新的蘇雲金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白質的製作方法

2023-05-16 11:12:51

專利名稱：新的蘇雲金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物害蟲控制，特別是昆蟲控制領域。提供了來源於蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株的新的核酸序列，其編碼營養生長階段表達的殺昆蟲蛋白質。具體地，提供了編碼命名為ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J的蛋白質的DNA序列，其可用於保護植物免受昆蟲損害。進一步提供了包含至少一個新的核酸分子的植物和微生物，及利用這些核酸序列降低植物受到的昆蟲損害的方法和手段。
背景技術：
昆蟲害蟲使全世界農作物生產遭受著巨大經濟損失，並且農民每年都面臨由於蟲害造成的產量損失威脅。農作物中的昆蟲抗性基因工程已經成為降低農作物管理和化學控制實踐的相關花費的具有吸引力的方法。基於在植物中表達從革蘭氏陽性土壤細菌蘇雲金芽孢桿菌(Bt)分離的蛋白質，自1996年以來，第一代昆蟲抗性農作物已經投放市場。該殺昆蟲Bt Cry蛋白質在Bt菌株的孢子形成階段產生，並且該蛋白質在細菌中以大的胞質晶體積累。當被昆蟲攝取時，典型的鱗翅目(Lepidopteran)毒性Bt Cry蛋白質在昆蟲中腸中溶解和加工成為約60到65kDa的活性形式。此活性蛋白質通過結合中腸上皮細胞發揮它的毒性作用，在細胞膜中引起穿孔，這引起細胞滲透裂解。
Bt菌株可以產生許多不同的毒素。自從1981年第一個編碼殺昆蟲晶體蛋白質的Bt基因分離以來(Schnepf和Whiteley 1981)，已經克隆了100多種Bt Cry毒素編碼基因，並且通過在農業重要作物物種中表達Bt來源的蛋白質已經有效地控制了昆蟲害蟲。然而，因為大多數Bt蛋白質主要僅僅對相對小數量的現存昆蟲害蟲有活性，所以單獨Bt蛋白質的應用常常是有限的。據認為，多種因素諸如昆蟲腸道中毒素的激活(Haider等，1996)和其結合特異性受體的能力(Hofmann等，1988)決定Bt Cry蛋白質的特異性。
現普遍認識到存在敏感昆蟲物種可能發展出對Bt Cry毒性的抗性的風險。因此，已經進行了積極的努力以鑑定新的殺昆蟲蛋白質。曾經採用的一個策略是在營養生長階段，而不是在孢子形成階段篩選產生殺昆蟲蛋白質的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。利用這個方法，已經鑑定了大量「營養期殺昆蟲蛋白質」或「VIP」。
Estruch等(1996)、WO94/21795、WO96/10083、WO98/44137、US5,877,012、US 6,107,279、US 6,137,033和US 6,291,156描述了從Bt菌株AB88、AB424和AB51上清液中分離vip3A(a)，vip3A(b)和vip3A(c)。根據作者所述，這些基因編碼具有針對廣譜鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲害蟲的殺昆蟲活性的蛋白質。
WO98/18932和WO99/57282描述了從Bt菌株分離的大量核苷酸序列。這些序列稱為mis(mis-1到mis-8)，war和sup。根據作者所述，編碼的蛋白質具有抗鱗翅目(Lepidopteran)或鞘翅目(Coleopteran)害蟲的活性。
WO00/09697描述了可從側孢芽孢桿菌(Bacillus Laterosporus)菌株獲得的熱不穩定性可溶MIS型和WAR型毒素，以及較小的(1到10kDa)毒素，根據作者所述，這些毒素具有抗玉米根葉甲幼蟲的活性。
WO98/00546和US6,274,721描述了Bt菌株和Bt毒素的分離，根據作者所述，其具有抗鱗翅目(Lepidopteran)害蟲的活性。
WO99/33991描述了Bt菌株和Bt毒素的分離，根據作者所述，其具有抗鱗翅目(Lepidopteran)害蟲的活性。
最近，Selvapandiyan等(2001)描述了編碼命名為VIP-S的蛋白質的基因的分離。根據作者所述，VIP-S蛋白質顯示了抗多種鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲物種的毒性。
Doss等(2002)描述了來源於菌株Bt kurstaki的VIP3V的克隆。
WO02/078437描述了來源於Bt的VIP3毒素，諸如VIP3A，VIP3B和VIP3A-B雜交毒素。
儘管到目前為止，已經分離和表徵了相對大量的不同殺昆蟲蛋白質，但是還需要鑑定、分離和表徵新的殺昆蟲蛋白質。該原因是多方面的。首先，由於殺昆蟲蛋白質對特定靶害蟲群體(宿主昆蟲譜)的特異性，因此需要克隆編碼具有不同活性譜的蛋白質的基因，以便對於不同的農作物和不同的地理區域，可得到與昆蟲害蟲作鬥爭的合適蛋白質。例如，Bt Cry蛋白質的特異性大多是受限制的。仍期望鑑定具有針對不同靶昆蟲的特異性的毒素。其次，在一個地理區域長期使用後，已知昆蟲有能力發展出對化學殺蟲劑、微生物噴霧劑(例如，基於Bt孢子-晶體混合物)的抗性，並且認為昆蟲有能力發展出對表達殺昆蟲蛋白質的植物的抗性。昆蟲種群中抗性的發展可能潛在地使現有的殺昆蟲蛋白質失效，這就提供了對於新的基因和蛋白質的需要。第三，因為健康和環境原因，可能期望鑑定具有高度且特異的殺昆蟲效力和對靶昆蟲物種的急性生物活性的蛋白質。
此後，包括權利要求書中描述的不同實施方式，描述了從蘇雲金芽孢桿菌菌株分離的新的核酸序列和胺基酸序列，通過在合適啟動子控制下於植物中表達此核酸序列，或者通過給植物外部施用毒素，其可用於保護植物免受昆蟲損害。本發明毒素不同於先前描述的殺蟲毒素。
發明概述本發明提供了殺昆蟲ISP3蛋白質和編碼它們的核酸。提供了殺昆蟲蛋白質ISP3-1099E(SEQ ID No.2)，ISP3-327D(SEQ ID No.4)和ISP3-2245J(SEQ ID No.6)和分別編碼它們的核酸isp3-1099E(SEQ ID No.1)，isp3-327D(SEQ ID No.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)。本發明蛋白質具有抗鱗翅目昆蟲害蟲的殺昆蟲活性，特別是抗選自美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)，棉鈴蟲(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctigera，煙芽夜蛾(Heliothis vireseens)，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Spodoptera ornithogalli，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.的昆蟲。
在本發明另一個實施方式中，提供了ISP3蛋白質和編碼它們的核酸的殺昆蟲變異體和片段。提供的變異體是例如在嚴格條件下與SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5雜交的核酸序列。
在本發明一個實施方式中，提供了包含與SEQ ID No.2至少91％序列同一性，與SEQ ID No.4至少91％序列同一性或與SEQ ID No.6至少88％序列同一性的殺昆蟲蛋白質。
在本發明另一實施方式中，提供了包含與SEQ ID No.1至少93％序列同一性，與SEQ ID No.3至少94％序列同一性或與SEQ ID No.5至少97％序列同一性的分離的核酸序列。
在再一實施方式中，提供了編碼本發明ISP3蛋白質的核酸序列，其中該核酸序列是已經優化用於單子葉或雙子葉植物或植物細胞中表達的合成序列。
本發明另一個目的是提供嵌合基因，其包含可操作地連接核酸序列的啟動子序列，該核酸序列編碼ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲活性變異體或其片段。也提供了包含核苷酸序列的載體，該核苷酸序列編碼ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲活性變異體或其片段。
本發明還提供了包含嵌合基因的宿主細胞，特別是包含如下核苷酸序列的微生物或轉基因植物細胞、植物組織、植物器官、植物種子或整株植物，該核苷酸序列編碼ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲活性片段或其變異體。在一個實施方式中，轉化的植物是玉米或棉花植物。在另一個實施方式中，轉化的植物是水稻或大豆植物。在另一實施方式中，轉化植物是任何植物，特別是選自以下的任何植物高梁、小麥、大麥、黑麥、向日葵、甘蔗、菸草、芸苔屬種(BrassicaSpecies)(諸如油籽油菜、芥菜、甘藍、青花椰菜等)、蔬菜物種(番茄、花椰菜、蘿蔔、菠菜、胡椒、洋蔥、菜豆、豌豆、胡蘿蔔等)、甜菜、樹木物種(蘋果、梨、李子、針葉樹、落葉樹等)、馬鈴薯、紫花苜蓿、芒果、蕃木瓜、香蕉。
在另一實施方式中，提供了保護植物免受昆蟲損害的方法，包括用殺昆蟲ISP3蛋白質接觸所述植物。通過用編碼ISP3蛋白質的核苷酸序列轉化植物或通過給植物外部施用ISP3蛋白質，植物可以與ISP3蛋白質接觸。
在本發明一個實施方式中，提供了包含isp3核酸，特別是isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的Bt菌株。
在另一實施方式中，提供了包含殺昆蟲有效量ISP3蛋白質的殺昆蟲組合物。當將組合物外部施用於植物時，與沒有施用這種組合物的對照植物比較，殺昆蟲組合物增加植物對昆蟲損害的抗性。
在另一實施方式中，提供了進化編碼ISP3蛋白質的核酸序列的方法，該方法包括步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6胺基酸序列，或SEQ IDNo.2和/或4和/或6胺基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQ IDNo.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段的群體以形成重組核酸分子；(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲活性的蛋白質的重組核酸分子；(d)用在步驟(c)中選定的重組核酸分子重複步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經發現所編碼的蛋白質具有期望的殺昆蟲特性的重組核酸分子。
