一株誘導花生抗根結線蟲病的寡氧單胞菌屬細菌的製作方法

2023-05-16 15:33:56

本發明屬於微生物農藥
技術領域：
，具體涉及一株誘導花生抗北方根結線蟲病的細菌嗜根寡氧單胞菌。
背景技術：
：：根結線蟲可對114科3000餘種寄主植物造成危害，因此尋找高效環保的方法來防治根結線蟲病害已經迫在眉睫。花生是我國主要的油料作物和經濟作物，常年種植面積5000萬畝左右。花生根結線蟲病是花生生產上的毀滅性病害之一，在我國大部分花生主產區均有發生，從發現至今一直是制約花生產量持續增加的重要限制因素，受害花生一般減產20％-30％，重者達70％-80％，甚至絕產(董煒博，石延茂，C.C.Holbrook.溫室快速鑑定花生根結線蟲抗性新方法[J].花生學報，2005，(3)：5～8)。報導危害花生的根結線蟲種類主要有3種，即花生根結線蟲(Meloidogynearenaria)、北方根結線蟲(M.hapla)和爪哇根結線蟲(M.javanica)。花生根結線蟲和爪哇根結線蟲主要在溫暖地區造成危害，北方根結線蟲主要在冷涼地區造成危害。目前以花生根結線蟲和北方根結線蟲兩個種危害嚴重(程雲，張紹升，福建農林大學，植物病理學，花生線蟲種類鑑定與危害性調查，2008，pp7-8)。但是相關的防治措施卻很少，特別是近年來隨著神農丹、呋喃丹等高毒高殘留化學農藥的禁用和限制使用，使得尋找對花生根結線蟲病有效的且環境友好型的防治方法迫在眉睫。寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)是一個新命名的菌屬，屬於嚴格的非發酵型好氧革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布於水、士壤、植物根系、農副產品、人和動物的體表與消化道中。過去對該菌的研究表明，該菌屬可降解苯、甲苯、乙苯、苯胺，對農藥硫丹、噻吩磺隆、阿維菌素、殺螟硫磷、辛硫磷、倍硫磷、三唑磷、毒死蜱等有機磷農藥都有較好的降解效果，其中很多降解途徑涉及單加氧酶的羥基化反應，有些菌株被用於生物轉化(王昀璐，花日茂，唐欣昀，寡養單胞菌在環境保護中的應用研究進展，安徽農業科學，2010，38(28)：15796-15797)。寡氧單胞菌作為內生細菌還被報導可以對人參黑斑病、人參疫病菌和人參鏽腐病菌的生長起到抑制作用，同時提高人參的出苗率和成活率(劉敏，丁萬隆，高原，cg15菌株的鑑定及其對人參病害的防治效果，中國中藥雜誌，2014，第39卷，第24期，pp4754-4758)。通過分析土壤中食物細菌、線蟲和捕食線蟲真菌三者之間的動態關係發現，寡氧單胞菌可以產生尿素，促使捕食線蟲真菌捕食器顯著增多，殺死線蟲(王蕊，細菌調控捕食線蟲真菌捕殺線蟲的分子機制，雲南大學，2015)。但該菌對於處理植物種子產生誘導抗性防禦病害報導的很少，而對於利用嗜根寡氧單胞菌處理花生種子誘導花生植株根系產生抗植物線蟲的研究和發明均未見報導。如何利用菌株的代謝物誘導植物產生抗性，激發植物的免疫系統，是本發明關注的關鍵。同時，該菌株還具有增加發芽率和促進植株生長的作用。經過該菌株處理，北方根結線蟲卵囊的孵化率明顯降低，二齡幼蟲死亡率升高。經試驗證明，該菌株不會對植物產生毒害作用，作為生物種衣劑防治花生根結線蟲病效果顯著，對環境無汙染，具有良好的商業開發前景。技術實現要素：：本發明的目的是利用該菌或該菌株的代謝產物，可誘導花生在種子萌發和生長期間產生對北方根結線蟲的抗性，將菌株按常規液體發酵培養後，開發出處理花生種了的種子處理劑，經過處理的花生種子可以使花生產生對北方根結線蟲的抗性。本發明篩選到的一株具有誘導抗性的細菌菌株是嗜根寡氧單胞菌StenotrophomonasrhizophilaSneb1777，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：中國.北京.中關村；保藏日期：2015年7月6日；保藏登記入冊的編號：CGMCCNo.11046。StenotrophomonasrhizophilaSneb1777是從大量植物內生細菌菌株中篩選出的一株對北方根結線蟲具有良好誘導抗性的細菌菌株。本發明通過研究發現，從植物中篩選出多株具有誘導花生抗根結線蟲的細菌菌株，其中嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777防效較好，且相對穩定。本發明涉及用於誘導花生產生抗北方根結線蟲抗性的細菌代謝物，其是由本發明的細菌菌株嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777經過常規的液體發酵培養後獲得。本發明的細菌菌株嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777是通過培養皿培養後，再經擴大發酵培養來製備，具體方法如下：培養皿培養培養基配方為YMA培養基：甘露醇：10g，酵母粉：0.80g，K2HPO4：0.25g，KH2PO4：0.25g，MgSO4.7H2O：0.20g，NaCl：0.10g，瓊脂：15.0g，蒸餾水：1000mL，調節pH至6.8-7.0。