用於預測對白介素-6受體抑制性單克隆抗體藥物治療的響應的基因表達標記的製作方法

2023-05-16 11:17:36 1

專利名稱：用於預測對白介素-6受體抑制性單克隆抗體藥物治療的響應的基因表達標記的製作方法
用於預測對白介素-6受體抑制性單克隆抗體藥物治療的響應的基因表達標記
背景技術：
塔西單抗(Tocilizumab)是已經開發用於治療類風溼關節炎的第一種人源化白介素-6受體(IL-6R)抑制性單克隆抗體。至於其他治療，抗體在患者中表現一定範圍的療效。因此，需要確定更可能對塔西單抗治療陽性響應的那些患者和/或可能對治療不響應的患者。本發明解決了這一需要。發明概述
本發明，部分，基於對藥物治療的陽性治療響應相關的基因表達的變化的發現，所述藥物調節IL-6介導的信號轉導，如抑制轉導的抗IL-6抗體或IL-6R抑制性單克隆抗體如塔西單抗。因此，在一個方面，本發明提供了鑑定可能對塔西單抗治療響應的類風溼關節炎患者；或者鑑定可能對塔西單抗治療不響應的患者的方法；其中所述方法包括鑑定表1、表2或表3中所述基因的表達水平。可以使用各種技術，包括陣列探針組和擴增技術，來鑑定這種基因。然後將標記 基因的表達水平與使用的數據組中所示的表達水平相比較來建立相關性。在進一步的方面，本發明提供了用於預測類風溼關節炎患者對包括施用IL-6R抗體如塔西單抗的治療方案的治療響應的試劑盒。在一些實施方案中，該試劑盒還包括將來自患者的表1、表2或表3中所述的生物標記基因的標記基因表達水平與數據組進行比較的電子設備或計算機軟體。用於評價治療性反應的終點可以是任何類風溼關節炎的症狀，例如，在實施例1中評價的終點。在一些實施方案中,標記基因是表I中所述基因的任一種。在一些實施方案中，標記基因是表I中所述的至少兩種基因。因此，在一些實施方案中，是表I中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一種。在一些實施方案中,標記基因是表2中所述基因的任一種。在一些實施方案中,標記基因是表2中所述的至少兩種基因。因此，在一些實施方案中，是表2中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一種。在一些實施方案中,標記基因是表3中所述基因的任一種。在一些實施方案中,標記基因是表3中所述的至少兩種基因。因此，在一些實施方案中，是表3中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一種。在一些實施方案中，確定生物標記基因的表達水平的步驟包括測定標記基因表達的RNA水平。可以，例如，使用擴增區域反應如qPCR，或者通過使用探針陣列測定表達的RNA的量。例如，可以使用形成核酸陣列的探針組來檢測生物標記基因的表達的RNA。通常通過測定從患者分離的RNA的轉錄的cDNA的水平確定RNA表達水平。可以使用已知探針組來確定RNA表達水平從而定量表達水平。正如本領域中已知的，這種探針組可以包括與感興趣的目標序列雜交的多條探針。或者，可以通過測定由基因編碼的蛋白的表達水平而確定標記基因的表達。
將表達水平與標準對照數據，例如，實施例1和2中產生的表達數據組進行比較。可以通過統計學模型確定標記基因的表達水平的增加或生物標記基因的表達水平的降低，用於確定生物標記基因的表達是否表明患者對IL-6R抗體如塔西單抗的治療的治療響應。在一些情況下，本發明提供了使用統計學模型來確定治療響應的可能性的電子設備或計算機軟體。在一些實施方案中，評價表5中所述基因的表達水平以鑑定可能對IL-6R拮抗劑如塔西單抗的治療響應或不響應的類風溼關節炎患者。在典型的實施方案中，分析C列、D列、E列、F列、G列、H列、I列或J列中2-10、20、30、40、50、60、70、80或90，或所有基因中任何基因以確定治療響應的可能性。發明的詳細描述
如本文所用，「陽性的治療響應」或「治療益處」是指類風溼關節炎的任何症狀的改善和/或發作的延遲。如本文所用，「陰性的治療性響應」是指類風溼關節炎的一種或多種症狀的改善的缺乏。「白介素-6受體(IL-6R)抑制性抗體」是指針對IL-6受體的抗體，其中所述抗體結合IL-6受體並拮抗(即，抑制)IL-6受體活性。這種抗體的一個例子是用於治療類風溼關節炎的塔西單抗，一種人源化的IL-6R單克隆抗體(見,例如,Sato等,Caflcer Res 1993;53:851-6 ;和美國專利號7479543)。在本發明中，「表I中所述基因」是指對應於表I中注釋的探針組的基因。類似地，表2、3或5 「中所述基因」是指對應於各自表中注釋的探針組的基因。對於表1_3，「代表性的公共ID」被列為表I登 錄號。「代表性的公共ID」是代表性序列的登錄號。對於基於共有的探針組，代表性序列是用於構建實施例中使用的探針組中的共有序列的數條序列(序列子蔟)中的僅僅一條，它不直接用於衍生探針序列。在陣列設計期間選擇代表性序列作為與被探針組詢問(interrogate)的轉錄區域最相關的序列。如本領域中所理解的，對於許多基因序列有天然存在的多態性。作為用於本發明的目的自然存在的等位基因變異的基因是由相同基因位點編碼的那些基因。表1、表2或表3中所述的基因的等位基因變異編碼的蛋白通常彼此具有至少95%的胺基酸序列同一性，即，表1、表2或表3中所述的基因的等位基因變體通常編碼的蛋白產物與該表中所示的該基因的登錄號所注釋的核苷酸序列編碼的胺基酸序列具有至少95 %同一性，經常至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %，或更高的同一性。例如，編碼Eph受體B2的基因(基因:EPHB2，代表性登錄號AF025304)的等位基因變體與根據登錄號AF025304獲得的序列編碼的Eph受體b2蛋白通常具有至少95 %同一性，經常至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %或更高。在兩種或更多種核酸或蛋白的上下文中的術語「相同的」或「 100 %同一性」是指作為相同序列的兩種或更多種序列或子序列(subsequences)。當如使用已知序列比較算法，例如使用默認參數的BLAST，或者通過手工比對和目視檢查所測定的在比較窗口或指定區域比較並比對最大對應時，如果兩條序列具有指定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即，在指定區域，或者，當不指定時，在整個序列，70%同一性，任選75%，80%，85%，90%，或95%同一性)，兩條序列是「基本上相同的」或具有特定百分比的同一性。在本發明的上下文中的「基因產物」或「基因表達產物」是指由該基因編碼的RNA或蛋白。在患有類風溼關節炎的患者中的術語「評價生物標記」是指確定表1、表2、表3或表5中所列的基因或該基因的等位基因變體編碼的基因產物的表達水平。典型地，確定RNA表達水平。介紹
本發明，部分，基於特定基因/轉錄本的鑑定，該基因/轉錄本的基因表達水平，在給藥前或給藥後8周，與對塔西單抗的響應相關。因此，本發明涉及在患者接受藥物之前測定生物標記的表達水平。在一些實施方案中，可以在診斷裝置的形式中應用檢測這種轉錄本的探針來預測哪些類風溼關節炎患者將對IL-6受體拮抗劑如IL-6受體拮抗性抗體，例如，塔西單抗，響應或不響應。也可以測定轉錄本以預測哪些RA患者在後面的時間點將對塔西單抗響應。而且，可以使用蛋白/代謝產物和/或相關的轉錄本和相關產物(其通過通路或細胞類型或組織表達與本文的實施例部分中鑑定的轉錄本相聯繫)的鑑定作為用於測定對塔西單抗的響應的額外生物標記。可以測定表1、表2或表3中所述基因之一的任何基因表達產物的表達水平，但是，典型地評價多個基因的表達。可以使用本領域已知的任何數量的方法測定基因表達水平。在典型的實施方案中，該方法涉及測定RNA的水平。可以使用任何方法，例如，採用定量擴增方法如qPCR，定量RNA表達。在其它實施方案中，該方法採用基於陣列的檢測。在其它實施方案中，可以檢測蛋白產物。使用來自患者的全血或外周血淋巴細胞樣品測定基因表達模式。在一些實施方案中，可以定量與表1、表2或表3中所示的生物標記在相同的通路中的基因編碼的基因產物，典型地RNA。在一些實施方案中，用來評價以鑑定作為塔西單抗的治療的候選的類風溼關節炎患者的至少一種生物標記選自JAM3、CD41、CD61和ehrin受體B2。在一些實施方案中，選擇用於評價的至少一種生物標記是JAM3、⑶41、⑶61，評價的第二種生物標記是ephrin受體B2。在一些實施方案中，在患者中評價的生物標記是炎性體(inflammasome)的組分、半胱天冬酶1、半胱天冬酶5、IL_1受體或CARD16。在一些實施方案中，評價的至少一種生物標記是絲氨酸棕櫚醯轉移酶長鏈基亞基2或鞘氨醇-1-磷酸酯(SlP)、神經醯胺或相關的神經鞘脂類。在一些實施方案中，本發明的方法包括分析表5的在C-J列中一列所示的具有高於「0」的值的兩個或更多個生物標記的基因表達產物。可以組合使用這種生物標記來預測類風溼關節炎患者對IL-6R拮抗劑如塔西單抗的治療的響應的可能性。因此，例如，可以組合使用在C列中具有高於「0」的值的至少兩個生物標記，優選三個，四個，五個或最高達100的任何數量的生物標記物的基因表達水平的分析來預測對塔西單抗治療的響應。類似地，可以分析來自D列的具有高於「0」的值的至少兩個生物標記，優選三個，四個，五個或更多個，或全部生物標記的表達水平以鑑定可能對IL-6R拮抗劑如塔西單抗的治療響應或不響應的類風溼關節炎患者。在典型的實施方案中，評價具有更低數量的那些基因的那些表達水平。因此，例如，在C列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的值的基因，例如，通常被包括在基因表達的分析中。在一些實施方案中，本發明的方法包括分析在C列中兩個或更多個基因的表達水平；以及分析在D列中兩個或更多個基因，或在E列中兩個或更多個基因等的表達水平，等等。
在表5中，「ID」列是指對應基因的探針組(表5B)。本領域技術人員理解，可以通過在此分析中使用的晶片的標記的資料庫(Affymetrix)獲得表5B中的探針組注釋和表5A的L列。定量RNA的方法
可以根據本領域已知用於定量RNA的任何方法容易地確定表I中所述的基因編碼的RNA的量。可以使用涉及擴增反應和/或其中探針被連接至固體支持物並用於定量RNA的反應的各種方法。或者，可以將RNA連接至固體支持物並使用針對感興趣的序列的探針定量。從外周血淋巴細胞獲得本發明中分析的「RNA核酸樣品」。「RNA核酸樣品」包括RNA,但不必是純的RNA，例如，DNA也可以存在於樣品中。從外周血淋巴細胞獲得RNA樣品的技術是本領域中公知的。在一些實施方案中，首先逆轉錄目標RNA並定量得到的cDNA。在一些實施方案中，使用RT-PCR或其它定量擴增技術來定量目標RNA。用PCR的cDNA擴增是公知的(見美國專利 4，683，195 和 4，683，202; PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis 等.，eds, 1990))。例如，美國專利號 6，180，349; 6，033，854;和 5，972，602，以及在例如 Gibson 等，Genome Research 6:995-1001 (1996) ; DeGraves 等，Biotechniques34(1):106-10, 112-5 (2003) ; Deiman B,等，Mol Biotechnol.20 (2): 163-79 (2002)中公開了定量擴增的方法。用於測定樣品中感興趣的mRNA水平的其它方法可能涉及其它核酸擴增方法如連接酶鏈式反應(Barany (1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:189-193)、自我維持的序列複製(Guatelli 等.(1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh 等.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177)、Q-β 複製酶(Lizardi 等.