實施方式的詳細描述本發明領域是提供降低害蟲，特別是昆蟲害蟲，更特別是鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲害蟲引起的植物損害的方法和手段。已經鑑定和分離了新的核酸序列和蛋白質，其不同於先前描述的核酸序列和蛋白質，並且通過在植物或植物細胞中整合和表達這些新的核苷酸序列中的至少一種核苷酸序列，或者通過用包含這些核酸分子編碼的毒素的組合物外部處理植物或植物部分，所述核酸序列和蛋白質可以用於控制昆蟲害蟲。
本發明的一個實施方式提供從蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株分離的新的殺蟲毒素。具體地，提供了命名為ISP3-1099E蛋白質，ISP3-327D蛋白質和ISP3-2245J蛋白質的殺蟲蛋白質。
根據本發明，「核酸序列」指編碼本發明任一種ISP3蛋白質的單或雙鏈形式的DNA或RNA分子，優選地，DNA或RNA，特別地是DNA。這裡所用「分離的核酸序列」指不再存在於其分離自的天然環境中的核酸序列，例如在其它細菌宿主中或在植物核基因組中的核酸序列。
根據本發明，術語「蛋白質」或「多肽」可交換地用於指由胺基酸鏈組成的分子，而不涉及任何具體的作用模式、大小、三維結構或來源。因此，這裡仍舊稱本發明ISP3蛋白質的片段或部分為「蛋白質」。這裡所用的「分離的蛋白質」指不再在其天然環境中的蛋白質。蛋白質的天然環境指當編碼它的核苷酸序列在其天然環境中，即，核苷酸序列分離自的環境中表達和翻譯時，可以發現該蛋白質的環境。例如，分離的蛋白質可以在體外、另一細菌宿主中或植物細胞中存在，或者可以從另一細菌宿主或從植物細胞分泌。
根據本發明，已經分離和鑑定了編碼新的ISP3蛋白質的核酸序列，特別是DNA序列。分別命名這些新的基因為isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J和命名它們編碼的蛋白質為ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J。
根據本發明，「ISP3-1099E蛋白質」指包含SEQ ID No.2胺基酸序列中保留殺昆蟲活性的最小片段(此後稱為「最小毒性片段」)的任何蛋白質。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質。該定義也包括SEQ IDNo.2中胺基酸序列的變異體，諸如與SEQ ID No.2基本相似、在胺基酸序列水平具有至少91％，特別地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的胺基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對聯配(alignment)測定該序列同一性。GAP程序使用下面參數用於胺基酸序列比較「Blosum62」記分矩陣，8的「空位產生罰分」(或「空位權重」)和2的「空位延伸罰分」(或「長度權重」)。優選地，該定義包括這樣的蛋白質，即該蛋白質具有一些，優選地5-10個，尤其是少於5個的胺基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優選地不改變蛋白質的殺昆蟲活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質的殺昆蟲活性。
本發明「ISP3-327D蛋白質」指包含SEQ ID No.4胺基酸序列中保留殺昆蟲活性的最小片段(此後稱為「最小毒性片段」)的任何蛋白質。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質。該定義也包括SEQ ID No.4中胺基酸序列的變異體，諸如在胺基酸序列水平具有至少91％，特別地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的基本相似胺基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對聯配測定該序列同一性。GAP程序使用下面參數用於胺基酸序列比較「Blosum62」記分矩陣，8的「空位產生罰分」(或「空位權重」)和2的「空位延伸罰分」(或「長度權重」)。優選地，該定義包括這樣的蛋白質，即該蛋白質具有一些，優選地5-10個，特別地少於5個的胺基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優選地不改變蛋白質的殺昆蟲活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質的殺昆蟲活性。
本發明「ISP3-2245J蛋白質」指包含SEQ ID No.6胺基酸序列中保留殺昆蟲活性(此後稱為「最小毒性片段」)的最小片段的任何蛋白質。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質。該定義也包括SEQ ID No.6中胺基酸序列的變異體，諸如與SEQ ID No.2基本相似、在胺基酸序列水平具有至少88％，特別地至少89％，90％，91％，92％，93％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的胺基酸序列，其中利用WisconsinGCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對聯配測定該序列同一性。GAP程序使用下面參數用於胺基酸序列比較「Blosum62」記分矩陣，8的「空位產生罰分」(或「空位權重」)和2的「空位延伸罰分」(或「長度權重」)。優選地，該定義包括這樣的蛋白質，即該蛋白質具有一些，優選地5-10個，特別地少於5個的胺基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優選地不改變蛋白質的殺昆蟲活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質的殺昆蟲活性。
這裡所用「包含/包括」解釋為儘管規定了所述特徵，整數，步驟或成分的存在，但是不排除存在或添加一個或多個特徵，整數，步驟或成分或它們組合。因此，這裡所用術語「包含序列或區域X的DNA/蛋白質」指包括或含有至少序列或區域「X」的DNA或蛋白質，因此在5』(或N-末端)和/或3』(或C-末端)末端可以包括其它核苷酸或胺基酸序列，例如，EP 0 193 259中公開的選擇性標記蛋白質(的核苷酸序列)，轉運肽(的核苷酸序列)，和/或5』或3』前導序列。
這裡所用的本發明ISP3蛋白質的「最小毒性片段」是可以通過酶促消化全長ISP3蛋白質獲得的保留殺昆蟲活性的ISP3蛋白質的最小片段或部分，或者是可以通過在編碼ISP3蛋白質的DNA中製造核苷酸缺失獲得的保留殺昆蟲活性的ISP3蛋白質的最小片段或部分。可以理解，也可以化學合成編碼較短毒性ISP3片段的DNA，並且最小毒性片段的定義中包括可從合成的DNA轉錄和翻譯獲得的最小毒性片段。
在本發明一個實施方式中，ISP3蛋白質的最小毒性片段有通過SDS-PAGE分析(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)測定的約65kDa的分子量。在另一個實施方式中，ISP3蛋白質的最小毒性片段有約23kDa的分子量。在另一個實施方式中，ISP3蛋白質的最小毒性片段有約33kDa的分子量。在另一實施方式中，最小毒性片段包含ISP3蛋白質的中間胺基酸，特別是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的胺基酸第200位到胺基酸第455位的胺基酸。
如Yu等(1997)所述，通過利用純化酶或利用昆蟲幼蟲的消化液(gut-juice)，並且溫育消化液提取物和包含ISP蛋白質之一的溶液可以進行ISP3蛋白質的酶促消化。可以在SDS-PAGE上分離和觀察蛋白水解產物。為了測定每個蛋白水解片段和其殺昆蟲活性之間的關係，可以用處理過的、層析分級的蛋白質片段進行生物測定。用於測定ISP3蛋白質的最小毒性片段的優選消化液是來源於鱗翅目昆蟲，優選地來源於美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)，NativeBudworm(Helicoverpa punctigera)，煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，玉米斑點螟(Chilo partellus)，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Pod Borer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.的消化液。
利用本領域常規可用技術，通過上述片段的胺基酸序列測定，可以方便地測定最小毒性片段的N-和C-末端胺基酸序列端。
這裡所用術語「isp3-1099E」，「isp3-327D」和「″isp3-2245J」指分別編碼如上所述「ISP3-1099E蛋白質」或「ISP3-327D蛋白質」或「ISP3-2245J蛋白質」的任何DNA序列。其包括編碼SEQ ID No.2或SEQID No.4或SEQ ID No.6蛋白質，或者如上所述它們的殺昆蟲片段或變異體的天然、人工或合成的DNA序列。這裡也包括編碼殺昆蟲蛋白質的如下DNA序列，其與序列表中提供的DNA序列有足夠的相似性使得它們能(即，有能力)與這些DNA序列在嚴格雜交條件下雜交。
這裡所用的「嚴格雜交條件」特別指下面的條件在濾膜上固定相關DNA，並且在42℃，在50％甲醯胺、5×SSPE、2×Denhardt試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時，或者在68℃，在6×SSC、2×Denhardt試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時。然後將變性(地高辛配基-或放射)標記探針直接加入到預雜交液體中，在上述適當溫度溫育16到24小時。溫育後，在室溫，在2×SSC，0.1％SDS中洗濾膜30分鐘，接著在68℃，0.5×SSC和0.1％SDS中進行各30分鐘的2次洗滌。通過在-70℃，用增感屏使濾膜曝光X射線膠片(Kodak XAR-2或等同物)24到48小時確立放射自顯影圖。[20×SSC＝3M NaCl和0.3M檸檬酸鈉；100×Denhart試劑＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)FicoilTM和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS＝十二烷基硫酸鈉；20×SSPE＝3.6M NaCl，0.2M磷酸鈉和0.02MEDTA pH7.7]。當然，在該方法中可以使用等同的條件和參數，但是仍舊保留期望的嚴格雜交條件。
顯然，本領域已知許多可用於分離本發明DNA序列的變異體的方法。例如，可以通過上文所述雜交，和/或通過本領域所知的PCR技術，從Bt菌株分離變異體。可以製備isp3 DNA序列區域的特異或簡併引物，並且用於從已知或新的Bt菌株擴增變異體。
本發明isp3-1099E DNA的優選變異體是編碼上述殺昆蟲ISP3-1099E蛋白質變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.1具有至少93％，特別地至少94％，更優選地至少95％，96％或97％，最優選地至少98％或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲蛋白質的DNA序列。本發明isp3-327D DNA的優選變異體是編碼上述ISP3-327D蛋白質變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.3具有至少94％，優選地至少95％，特別地至少96％，97％，98％或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲蛋白質的DNA序列。本發明isp3-2245J DNA的優選變異體是編碼上述ISP3-2245J蛋白質變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.5具有至少97％，優選地至少98％，或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲蛋白質的DNA序列。利用Wisconsin GCG包(Madison，Wisconsin，USA)版本10.2的GAP程序計算上述序列同一性。GAP程序與下列用於核酸的參數一起使用「nwsgapdna」記分矩陣，50的「空位產生罰分」(或「空位權重」)和3的「空位延伸罰分」(或「長度權重」)。嚴格雜交條件如上所定義。
這裡所用的蛋白質的「殺昆蟲活性」意指當餵食昆蟲這種蛋白質時——優選地通過在重組宿主諸如植物中表達此蛋白質來實現，蛋白質殺死昆蟲的能力。應理解，如果蛋白質在昆蟲發育階段的至少一個階段，優選地幼蟲階段具有殺死昆蟲的能力，那麼該蛋白質具有殺昆蟲活性。
這裡所用的蛋白質的「昆蟲控制量」指足以將以植物為食的昆蟲(例如，昆蟲幼蟲)造成的植物損害限制到商業可接受水平的蛋白質量，此蛋白質量可以例如通過殺死昆蟲或通過抑制昆蟲發育、能育性或生長，使昆蟲對植物的損害變小並且使植物產量不明顯地受到不利影響。
根據本發明，使對本發明新的ISP3蛋白質敏感的昆蟲與昆蟲控制量，優選地殺昆蟲量的該蛋白質接觸。本發明蛋白質的優選靶昆蟲是玉米、棉花、水稻或大豆植物的經濟昆蟲害蟲，特別是北美和南美國家、亞洲和澳洲的這些害蟲。這裡所用術語「植物」包括整株植物及植物部分，諸如葉、莖、種子、花或根。本發明ISP3蛋白質的特別優選的靶昆蟲是鱗翅目昆蟲害蟲，諸如實夜蛾屬(Heliothis spp.)，棉鈴蟲屬(Helicoverpa spp.)，灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp.)，稈野螟屬(Ostrinia spp.)，紅鈴蟲屬(Pectinophora spp)，地虎屬(Agrotis spp)，白禾螟屬(Scirpophaga spp.)，縱卷葉野螟屬(Cnaphalocrocis spp.)，蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp.)，禾草螟屬(Chilo spp.)，Anticarsia spp.，Pseudoplusia spp.，葉小卷蛾屬(Epinotia spp)和Rachiplusia spp，優選地煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴蟲(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctera，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.。優選地，本發明ISP3蛋白質具有抗至少一種鱗翅目昆蟲物種，更優選地抗幾種鱗翅目昆蟲物種的殺昆蟲活性。
這裡所用術語「ISP3蛋白質」，「本發明ISP3蛋白質」，「ISP蛋白質」，或「本發明ISP蛋白質」指本發明分離、鑑定和在本文中定義為ISP3-1099E，ISP3-327D，ISP3-2245J蛋白質的新蛋白質中的任何一種蛋白質。
這裡所用ISP3蛋白質可以是全長大小的蛋白質，或者保留殺昆蟲活性的截短形式的蛋白質，或者其可以是雜合或融合蛋白質中不同蛋白質或蛋白質結構域的聯合。「ISP3毒素」指ISP3蛋白質的殺昆蟲片段或部分，特別是其最小毒性片段。這裡所用「isp基因」，「isp3基因」，「isp DNA」或「isp3 DNA」是編碼本發明ISP3蛋白質的DNA序列，特別是指上述isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J DNA序列中的任何一種DNA序列。
可以合成製備編碼本發明ISP3蛋白質的核酸序列，特別是DNA序列，並可以將其插入表達載體中以產生大量的ISP3蛋白質。按照常規方法(Hfte等，1988；Harlow和Lane，1988)，ISP3蛋白質可以用於製備特異性單克隆或多克隆抗體。
在本發明一個實施方式中，提供特異性結合ISP3蛋白質的抗體。特別地，提供了結合ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其片段或變異體的單克隆或多克隆抗體。其中包括單克隆或多克隆抗體的片段，該片段保留結合引起其產生的ISP3蛋白質或片段的能力。利用本領域已知的方法，諸如在Harlow和Lane″Using AntibodiesA LaboratoryManual″(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1998)中，在Liddell和Cryer，″A Practical Guide to Monoclonal Antibodies″(WILEYand Sons，1991)，中所述的方法，通過在動物(諸如家兔或小鼠)中利用ISP3蛋白質作為抗原可以製備ISP3蛋白質的抗體。抗體可以用於分離、鑑定、表徵或純化與其結合的ISP3蛋白質。例如，可以利用如ELISA或免疫印跡，通過使抗體和蛋白質形成免疫複合體，之後通過檢測免疫複合體的存在，抗體可以用於檢測樣品中的ISP3蛋白質。
此外，本申請提供了用於樣品中ISP3蛋白質、蛋白質片段或抗原表位檢測的免疫學試劑盒。樣品可以是細胞、細胞上清液、細胞懸浮液等。這種試劑盒包含結合ISP3蛋白質(或其片段)的抗體和一種或多種免疫檢測試劑。
也可以通過例如ELISA(酶聯免疫測定法)或Western印跡，將抗體用於分離具有相似活性的殺昆蟲蛋白質。具有期望結合特異性的單克隆抗體系也可以用於克隆編碼此特定單克隆抗體的DNA。
在本發明另一實施方式中，提供了用於檢測isp3-1099E，isp3-237D或isp3-2245J DNA序列的PCR引物和/或探針和試劑盒。按本領域所知方法(參見，Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等.(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany)，根據SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，可以合成從樣品擴增isp3 DNA的PCR引物對。同樣地，SEQ ID No.1，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5的DNA片段可以用作雜交探針。isp3檢測試劑盒可以包含isp3特異性引物或isp3特異性探針，和利用引物或探針檢測樣品中isp3 DNA的相關方案。例如，這種檢測試劑盒可以用於測定是否植物已經被本發明isp3基因(或其部分)轉化。
因為遺傳密碼的簡併性，可以將一些胺基酸密碼子置換為其它胺基酸密碼子而不改變蛋白質的胺基酸序列。而且，一些胺基酸可以被其它等同胺基酸置換，而不明顯地改變，優選地不改變蛋白質的殺昆蟲活性，至少不以不利地方式改變蛋白質的殺昆蟲活性。例如，只要不明顯地改變，優選地不改變，至少不以不利地方式改變ISP3蛋白質的殺昆蟲活性，在鹼性(例如，Arg，His，Lys)，酸性(例如，Asp，Glu)，非極性(例如，Ala，Val，Trp，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp)或極性(例如，Gly，Ser，Thr，Tyr，Cys，Asn，Gln)範疇內的保守性胺基酸置換落入本發明範圍。此外，只要不明顯地改變，優選地不改變，至少不以不利地方式改變ISP3蛋白質的殺昆蟲活性，非保守性胺基酸置換也落入本發明範圍。本發明DNA序列的變異體或等同物包括在嚴格雜交條件下與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ IDNo.5的isp3 DNA序列雜交並且編碼具有和本發明蛋白質相同的殺昆蟲特性的蛋白質的DNA序列，或者與本發明天然isp3基因比較，具有不同密碼子使用但是編碼具有相同殺昆蟲活性和基本相同，優選相同的胺基酸序列的蛋白質的DNA序列。利用可獲得的密碼子使用表，通過使密碼子使用適於植物基因中最優選的密碼子使用，特別是適於目的植物屬或種之天然基因(Bennetzen Hall，1982；Itakura等，1977)的密碼子使用，可以優化isp3 DNA序列的密碼子(例如，使其更適於在棉花、大豆、玉米或水稻中表達)。用於各種植物物種的密碼子使用表由例如，Ikemura(1993)和Nakamura等.(2000)公開。