液體發酵培養液體發酵培養基配方為TY液體培養基：胰蛋白腖：5g，酵母粉：3g，CaCl2.2H2O：0.7g，蒸餾水：1000mL，調節pH至6.8-7.0。將菌種接種到250mL三角瓶(每瓶裝150mL)液體培養基中，發酵溫度為25-28℃，搖床轉速150r·min-1、發酵時間2-3d。液體發酵的菌種可以可以通過大型發酵罐進行規模生產，其產品為發酵液或發酵液的製成品。本發明還涉及一種花生種子處理劑，其包含有效量的本發明所述的嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777本身或其代謝物作為有效活性成分。本發明的嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777或其代謝物具有對花生的誘導活性，可用於花生的種子處理，不僅可促進花生植株和根部的生長，同時對根結線蟲卵囊的形成具有較好的抑制作用，為根結線蟲病的防治提供一個新途徑。具體實施方式：為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。實施例1：嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777的培養首先對嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777菌株進行發酵培養，然後對發酵培養後的代謝產物進行花生誘導活性試驗，確定其對花生的誘導作用。將嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777的菌株接種到試管培養基上，培養基配方為YMA培養基，即成分：甘露醇：10g，酵母粉：0.80g，K2HPO4：0.25g，KH2PO4：0.25g，MgSO4.7H2O：0.20g，NaCl：0.10g，瓊脂：15.0g，蒸餾水：1000mL。28℃培養3d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝150mL)液體培養基中，培養基配方為：胰蛋白腖：5g，酵母粉：3g，CaCl2.2H2O：0.7g，蒸餾水：1000mL，調節pH至6.8-7.0。發酵溫度為25-28℃，搖床轉速150r·min-1、發酵時間2-3d。形成的發酵液或發酵液的製成品可以直接或間接處理花生種子。被處理的花生種子可以減輕由根結線蟲病害所造成的危害。實施例2：嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777發酵產品防治北方根結線蟲溫室盆栽效果試驗為了驗證其誘抗的穩定性，特此進行了5次盆栽重複的防治效果研究。1.試驗製劑按前述液體發酵培養方法製備嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)Sneb1777的發酵液，待備用。2.試驗用花生品種白沙1016，遼寧省農業科學院花生研究所提供。3.種子處理方法將花生種子先用0.1％次升汞溶液表面消毒2min，再用無菌水衝洗5-10次。將製備好的發酵液採用液種1∶70體積比進行種子包衣處理，在陰涼條件下陰燥，備用。4.供試線蟲由北方線蟲研究所保存，將帶有根結的植株通過清洗挑取飽滿成熟的卵囊，放入盛有無菌水的滅菌培養皿中，然後用0.5％Naclo消毒2min，無菌水衝洗5-10次，從中挑取完整且飽滿的卵囊，置入盛有適量無菌水的滅菌培養皿中，將其放入28℃的恆溫箱中培養，3d後將孵化出的二齡幼蟲J2製備成線蟲懸浮液1000條/mL接種到溫室內易感病的花生根部。5.試驗方法將Sneb777的發酵液原液採用液種1∶70體積比進行種子包衣處理，將包衣後晾乾的花生種子播種到盛有無菌土的12×13cm的苗缽中，每盆接種1000條北方根結線蟲。以空白TY液體培養液包衣的花生種了作為對照，在移栽後75d進行調查，將花生植株連根挖出，保持根系完整，調查花生根系根結數和植株生長情況。6.試驗結果使用Sneb1777發酵產品處理的花生，花生根系卵囊數顯著降低，包衣處理後的花生與未處理的花生存在顯著差異根結數明顯低於對照，花生株高、根長、鮮重、乾重與對照處理的花生存在明顯差異，盆栽防效為50.1％。處理株高(cm)根長(cm)乾重(g)鮮重(g)盆栽防效根結數Sneb177729.6±1.65a27.8±7.50a4.03±0.29a12.02±0.84a50.1％55.25±9.11aCK23.6±1.07b18.0±0.84b3.34±0.11b7.87±0.93b111.5±19.28b註：表中數據為平均數±標準誤/差，同列數據後不同字母表示在P＜0.05水平差異顯著(Duncan’s氏新復極差法)。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp