖溶液以珠狀加 入到有機分散介質中，殼聚糖溶液完全加入後繼續攪拌10min，然後再加入殼 聚糖溶液體積4%~10%的交聯劑，在3000r/min的攪拌速度下反應2~4h;三、 用磁鐵收集磁性微球初品，然後依次用石油醚和丙酮連續清洗，再放入40°C 的條件下乾燥2天，即得到殼聚糖磁性微球；其中步驟一中乙酸溶液的質量濃 度為5%;步驟二中有機分散介質按體積份數比由25 40份的液體石蠟、30~45 份的石油醚和1.2 2份的乳化劑組成。磁性微球固定化酵母按以下步驟製備 一、釀酒活性乾酵母復水活化;二、 釀酒酵母擴大培養，然後將菌體離心、洗滌，製成酵母細胞懸浮液；三、將上述製備的殼聚糖磁性微球放入4"C的釀酒酵母培養液中溶脹48 96h;四、取出 溶脹的殼聚糖磁性微球放入酵母細胞懸浮液中，並在30 35。C、 100 150r/min 的條件下反應12 48h，然後再用質量濃度為0.9。/。NaCl溶液洗滌，磁分離，即 得到磁性微球固定化酵母；步驟四中酵母細胞懸浮液與殼聚糖磁球的質量比為2~6:1。本發明殼聚糖磁性微球是在磁性納米Fe304顆粒表面包裹高分子材料殼聚 糖，本發明殼聚糖磁性微球兼具磁性粒子和高分子材料的雙重特性， 一方面具 有超順磁性，在外加磁場的作用下能快速、簡單地分離，並可在磁場作用下定 位；另一方面具有與生物活性物質反應的特殊功能團，可以結合各種生物活性 物質(包括活性酵母)。殼聚糖本身就具有很好的吸附性、成模性和通透性、 成纖性、吸溼性和保溼性，並且具有優良的生物親和性，其分子鏈上豐富的羥 基和氨基使其易於進行化學修飾，從而賦予其多種功能。殼聚糖是天然存在的 唯一的鹼性多糖，殼聚糖上的游離氨基可與醛發生縮合反應生成西佛鹼，可由 雙官能團的醛或酸酐等進行交聯，得到網狀結構的不溶產物(交聯的目的是使 產物不溶解)，甚至溶脹也很小，性質穩定。本發明殼聚糖磁性微球生物親和性好，粒徑均勻，磁響應性強為 2950-3簡Gs。本發明磁性微球固定化酵母可放入磁場穩定的流動床反應器中，能夠減少 持續反應體系中的操作，適合於大規模連續化操作；而且利用外部磁場可以控 制本發明磁性微球固定化酵母的運動方式和方向，替代傳統的機械攪拌方式， 提高固定化酵母的催化效率。採用本發明磁性微球固定化酵母發酵酒精不僅可 以形成良好的無氧發酵環境，還可以大幅降低酒精廢水中懸浮物的含量。固定 化酵母細胞不隨發酵液排出系統，避免了消耗，保持了發酵罐中酵母細胞濃度， 提升了酒精發酵速度，縮短了發酵時間，減少了資源消耗量，並同時降低了廢 水的排放量和廢水處理的難度。


圖1是具體實施方式
十三製備的殼聚糖磁性微球的掃描電鏡圖片，圖2是具體實施方式
二十二製備的磁性微球固定化酵母的顯微鏡觀察圖。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式殼聚糖磁性微球按以下步驟製備 一、按重 量百分比將2% 5%的殼聚糖、2%~3%的磁性納米Fe304顆粒和餘量的乙酸溶 液攪拌均勻，製成殼聚糖溶液；二、在攪拌速度為3000r/min的室溫條件下步 驟一製備的殼聚糖溶液以珠狀加入到有機分散介質中，殼聚糖溶液完全加入後繼續攪拌iomin，然後再加入殼聚糖溶液體積4%~10%的交聯劑，在3000r/min 的攪拌速度下反應2~4h;三、用磁鐵收集磁性微球初品，然後依次用石油醚 和丙酮連續清洗，再放入4(TC的條件下乾燥2天，即得到殼聚糖磁性微球； 其中步驟一中乙酸溶液的質量濃度為5%;步驟二中有機分散介質按體積份數 比由25 40份的液體石蠟、30~45份的石油醚和1.2~2份的乳化劑組成。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中有 機分散介質的體積為加入的殼聚糖溶液體積的1~1.6倍。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中有 機分散介質的體積為加入的殼聚糖溶液體積的1.2倍。其它步驟及參數與實施 方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中有 機分散介質的體積為加入的殼聚糖溶液體積的1.4倍。其它步驟及參數與實施 方式一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中加 入殼聚糖溶液體積6%的交聯劑。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中加 入殼聚糖溶液體積8%的交聯劑。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一、五或六的不同點是步 驟二中的交聯劑為戊二醛或甲醛。