而且，可以移除長段的AT或GC核苷酸序列，並且可以引入適宜的限制性位點。
而且，可以修飾ISP3蛋白質的N-末端以使其具有最佳的翻譯起始前後序列，由此在蛋白質的N-末端添加或缺失一個或多個胺基酸。在大多數情況下，為了最佳翻譯起始，優選將要在植物細胞中表達的本發明蛋白質起始於Met-Asp或Met-Ala二肽，這需要在isp3 DNA中起始密碼子下遊插入編碼Asp或Ala胺基酸的密碼子作為新的第二密碼子。可替代地，可以用「G」置換SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的第四個核苷酸，這樣(Met後)第二個胺基酸是Asp。同樣地，可以用Asp密碼子(GAT或GAC)或Ala密碼子(GCT，GCC，GCA或GCG)，或用起始於「G」的任何其它密碼子置換第二密碼子(AAC或AAT，編碼Asn)。
也可以修飾DNA序列以除去不適宜的剪接位點。因為細菌基因可能含有在其它宿主中，特別是真核生物宿主諸如植物中被識別為5』或3』剪接位點的基序，所以在這些其它宿主中的轉錄可能會過早地被終止，產生截短的mRNA。通過本領域已知的DNA序列的計算機分析和/或PCR分析可以鑑定不適宜的剪接位點。
當然，可以根據具體目的，構建其密碼子使用不同，但是編碼具有基本相同殺昆蟲活性的相同蛋白質或相似蛋白質的DNA序列。已經描述了在原核生物和真核生物表達系統中，將密碼子使用改變為宿主細胞的密碼子使用是外源宿主中基因表達所期望的(Bennetzen Hall，1982；Itakura等，1977)。在文獻中(Wada等，1990；Murray等，1989)和在主要的DNA序列資料庫中(例如，德國Heidelberg的EMBL)和如Nakamura等(2000)所述，可獲得密碼子使用表。因此，可以構建合成的DNA序列，由此產生相同或基本相同的蛋白質。顯然，一旦知道本發明ISP3蛋白質的胺基酸序列，就可以製備幾種DNA序列。這種其它DNA序列包括合成或半合成的DNA序列，其已被改變而失活基因中的某些位點，例如通過如PCT公開WO91/16432和WO93/09218中所述方式選擇性失活天然序列中存在的一些隱蔽的調節或加工元件，或者其全部密碼子使用被適應性修改以適於更相關宿主生物體的密碼子使用，優選地適於期望在其中進行表達的宿主生物體的密碼子使用。在專利和科技文獻中可以發現將密碼子使用改變為宿主細胞優選的密碼子使用的幾種技術。只要大多數或所有隱蔽的調節序列或加工元件已經被其它序列所置換，那麼修飾密碼子使用的精確方法對本發明來說不重要。
可以常規地，即，通過PCR介導的誘變進行諸如上述的DNA序列的小修飾(Ho等，1989，White等，1989)。利用現有技術，通過期望編碼區的從頭DNA合成可以常規地完成DNA序列的更深入的修飾。
術語「基本相同」，當指ISP3蛋白質的胺基酸序列時意指包括與所比較蛋白質的胺基酸序列相差不超過5％，優選地不超過2％的胺基酸序列；當指ISP3蛋白質的毒性時，意指包括這樣的蛋白質，其平均LC50值(其是引起試驗種群50％死亡的蛋白質濃度)與從所比較蛋白質獲得的平均LC50值相差不超過2倍，其中該蛋白質和所比較蛋白質的平均LC50值均根據相同生物測定條件下進行的3個獨立生物測定試驗計算。利用程序POLO PC(來自於LeOra軟體，1987，Berkely，California)，用Probit分析計算LC50值。可以理解為了確定是否存在LC50值的統計學顯著差異，針對比較的兩種蛋白質各自的LC50值，計算95％(或90％)置信限(用Probit分析計算的相關參數)。一般地，如果置信限重疊，那麼兩種蛋白質的毒性被視為基本相同，如果置信限不重疊，那麼兩種蛋白質的毒性被視為基本不同。
這裡所用術語ISP3毒素(或ISP3蛋白質)的「域」意指毒素(或ISP3蛋白質)中具有特定結構或功能的任何部分或域，該部分或域可以被轉移到另一蛋白質上以提供具有至少一種本發明ISP3毒素(或ISP3蛋白質)的功能特徵(例如，結合和/或毒性特徵)的新雜合蛋白質(Ge等，1991)。此部分可以形成具有本發明ISP3蛋白質的結合和/或毒性特徵的雜合蛋白質的必要特徵。這種雜合蛋白質可以具有擴大的宿主範圍，改進的毒性和/或可以用在防止昆蟲抗性發展的策略中(EP 408 403；Visser等，1993)。該定義包括編碼這些域的DNA序列。這裡所用的雜合蛋白質或融合蛋白質意指由不同蛋白質域組成並形成具有每個結構域的特徵的功能性嵌合蛋白質的蛋白質。在雜合或嵌合蛋白質中可以包含的另一個域是例如穩定域。穩定域已經被描述例如，存在於VIP3(a)蛋白質的C-末端，並且被認為可以在敏感昆蟲的腸道環境中賦予毒性蛋白質穩定性。
除了產生雜合蛋白質外，通過缺失所有或部分的結構域或向結構域中引入突變，並且分析由此在昆蟲毒性、蛋白質穩定性、對酶蛋白水解及溫度改變的敏感性和結合DNA/蛋白質/特異性細胞方面獲得的影響，可以分析特定結構域的功能。