(1988) Bio/Technology 6:1197)、滾環複製(美國專利號 5，854，033)或任何其它的核酸擴增方法，隨 後使用本領域技術人員公知的技術檢測擴增的分子。通常，定量擴增基於在擴增(例如，PCR)反應的循環中代表模板的拷貝的信號(例如，探針的螢光)的監測。用於檢測擴增產物的一種方法是5』-3』核酸外切酶「水解」PCR檢測(也被稱為TaqMan 測定)(美國專利號5，210，015和5，487，972 ；Holland等，PNASUSA 88:7276-7280 (1991) ;Lee 等，M/chic Acids Res.21:3761-3766 (1993))。這種測定檢測通過雜交的特定PCR產物的累積以及在擴增反應期間雙標螢光探針("TaqMan 〃探針)的裂解。螢光探針由螢光報告染料和淬滅染料同時標記的寡核苷酸組成。在PCR過程中，若且唯若該探針與被擴增的區段雜交時，該探針被DNA聚合酶的5』 -核酸外切酶活性裂解。探針的裂解產生了報告染料的螢光強度的增加。依靠使用能量傳遞檢測擴增產物的另一種方法是Tyagi和Kramer, Na tureBiotech.14:303-309 (1996)描述的「信標探針」方法，這也是美國專利號5，119,801和5，312，728的主題。該方法採用可以形成髮夾結構的寡核苷酸雜交探針。在雜交探針的一個末端上(5』或3』末端)，有供體突光團,在另一末端上,有受體部分。在Tyagi和Kramer方法的情況下，這種受體部分是淬滅劑，即，受體吸收供體釋放的能量，但然後本身不發螢光。因此，當信標是開放的構象時，供體螢光團的螢光是可檢測的，而當該信標是髮夾(閉合的)構象時，供體螢光團的螢光被淬滅。當用於PCR中時，與PCR產物的鏈之一雜交的分子信標探針是「開放的構象」並且檢測到螢光，而剩下未雜交的那些不會發螢光(Tyagi和Kramer, Nature Biotechnol.14:303-306 (1996))。因此，螢光的量將隨著 PCR 產物的量增加而增加，因此可被用作PCR的進程的量度。本領域技術人員將認識到也可以獲得其它定量擴增方法。用於進行核酸的定量擴增的各種其它技術也是已知的。例如，一些方法採用一條或多條探針寡核苷酸，其結構使得當寡核苷酸與目標核酸雜交時產生螢光的變化。例如，一種這種方法涉及雙螢光團方法，其利用螢光共振能量轉移(FRET)，例如，LightCycler 雜交探針，其中兩條寡核苷酸探針與擴增子退火。設計寡核苷酸以便以頭-尾方向與以容許有效的能量轉移的距離分隔的螢光團雜交。設計為當與核酸結合或摻入延伸產物時釋放信號的結構的標記的寡核苷酸的其它例子包括=Scorpions探針(例如，Whitcombe等，Nature Biotechnology 17:804-807, 1999,和美國專利號 6，326，145)、Sunrise (或Amplifluor )探針(例如，Nazarenko 等，Nuc.Acids Res.25:2516-2521，1997,和美國專利號.6，117，635)以及形成在沒有淬滅劑的情況下信號降低並且當與目標雜交時發射增加的信號的二級結構的探針(例如，Lux probes )。在其它實施方案中，可以使用當嵌入雙鏈DNA時產生信號的嵌入劑(intercalating agents)。示例性的試劑包括SYBR GREEN 和SYBR GOLD 。由於這些試劑不是模板特異性的，假定該信號是基於模板特異性的擴增產生的。可以通過監測作為溫度的函數的信號而驗證這一點，因為模板序列的熔點通常遠高於，例如，引物二聚體等。在其它實施方案中，例如，在斑點印跡或Northern格式中，將mRNA固定在固體表面上，並與探針接觸。在另外的實施方案中，例如，在基因晶片陣列中，將探針固定在固體表面上，並將mRNA與探針接觸。本領域技術人員可以容易地調整已知的mRNA檢測方法用於檢測編碼生物標記或其它感興趣的蛋白的mRNA的水平。在一些實施方案中，採用，例如，微陣列。DNA微陣列提供了用於同時測定大量基因的表達水平的方法。每個陣列由連接於固體支持物的捕獲探針的可再生模式組成。標記的RNA或DNA與陣列上的互補探針雜交，然後通過雷射掃描檢測。測定陣列上的每個探針的雜交強度並轉換為代表相對的基因表達水平的定量值。見，美國專利號6，040, 138,5, 800, 992和6，020, 135,6, 033，860和6，344，316。高密度寡核苷酸陣列尤其可用於測定樣品中大量RNA的基因表達譜。例如，美國專利號5，384，261中描述了使用機械的合成方法用於這些陣列的合成的技術。雖然經常採用平面陣列表面，可以在幾乎任何形狀的一個表面或者甚至多個表面上製造陣列。陣列可以是珠子、凝膠、聚合表面、纖維如光纖、玻璃或任何其它適當的基質上的肽或核酸，見美國專利號 5，770，358,5, 789，162,5, 708，153,6, 040，193 和 5，800，992。陣列可以以允許包括一切的裝置的診斷或其它操作的方式包裝。可以使用公知的技術選擇用於擴增並檢測感興趣的目標序列的引物和探針。在本發明的上下文中，「測定感興趣的RNA的表達水平」包括本領域中已知的任何用於定量感興趣的RNA的方法。蛋白水平的檢測 在一些實施方案中，例如，其中測定表I中所述的生物標記基因編碼的蛋白的表達水平。經常，可以使用免疫檢測進行這種測定。儘管可以使用細胞樣品如外周血淋巴細胞樣品測定蛋白表達水平，但是通常使用血清樣品測定蛋白表達。