其它步驟及參數與實施方式一、五或六相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟二中的 交聯劑為戊二醛，並用NaOH調節反應環境pH值到9 10。其它步驟及參數與實施方式五相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中有 機分散介質按體積份數比由30份的液體石蠟、40份的石油醚和1.8份的乳化 劑組成。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中有 機分散介質按體積份數比由35份的液體石蠟、35份的石油醚和1.5份的乳化 劑組成。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一、九或十的不同點是 步驟二有機分散介質中的乳化劑為Tween-80或Span-40。其它步驟及參數與實 施方式一、九或十相同。
具體實施方式
十二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中 按重量百分比將3%的殼聚糖、2.5%的磁性納米Fe304顆粒和94.5%乙酸溶液 攪拌均勻。其它步驟及參數與實施方式一相詞。
具體實施方式
十三本實施方式殼聚糖磁性微球按以下步驟製備 一、按 重量百分比將2%的殼聚糖、2。/。的磁性納米Fe304顆粒和餘量的乙酸溶液攪拌 均勻，製成殼聚糖溶液；二、在攪拌速度為3000r/min的室溫條件下步驟一制 備的殼聚糖溶液以珠狀加入到有機分散介質中，殼聚糖溶液完全加入後繼續攪 拌10min，然後再加入殼聚糖溶液體積4%的戊二醛，並用NaOH調節反應環 境pH值到9 10，在3000r/min的攪拌速度下反應3h;三、用磁鐵收集磁性微 球初品，然後依次用石油醚和丙酮連續清洗，再放入4(TC的條件下乾燥2天， 即得到殼聚糖磁性微球；其中步驟一中乙酸溶液的質量濃度為5°/。；步驟二中 有機分散介質按體積份數比由25份的液體石蠟、35份的石油醚和1.2份的乳 化劑Tween-80組成。本實施方式殼聚糖磁性微球表面有氨基和羧基，在水溶液分散性好，生物 親和性好，可以作為細胞、酶或者其他生物材料的良好載體應用於不同領域。 本實施方式殼聚糖磁性微球粒徑為10pm左右，大小比較均一，單分散性好； 本實施方式殼聚糖磁性微球的磁飽和強度為2954Gs，磁響應性強。本實施方 式殼聚糖磁性微球的掃描電鏡圖片如圖1所示。
具體實施方式
十四本實施方式磁性微球固定化酵母按以下步驟製備一、 釀酒活性乾酵母復水活化；二、釀酒酵母擴大培養，然後將菌體離心、洗滌， 製成酵母細胞懸浮液；三、將具體實施方式
一製備的殼聚糖磁性微球放入4。C 的釀酒酵母培養液中溶脹48 96h;四、取出溶脹的殼聚糖磁性微球放入酵母 細胞懸浮液中，並在30 35。C、 100~150r/min的條件下反應12~48h，然後再用 質量濃度為0.9n/。NaCl溶液洗滌，磁分離，即得到磁性微球固定化酵母;步驟 四中酵母細胞懸浮液與殼聚糖磁球的質量比為2~6:1。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟一中釀酒活性乾酵母復水活化的溫度為38~40°C。其它步驟及參數與實施方式十 四相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟一中用清水或含糖量為4% 10%的水溶液復水活化；清水活化時間為14 20min， 含糖水溶液活化時間為4±0.5h。其它步驟及參數與實施方式十四相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟一 中用清水或含糖量為6%的水溶液復水活化；清水活化時間為16min，含糖水 溶液活化時間為4h。其它步驟及參數與實施方式十四相同。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟一 中用清水或含糖量為8%的水溶液復水活化；清水活化時間為18min，含糖水 溶液活化時間為4。其它步驟及參數與實施方式十四相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟二中釀酒酵母擴大培養至對數期。其它步驟及參數與實施方式十四相同。本實施方式擴大培養時間一般為12 30h。
具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟二 中菌體用質量濃度為0.9MNaCl溶液洗滌。其它步驟及參數與實施方式十四相 同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