適用技術的總體概述可見Harlow & Lane, Antibodies:A Laboratory Manual(1988)和Harlow & Lane, Using Antibodies (1999)。產生與等位基因變體特異性反應的多克隆和單克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的(見，例如，Coligan, CurrentProtocols in Immunology (1991) ; Harlow & Lane, 同上;Goding, MonoclonalAntibodies:Principies and Practice (第二版.1986);和Kohler & Milstein, Nature256:495-497 (1975))。這種技術包括通過從在噬菌體或類似載體中的重組抗體的文庫選擇抗體，以及通過免疫兔或小鼠製備多克隆和單克隆抗體的抗體的製備(見，例如，Huse等.，Science 246:1275-1281 (1989); Ward 等.，Nature 341:544-546 (1989))。可以通過各種免疫測定方法檢測多態性等位基因。對於免疫學和免疫測定方法的綜述，見and Clinical Immunology (Stites & Terr eds.,第 7 版.1991)。而且，可以以萬似7膨 Immunoassay (Maggio, ed., 1980);和 Harlow & Lane,同上中廣泛綜述的任何數種配置進行免疫測定。對於通用免疫測定的綜述，還可見，JfciAoife in CellBiology:Antibodies in Cell Biology,第37卷(Asai, ed.1993) ; Basic and ClinicalImmunology (Stites & Terr, eds.,第 7 版.1991)。常用的測定包括非競爭性測定，例如，夾心測定和競爭性測定。通常，可以使用測定如ELISA測定。可以通過進行定量分析測定多肽變體的量。可以使用其它檢測技術，例如，MALDI，來直接檢測與治療結果相關的蛋白的存在。裝置和試劑盒
在進一步的方面，本發明提供了用於鑑定與類風溼關節炎患者對拮抗IL-6受體信號的治療性藥物如IL-6R抗體，例如，塔西單抗的改善的響應相關的基因表達產物的診斷裝置和試劑盒。在一些實施方案中，診斷裝置包括檢測至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、60、70、或80、或所有的表I中所述基因表達產物的探針。在一些實施方案中，本發明提供了連接於固體支持物如陣列玻片或晶片上的寡核苷酸探針，例如，如DNA MicroarraysiAMolecular Cloning Manual, 2003, Eds.Bowtell 和 Sambrook, Cold Spring HarborLaboratory Press中所述的。這種裝置的構建是本領域中公知的，例如，在美國專利和專利公開美國專利號5，837，832; PCT申請W095/11995;美國專利號.5，807，522;美國專利號.7，157，229，7,083,975，6,444,175，6,375,903，6, 315, 958, 6,295,153，和 5， 143，854， 2007/0037274， 2007/0140906， 2004/0126757， 2004/0110212，2004/0110211, 2003/0143550, 2003/0003032，和 2002/0041420 中所述的。以下參考文獻中也綜述了核酸陣列 dioiecAffoJ Annu Rev 8:85-101 (2002) ; Sosnowski 等，Psychiatr Genet 12 (4):181-92 (Dec.2002); Heller, Annu Rev Biomed Eng 4:129-53(2002) ; Kolchinsky 等,Hum.Mutat 19(4):343-60 (Apr.2002);和 McGail 等,AdvBiochem Eng Biotechnol 77:21-42 (2002)。陣列可以由大量固定至固體支持物上的獨特的、單鏈多核苷酸，通常是合成的反義多核苷酸或cDNA的片段組成。典型的多核苷酸優選長度為約6-60個核苷酸,更優選長度為約15-30個核苷酸，最優選長度為約18-25個核 苷酸。對於某些類型的陣列或其它檢測試劑盒/系統，可以優選使用長度僅為約7-20個核苷酸的寡核苷酸。在其它類型的陣列中，如結合化學發光檢測技術使用的陣列中，優選的探針長度可以是，例如，長度為約15-80個核苷酸，優選長度為約50-70個核苷酸,更優選長度為約55-65個核苷酸,最優選長度為約60個核苷酸。本領域技術人員將認識到，基於已知的序列信息，可以開發檢測試劑並用於測定表1、表2和表3中所述的任何基因表達產物，可以將這種檢測試劑併入試劑盒。在生物標記檢測試劑的上下文中的如本文所用的術語「試劑盒」意在是指這種物質如多種生物標記檢測試劑的組合，或一種或多種生物標記檢測試劑組合一種或多種其它類型的元件或組分(例如，其它類型的生化試劑、容器、包裝，如用於商業銷售的包裝，生物標記檢測試劑連接的基質，電子硬體組分，等)。因此，本發明進一步提供了生物標記檢測試劑盒和系統，包括但不限於，包裝的探針和引物組(例如，TaqMan探針/引物組)、核酸分子的陣列/微陣列，其中所述陣列/微陣列包括檢測生物標記轉錄本的水平的探針和包含用於檢測本發明的一種或多種生物標記的一種或多種探針、引物或其它檢測試劑的珠子。試劑盒可以任選地包括各種電子硬體組分；例如，由各種製造商提供的陣列(「DNA晶片」)和微流體系統(「晶片上的實驗室(lab-on-a-chip)」系統)，通常包括硬體組分。其它試劑盒(例如，探針/引物組)可能不包括電子硬體組分，但是可以由，例如，一個或多個容器中包裝的一種或多種生物標記檢測試劑(連同，任選的，其它生化試劑)組成。在一些實施方案中，生物標記檢測試劑盒典型地包含對於實施測定或反應如用於檢測生物標記轉錄本的水平的擴增所必需的一種或多種檢測試劑和其它組分(例如，緩衝液、酶，如DNA聚合酶)。試劑盒還可以包含用於測定目標核酸的量的裝置，和用於比較所述量與標準的裝置，並且可以包括用於使用試劑盒以檢測感興趣的生物標記核酸分子的說明書。在本發明的一個實施方案中，提供了試劑盒，該試劑盒包含實施檢測本文公開的一種或多種生物標記物的一種或多種測定所必需的試劑。在本發明的一個實施方案中，生物標記檢測試劑盒/系統的形式為核酸陣列或區室化的試劑盒，包括微流體/晶片上的實驗室(lab-on-a-chip)系統。

生物標記檢測試劑盒/系統可以包含，例如，與表1、表2或表3中所述基因編碼的核酸分子雜交的一種或多種探針或探針的對或組。在一些實施方案中，可以在一次測定中同時評價多於一種生物標記物的存在。例如，在一些實施方案中，將針對不同生物標記的探針或探針組固定為陣列或固定在珠子上。例如，相同的基質可以包含用於檢測至少1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、15、或20、或更多的表1、表2或表3中所述生物標記的生物標記探針。使用這種陣列或其它試劑盒/系統，本發明提供了在測試樣品中鑑定本文所述生物標記的方法。這種方法典型地涉及將從患者的外周血淋巴細胞獲得的核酸試驗樣品以及包含與表1、表2或表3中所述基因編碼的核酸選擇性雜交的一種或多種探針孵育。將生物標記檢測試劑(或採用一種或多種這種生物標記檢測試劑的試劑盒/系統)與測試樣品孵育的條件可以變化。孵育條件取決於這些因素，如測定中採用的格式，採用的檢測方法和測定中使用的檢測試劑的類型和性質。本領域技術人員將認識到，可以容易地調整常用的雜交、擴增和陣列測定格式中任一項以檢測表1、表2和表3中所述生物標記。本發明的生物標記檢測試劑盒可以包括用於從測試樣品製備核酸以用於隨後的生物標記核酸分子的擴增和/或檢測的組分。基因表達水平與治療響應的關聯
本發明提供了確定基因表達產物的水平來評價類風溼關節炎患者將對IL-6R拮抗劑如塔西單抗的治療的響應的可能性的方法。可以分析女性或男性類風溼關節炎患者的基因表達水平。與治療效果的改善相關的某些標記，例如，表I中基線表達標記的存在，表明預期表現出對IL-6R抗體如塔西單抗的治療的陽性治療響應的患者。典型地，陽性治療響應的可能性隨著基因表達標記的量的增加而增加。類似地，患者可能具有與陰性治療效果相關的基因表達標記，例如，表I中所述標記的基線表達。因此，這種患者不可能對IL-6R抗體，例如，塔西單抗，響應。典型地，陰性治療響應的可能性隨著生物標記的量的增加而增加。在表1、2和3中，「係數(co-efficient) 」列代表通過DAS28評分的變化測定的基因表達值對響應的作用，所述DAS28評分對於基線DAS進行調整(表3中的數據也對於基線血小板(platelet)數進行調整)。係數的符號代表作用的方向。例如，_1.6的係數意味著更高的表達與更好的響應相關。基因表達值的每2倍增加對應DAS評分進一步減少1.6單位。同樣，正係數表明更高的表達與更差的響應相關(更高的DAS28評分)。表I顯示某種生物標記，其中生物標記的基線表達(即，在經歷IL-6R抗體如塔西單抗的治療之前的水平)預測治療響應。因此，例如，可以在從類風溼關節炎患者獲得的外周血樣品中測定表I中所述基因編碼的基因表達產物的水平。用基因表達水平的閾值定義生物標記陽性/陰性組。可以使用本領域中公知的算法確定每個標記的準確閾值，該閾值取決於使用的特定平臺和檢測以及檢測的期望的性能參數，例如，靈敏度、特異性。例如，如果表I中的生物標記的表達水平高於(預測表現出陽性治療響應)或低於(預測不表現出陽性治療響應)閾值，確定患者可能對IL-6拮抗劑，例如，塔西單抗，表現出治療響應或不表現出治療響應。表2中所述基因的表達水平的測定還提供測定在後來的時間點患者對IL-6-R拮抗劑，例如，IL-6R抗體如塔西單抗的治療響應的可能性的能力。例如，在基線和，例如，在治療後8周時進行表2中所述基因的表達的測定。使用兩個測定值之間的基因表達的變化來計算在後面的時間點如16或24周時響應的可能性。這裡再次，可以應用響應的變化的閾值。
或者，可以在治療開始後，例如，在第8周時，進行測定，可以使用觀察的基因表達水平針對預定值「均一化」結果作出響應預測。也可以評價表5中列出基因的基因表達。表5的A-J列中每一列代表對於列標題註明的臨床響應分析的基因。對於具有>0等級的ACR的前100個基因列於表中。如果該值是0，對於ACR不選擇該基因。對於每列，可以分析具有〉0值的指明的至少兩個，通常大部分或所有基因。為了預測說明書中實施例部分中概述的涉及表5的「類型指數」的臨床響應的分類，使用作為來自多個基因的表達信號的線性組合的基因表達值。通過本領域已知的分類算法如支持向量機(SVM)(見,例如，Vapnik, The Nature of StatisticalLearning, Springer, NY, 1995; Cristianini & Shawe-Taylor, An Introduction toSupport Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000.)來石角定這些基因表達水平的線性組合的截止值。本發明的方法通常涉及在用IL-6R抗體如塔西單抗治療的類風溼關節炎患者中記錄與有益的治療結果或陰性的治療結果相關的基因表達產物的水平。可以以計算機可讀的形式保存此信息。這種計算機系統通常包括主要子系統如中央處理器、系統存儲器(通常是RAM)、輸入/輸出(I/O)控制器，外部設備如經由顯示適配器的顯示屏幕、串行埠、鍵盤、經由存儲接口的固定磁碟驅動器和可操作以接收軟盤的軟盤驅動器和可操作以接收CD-ROM的CD-ROM(或DVD-ROM)設備。可以連接許多其它設備如經由串行埠連接的網絡接口。也可以將計算機系統連接至網絡，該計算機系統包括經由數據連結如乙太網電纜(同軸電纜或IOBaseT)、電話線路、ISDN線路、無線網絡、光纖或其它合適的信號傳輸介質連結的多個計算設備，藉此至少一種網絡設備(例如，計算機、磁碟陣列等)包括由編碼從本發明的測定獲得的數據的比特模式構成的磁場域(例如，磁碟)和/或電荷域(例如，DRAM單元格的陣列)的模式。計算機系統可以包括用於解釋評價表I中註明的基因編碼的一種或多種基因表達產物的基線水平的表達分析的結果的代碼。因此，在示例性實施方案中，將表達分析結果提供至計算機，其中中央處理機執行電腦程式用於確定對於IL-6受體抗體的治療的治療響應的傾向。本發明還提供了計算機系統如上面所述的計算機系統的用途，其包括:(1)計算機(2)編碼通過本發 明的方法獲得的表達結果的存儲的比特模式，其可以被存儲在計算機中；(3)，和，任選地，(4)用於確定陽性的治療響應的可能性的程序。 本發明進一步提供了基於患有類風溼關節炎的患者中基因表達廣物的檢測廣生報告的方法。這種報告基於與陽性的或陰性的治療結果相關的表I中所述基因編碼的基因表達產物的檢測。具有對IL-6R抗體的治療陽性的治療響應的增加的可能性的患者具有至少一種與陽性的治療響應相關的在表I中的基因表達產物。通常，這種患者具有表達模式，其中確定表I中所述基因編碼的至少兩種產物。在一些實施方案中，可以評價患者的表I中所述的3、4、5、6、7、8、9、或10個或更多的基因編碼的產物的表達水平。
實施例實施例1.塔西單抗治療的類風溼關節炎患者的基因表達譜的分析。用於與對DAS28評分的變化的響應的關聯性的基因表達數據的分析。在基線和在給藥後第8周時收集從在AMBITION研究(Jones,等.，Ann Rheum Dis
269:88-96, 2010)中用作為單一治療的8 mg/Kg塔西單抗給藥的患有活躍RA的患者收集的 RNA 樣品。通過使用 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array, 209份樣品(113份基線樣品和96份「第8周」樣品)進行基因表達譜分析。在基因表達數據的許多質量控制步驟後，強調具有更低質量的2份樣品，207份樣品進行進一步分析。使用Affymetrix RMA算法以產生均一化的基因表達數據用於進一步分析。僅僅包括具有高表達水平(最大值〉4)的探針組和具有更大動態範圍(最大值-最小值>2)的那些。對所有樣本採集最大值和最小值。進行線性回歸用於後續分析。在所有分析中，使用在第16周時(CDAS28)疾病活動評分28 (Disease Activity Score 28，DAS28)的變化作為響應終點。選擇第16周，因為它是在大多數塔西單抗臨床試驗中對於逃避治療的最早時間點)。在所有分析中使用基線DAS作為協變量，因為它對於cDAS有重要影響。1.基線基因表達比CDAS28。在分析中包括111位受試者。2.以LASSO變量選擇(LASSO Variable Selection)用基線表達數據的線性回歸。這是多變量分析方法，該方法包括模型中的所有探針組，將對探針組的係數的 LI 罰分加入目標函數。(Tibshirani, R.(1996).J.Royal.Statist.Soc B.,Vol.58(1):267-288))。通過模型選擇探針組的亞組。通過模型選擇的探針組的數量取決於罰分的水平。使用10倍交叉驗證確定罰分的最佳水平，其隨後確定選擇用來獲得最佳預測的探針組的最佳數量。3.在第8周時基因表達比CDAS28的變化。在分析中包括94位受試者。4.以LASSO變量選擇用基因表達的變化的線性回歸。5.基線基因表達比CDAS28，對於基線血小板(platelet)進行調整。分析(I)鑑定了一些代表激活血小板(platelet)表達的基因的探針組，例如ITGA2B (⑶41)、ITGB3(⑶61)、JAM3存在於根據p_值排序的數據的列表的頂部(見表I)。這些基因的表達與CDAS28存在相關性。該觀察結果促使了基線血小板(platelet)數對DAS28中變化的回歸分析。分析表明了與基線血小板(platelet)數的適度但統計學顯著的聯繫。通過ITGA2B、ITGB3、JAM3與CDAS28的相關性表明了強得多的作用大小，表明血小板(platelet)激活的標記是比單獨的血小板(platelet)計數更好的響應 的預測。根據分析⑴確定，EPHB2 (Ephrin受體B2)的基線表達水平具有與cDAS28的關聯性。EPHB2轉導調節細胞粘附和遷移的信號，其在RA中的滑膜成纖維細胞和滲出物淋巴細胞中以比來自OA的那些更高的水平表達。其配體，EphrinBl，在RA外周血淋巴細胞(PBL)中以比健康對照更高的水平表達。重組EphrinBl刺激正常PBL表現出增強的遷移和TNF產生並刺激RA滑膜細胞產生IL-6。這些結果表明，它對於預測對塔西單抗的響應也是有用的生物標記。我們推理，在分析(I)中觀察的血小板(platelet)表達的基因與cDAS的高相關性可以「掩蔽」其它重要的響應信號的鑑定。因此，進行回歸模型中的血小板(platelet)數量的基線校正。根據該分析，鑑定了以P-值排序的NALPl炎性體的4種組分中的3種。炎性體是介導促炎性半胱天冬酶的激活的多蛋白胞質複合物。NALPl炎性體激活半胱天冬酶I和半胱天冬酶5。半胱天冬酶I將前-1L-1 β切割IL-Ιβ，還激活IL-18和可能的IL-33。我們還鑑定了 CARD16，一種半胱天冬酶I的負調節因子的基線表達和IL-1受體的基線表達與cDAS的相關性。也可以將IL1B/IL-18/IL-33的血清水平和上面鑑定的轉錄本的基因表達信號作為預測對塔西單抗的響應的生物標記。根據分析(3)，已經通過來自塔西單抗施用的8周基因表達的變化鑑定了可以用於預測響應的多種轉錄本。(表2)。這些包括半胱天冬酶1，與IL-1 β / IL-18/IL-33通路的聯繫(見上面(4))，絲氨酸棕櫚醯轉移酶，長鏈基地亞基2，與分子如神經醯胺和鞘氨醇-1-磷酸酯(SlP)的重新神經鞘脂合成的聯繫，和血小板(platelet)表達的基因，如CD41，CD61 和 JAM3。Lasso變量選擇多變量方法(分析2和4)允許為響應的預測各自貢獻不同的『組分』的轉錄本的鑑定。通過10倍交叉驗證確定探針組的最佳數量(分別為n=12和n=13)。該分析鑑定了可以被用作預測性生物標記的一些基因。這些分析鑑定的探針組/基因的列表如表I中所示。表I cDAS比bExp包含了探針組/基因，其基線表達可以預測塔西單抗治療的響應。該列表由95個探針組組成，其中12個沒有繪製，將剩餘的探針組繪製至72個獨特的基因符號。在探針組中，通過單變量線性回歸(分析I)鑑定了 88個，使用多變量LASSO分析(分析2)鑑定了 12個，用兩種分析同時鑑定了 5個探針組。表2 cDAS比cEXP(cDASvs.cEXP)包含了從基線到第8周探針組/基因表達的變化，其可以預測塔西單抗治療的響應。該列表由104個探針組組成，其中6個沒有繪製，將剩餘的繪製至92個獨特的基因符號。在探針組中，通過單變量線性回歸(分析3)鑑定了97個，使用多變量LASSO分析(分析4)鑑定了 13個，用兩種分析同時鑑定了 6個探針組。表3(對於血小板進行調整的 cDAS 比 bEXP(cDASvs.bEXP.AdjustforPlatelet))包含了探針組/基因，其基線表達，結合基線血小板(platelet)計數，可以預測塔西單抗治療的響應。該列表由81個探針組組成，其中10個沒有繪製，將剩餘的繪製至61個獨特的基因符號。通過單變量線性回歸分析(分析5)鑑定所有探針組。單變量地或在多變量模型中組合地使用所有生物標記。實施例2具有對塔西單抗的極端響應的預測倌.的探針組的組的鑑定
還進行了分析以鑑定具有對塔西單抗的極端響應(即ACR響應和EULAR響應)的預測值的探針組的組。從塔西單抗治療的患者產生209份CEL文件(Affymetrix表達數據文件)。由於技術原因從數據組排除兩份CEL文件。剩餘的207份CEL文件中的111份是用於基線的樣品。將本實施例聚焦在數據組Nlll。

我們考慮了四種類型的美國風溼病學會(ACR)反應，如表4中所示。表4
^ij1iilACB20RCR50|AC^
_1...........................石一g............................Q
g 1 O O:
3 I " 1 O*.....1f...........................1t..................τ.......1t我們還考慮了在第16周時的3種類型的歐洲抗風溼聯盟(EULAR)響應(第I種無響應，第2種中度的，第3種良好的響應)。還評價了最初的DAS28和在第16周時DAS28的變化(「dDAS28」或「CDAS28」)以及在第16周時DAS28。在DAS28中有一個丟失的數據點，因此，我們具有在第16周時的DAS28和CDAS28的數據組N110。對於在第16周時的DAS28，我們將Cl定義為DAS28值x >= 4 (未響應的)的類型，將C2定義為具有2.6-4的範圍內的X的類型，將C3定義為X < 2.6(良好的響應)的類型。對於ADAS28，我們將Cl定義為ADAS28值y 3.6 (良好的響應)的類型。在所有上述類型分配中，Cl代表響應較差的組，C4 (ACR)或C3 (其它指標)為良好的響應。C2 (或對於ACR的C2和C3)是中度響應的類型。探針組選擇的方法
對於每個指標(ACR、EULAR、Δ DAS28和在第16周時的DAS28)，我們使用Dn3表達信號(見Liu等，J.Theortical Biol 243:273-278，2006;和正在申請的美國專利申請12/578,417)和兩種不同的分組方式。一種分組是較差的響應類型比其它(良好和中度的響應類型)。其它分組是只使用極端類型(較差的響應類型比良好的響應類型)。之前給出對於第一種分組方法的樣本大小，Nlll或N110。對於極端類型的分組的樣本大小是N62(ACR)、N45 (EULAR)、N70 (在第 16 周時的 DAS28)和 N80 ( A DAS28)。Dn3信號(用完美匹配與不匹配強度的差異改善MAS5)對於分類結果是典型地強健的。為了完整性，我們還包括了用Pn3信號選擇的探針組(僅使用完美的匹配強度，在某種意義上與RMA相似)。對於每種分組方法，我們計算了 t_統計量的絕對值並選擇具有最高的t_統計量的絕對值的前100個探針組。對於4種不同的指標、2種不同的信號和2種不同的分組方法(共8組)的它們的集合包含628個探針組，如表5中所列。(對於「4種不同的指標的集合，4種不同的指標(或4種不同類型的響應)是ACR、EULAR、DAS和cDAS。集合是在不計算重複的探針組的情況下所有探針組的組合。例如，如果組I是{1，3，5，7，9}，組2是{1，2，3，4}，組 3 是{3，5}，組 4 是{9，10，11}，則這 4 組的集合是{1，2，3，4，5，7，9，10，11})。表5說明
在表5中，第一列「附:54630」列出了在邪-仍33 Plus 2.0微陣列上在針對人基因的54630個探針組的列表中的基於I的指數(1-based indices)。第二列「ID」列出了Affymetrix 探針組 ID。接下來8列提供了 8組探針組的等級和探針組是否在特定組中選擇的信息。列名是指標名稱，樣本大小和信號(Dn3)。值0意味著在特定組中沒有選擇探針組。1-100的值給出了選擇的探針組的等級，其中I為最高(最顯著的)的一個。列「平均評分」 提供了對於前面8列的概要的評分。值0對評分沒有貢獻(即評分為O)。對於所有其它值(1-100)，我們計算(101-值)(所以差異在1-100的範圍中，但是以相反的順序，最大的差異，100，對應最顯著的等級I)。我們計算了 8列的平均評分，並在列中列出了所有平均評分。通常，評分越高，探針組對於所有組越顯著。列「基因符號」和「基因名稱」提供了來自Affymetrix網站對選擇的探針組的注釋。為了如0080-0084行中「類型指數」的描述中所述預測臨床反應，對於表5，可以使用表5的C-J列中鑑定的每組基因來形成來自多個基因的表達信號的一種或多種線性組合。通過分類算法如支持向量機(SVM, The Nature of Statistical Learning,Springer, NY, 1995; Cristianini 和 Shawe-Taylor, An Introduction to SupportVector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000)來確定這些基因表達水平的線性組合的截止值。對於表5，每個指標顯示一個數，可以使用(在相同列內)具有大於0的數的至少兩個基因的表達。下面的實施例3和4提供了如何使用兩個和三個基因轉錄本來預測對IL-6R拮抗劑如IL-6R抗體，例如塔西單抗的治療的患者響應。正如本領域中理解的，也可以採用多變量模型，該模型涉及本文鑑定的額外的基因，例如，對應於表1、表2或表3中所述的那些的探針組。實施例3.組合3個探針組用於預測響應水平使用Affymetrix人基因組U133 plus v2陣列測定患者基線血液樣品中的基因轉錄本。原始數據文件針對來自一組衍生算法的參照樣品的數據進行均一化。在本實施例中，對於在三個探針組12345_at，12346_at和12347_at (表示為el，e2和e3)，提取在基因轉錄本水平的表達(RMA型數據)，並在線性模型中使用以得到第24周離基線DAS28評分的變化(cDAS)，如果患者接受與氨甲喋呤(MTX)組合的8mg/kg塔西單抗(TCZ)的治療。對於TCZ 治療:cDAS = a0 * DAS_ 基線 + al * el + a2 * e2 + a3 * e3 取決於基線DAS和el，e2和e3的基因表達值，患者DAS的預測的平均變化將為I至_7。
如果患者接受單獨的MTX治療，DAS的預測的平均變化表示如下:
對於MTX治療:cDAS = b0 * DAS_基線
僅僅取決於患者基線DAS，DAS的預測的平均變化將為O至-3。然後，基於這些預測的差異，為每位患者作出治療選擇。例如，如果患者A對塔西單抗具有-4.5以及對MTX具有-2的預測的DAS變化，醫生可能推薦TCZ治療。患者B對TCZ具有-3以及對MTX具有-2.5的預測的DAS變化，醫生可能推薦MTX治療，因為小的額外的治療效果可能不值得額外成本和潛在風險。實施例4.組合兩個轉錄本以預測患者對治療的響應
使用定量PCR(qPCR)測定患者基線血液樣品中的表達水平。通過ACT表示相對表達水平。如下定義生物標記組:
陽性:al*ACTl + a2*ACT2 >= 2.1 陰性:al*ACTl + a2*ACT2〈 2.I。在塔西單抗治療下，與生物標記陰性患者相比，生物標記陽性患者可能具有更好的響應，(55%比38%的ACR50響應率)，而當氨甲喋呤治療時，兩組都具有相似的響應率與，ACR50響應率為35%。應當理解，此處描述的實施例和 實施方式只是用於說明性目的，而且根據其的各種修飾或變化將被暗示給本領域技術人員，並包括在本申請的精神和範圍以及所附的權利要求的範圍內。
權利要求
1.鑑定作為用人白介素-6受體抗體治療的候選的類風溼關節炎患者或者應當從治療中排除的類風溼關節炎患者的方法，所述方法包括: 提供從患者的外周血淋巴細胞獲得的RNA核酸樣品； 確定表1、表2或表3中所述基因編碼的至少一種基因產物的表達水平，所述基因與對IL-6受體抗體治療的治療響應相關；其中，當所述水平超過閾值時，生物標記的水平表明患者是用人白介素-6受體抗體治療的候選；或者患者應當從治療中排除。
2.權利要求1的方法，其中所述方法包括檢測表1、表2或表3中所述基因中的至少兩個、三個、四個、五個、六 個、七個、八個、九個、十個、二十個、三十個、四十個或更多個編碼的基因產物的表達水平。
3.權利要求1的方法，其中所述確定表達水平的步驟包括擴增反應。
4.權利要求3的方法，其中所述擴增反應是定量RT-PCR。
5.權利要求1的方法，進一步包括記錄SNP的存在與對IL-6受體抗體的治療陽性響應的相關性。
6.權利要求5的方法，進一步包括將IL-6受體抗體施用於患者。
7.鑑定作為用人白介素-6受體抗體治療的候選的類風溼關節炎患者或者應當從治療中排除的患者的方法，所述方法包括: 提供來自患者的血液樣品或來自外周血淋巴細胞的包含蛋白的樣品； 確定表1、表2或表3中所述基因編碼的至少一種基因產物的表達水平，所述基因與對IL-6受體抗體治療的治療響應相關。
8.診斷裝置，包括用於檢測表1、表2或表3中所述的兩個或更多個生物標記的RNA表達水平的連接至固體表面的兩個或更多個核酸探針。
9.權利要求8的診斷裝置，其中所述裝置包括用於檢測表1、表2或表3中所述生物標記中的至少三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、二十個、三十個、四十個或更多個的RNA表達水平的探針。
10.鑑定作為用人白介素-6受體抗體治療的候選的類風溼關節炎患者或者應當從治療中排除的類風溼關節炎患者的方法，所述方法包括: 提供從患者的外周血淋巴細胞獲得的RNA核酸樣品； 確定表5的C列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的D列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的E列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的F列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的G列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的H列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的I列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平，或表5的J列中具有> 0的值的至少兩種基因產物的表達水平； 其中超過閾值的至少兩種基因產物的表達水平的線性組合表明患者是用人白介素-6受體抗體治療的候選；或者患者應當從治療中排除。
全文摘要
本發明提供了關於基因產物生物標記的方法、組合物和試劑盒，所述生物標記的基因表達水平與類風溼關節炎患者對IL-6受體拮抗劑如IL6抗體的治療的治療響應相關。可以使用本發明的方法、組合物和試劑盒來鑑定可能或不可能對IL-6受體拮抗劑治療響應的類風溼關節炎患者。
文檔編號G01N33/50GK103119176SQ201180027953
公開日2013年5月22日 申請日期2011年6月6日 優先權日2010年6月7日
發明者A.普拉特, J.王, G.雷, L.埃西歐克斯, W-m.劉, M.威廉斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司