十四的不同點是步驟 四中酵母細胞懸浮液與殼聚糖磁球的質量比為4:1。其它步驟及參數與實施方 式十四相同。
具體實施方式
二十二本實施方式磁性微球固定化酵母按以下步驟製備 一、釀酒活性乾酵母在38'C的清水中復水活化20min; 二、釀酒酵母擴大培養， 然後將菌體離心、洗滌，製成酵母細胞懸浮液；三、將具體實施方式
一製備的 殼聚糖磁性微球放入4。C的釀酒酵母培養液中溶脹48h;四、取出溶脹的殼聚 糖磁性微球放入酵母細胞懸浮液中，並在34。C、 110r/min的條件下反應34h， 然後再用質量濃度為0.9。/。NaCl溶液洗滌，磁分離，即得到磁性微球固定化酵 母；步驟四中酵母細胞懸浮液與殼聚糖磁球的質量比為4:1。本實施方式步驟二中在34。C、 110r/min的條件下擴大培養14h，用血球計 數板測得酵母數為5000萬/mL，說明酵母已經達到對數期。本實施方式本實施方式磁性微球固定化酵母的顯微鏡觀察圖如圖2所示。本實施方式磁性微球固定化酵母的載體為殼聚糖磁性微球，通過溶脹-吸 附法將酵母細胞固定到磁性微球上，成為磁性固定化酵母。本實施方式磁性微 球固定化酵母偶聯酵母量大，磁響應性強，生物親和性好，可以回收重複使用。
權利要求
1、殼聚糖磁性微球的製備方法，其特徵在於殼聚糖磁性微球按以下步驟製備一、按重量百分比將2％～5％的殼聚糖、2％～3％的磁性納米Fe3O4顆粒和餘量的乙酸溶液攪拌均勻，製成殼聚糖溶液；二、在攪拌速度為3000r/min的室溫條件下步驟一製備的殼聚糖溶液以珠狀加入到有機分散介質中，殼聚糖溶液完全加入後繼續攪拌10min，然後再加入殼聚糖溶液體積4％～10％的交聯劑，在3000r/min的攪拌速度下反應2～4h；三、用磁鐵收集磁性微球初品，然後依次用石油醚和丙酮連續清洗，再放入40℃的條件下乾燥2天，即得到殼聚糖磁性微球；其中步驟一中乙酸溶液的質量濃度為5％；步驟二中有機分散介質按體積份數比由25～40份的液體石蠟、30～45份的石油醚和1.2～2份的乳化劑組成。
2、 根據權利要求1所述的殼聚糖磁性微球的製備方法，其特徵在於步驟 二中有機分散介質的體積為加入的殼聚糖溶液體積的1 1.6倍。
3、 根據權利要求1所述的殼聚糖磁性微球的製備方法，其特徵在於步驟 二中的交聯劑為戊二醛或甲醛。
4、 根據權利要求3所述的殼聚糖磁性微球的製備方法，其特徵在於步驟 二中的交聯劑為戊二醛，並用NaOH調節反應環境pH值到9~10。
5、 根據權利要求1所述的殼聚糖磁性微球的製備方法，其特徵在於步驟 二有機分散介質中的乳化劑為Tween-80或Span-40。
6、 製備磁性微球固定化酵母的方法，其特徵在於磁性微球固定化酵母按 以下步驟製備 一、釀酒活性乾酵母復水活化；二、釀酒酵母擴大培養，然後 將菌體離心、洗滌，製成酵母細胞懸浮液；三、將權利要求1製備的殼聚糖磁 性微球放入4'C的釀酒酵母培養液中溶脹48 96h;四、取出溶脹的殼聚糖磁性 微球放入酵母細胞懸浮液中，並在30 35°C、 100~150r/min的條件下反應 12~48h，然後再用質量濃度為0.9。/。NaCl溶液洗滌，磁分離，即得到磁性微球 固定化酵母；步驟四中酵母細胞懸浮液與殼聚糖磁球的質量比為2~6:1。
7、 根據權利要求6所述的製備磁性微球固定化酵母的方法，其特徵在於 步驟一中釀酒活性乾酵母復水活化的溫度為3S 40。C。
8、 根據權利要求6所述的製備磁性微球固定化酵母的方法，其特徵在於步驟一中用清水或含糖量為4%~10%的水溶液復水活化；清水活化時間為 14 20min，含糖水溶液活化時間為4士0.5h。
9、 根據權利要求6所述的製備磁性微球固定化酵母的方法，其特徵在於 步驟二中釀酒酵母擴大培養至對數期。
10、 根據權利要求6所述的製備磁性微球固定化酵母的方法，其特徵在於 步驟二中菌體用質量濃度為0.9%NaCl溶液洗滌。
全文摘要
殼聚糖磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法，它涉及一種磁性微球的製備方法及磁性微球固定化酵母的方法。本發明採用懸浮乳液聚合法製備殼聚糖磁性微球。本發明通過溶脹-吸附法將酵母細胞固定到磁性微球上。本發明殼聚糖磁性微球兼具磁性粒子和高分子材料的雙重特性。固定化酵母細胞不隨發酵液排出系統，避免了消耗，保持了發酵罐中酵母細胞濃度，提升了酒精發酵速度，縮短了發酵時間，減少了資源消耗量，並同時降低了廢水的排放量和廢水處理的難度。
文檔編號C08J3/12GK101240075SQ20081006407
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月7日 優先權日2008年3月7日
發明者馮玉傑, 健 王, 言 田 申請人:哈爾濱工業大學