本發明一個實施方式提供了使編碼ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E或ISP3-327D或ISP32245J的核酸序列「進化」為新的核酸序列的方法，其中該新的核酸序列編碼具有殺昆蟲活性的蛋白質。優選地，進化的核酸序列與未進化的核酸序列比較具有改進的殺昆蟲活性。這裡所用術語「進化」指如在US 5,811,238、WO97/20078和US 6,180,406中所述，通過序列重組增強序列進化的方法，這些文獻併入這裡為參考文獻。這裡所用核酸「改組」指核酸群或庫中的核酸序列間的體外或體內重組，並且可以如本領域所知和如US 5,811,238、WO97/20078、US 6,180,406、US 6,117,679中所述，進行這種核酸「改組」，這裡併入這些文獻為參考文獻。
進化編碼ISP3蛋白質的核酸序列的方法包括下面步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6胺基酸序列，或SEQ ID No.2和/或4和/或6胺基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段群以形成重組核酸分子；(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲活性的蛋白質的重組核酸分子；
(d)用在步驟(c)中選定的重組核酸分子重複步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經發現編碼的蛋白質具有期望的殺昆蟲特性的重組核酸分子。
未進化的核酸是在步驟(a)中提供的作為起始材料的核酸，而這裡所用的相應進化的核酸指當利用步驟(a)中未進化的核酸進行該方法時，在步驟(d)中獲得的重組核酸。用在步驟(a)中優選的核酸是編碼胺基酸序列ISP3-1099E(SEQ ID No.2)和/或ISP3-327D(SEQ ID No.4)和/或ISP3-2245J(SEQ ID No.6)，或其變異體或片段的核酸序列。步驟(a)中核酸分子和/或核酸分子的變異體和/或片段的群體可以包含編碼單個ISP3蛋白質的DNA和/或編碼本發明單個ISP3蛋白質的變異體和/或片段的核酸，或者包含編碼本發明不同ISP3蛋白質和/或其片段和/或變異體的核酸的混合物。編碼胺基酸序列SEQ ID No.2的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.2在胺基酸水平上具有至少91％，優選地至少92％，最優選地至少93％，94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的胺基酸序列的核酸序列。編碼胺基酸序列SEQ ID No.4的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.4在胺基酸水平上具有至少91％，優選地至少92％或93％，最優選地至少94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的胺基酸序列的核酸序列。編碼胺基酸序列SEQ ID No.6的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.6在胺基酸水平上具有至少88％，優選地至少89％或90％，最優選地至少91％，92％，93％，95％，98％，99％或100％序列同一性的胺基酸序列的核酸序列。
優選地，步驟(d)中獲得的進化的核酸序列編碼具有改進殺昆蟲活性的蛋白質，即，蛋白質具有，例如比步驟(a)中用作為起始材料的未進化序列編碼的蛋白質更高的毒性，或者與未進化序列比較具有抗不同靶昆蟲譜的活性，或者它結合靶昆蟲中不同的靶結合位點。可以通過進行昆蟲生物測定，比較進化和未進化核酸序列編碼的蛋白質的殺昆蟲活性，選擇和篩選期望的較高毒性和/或不同毒性譜(步驟(c))。根據期望的殺昆蟲特性，可以進行可替代的或另外的其它功能測定。例如，如果增強的結合是期望的特性，那麼在進行昆蟲生物測定前可以進行結合測定。
可以在適宜表達載體中連接從總DNA製備的本發明isp3 DNA序列，並且轉化細菌菌株，諸如大腸桿菌(E.coli)或Bt菌株，然後可以通過常規菌落免疫探測方法(French等，1986)，用抗ISP3蛋白質產生的單克隆或多克隆抗體，篩選表達毒素的克隆。
然後，可以篩選產生ISP3蛋白質的Bt或大腸桿菌克隆(可以利用標準方法，對無細胞培養物上清液或細胞裂解液進行SDS-PAGE凝膠電泳，並實施標準western印跡方法)，或者可以檢測細菌以與對照細菌比較其殺昆蟲活性。利用標準PCR方法，諸如RT-PCR，也可以分析克隆是否存在編碼ISP3蛋白質的mRNA。
可以用常規方法(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)測序編碼本發明ISP3蛋白質的基因以獲得DNA序列。序列比較表明該基因不同於以前描述的編碼具有抗鱗翅目活性的毒素的基因。
基因序列分析後，可以按照常規方法製備這些DNA序列中編碼新鑑定的ISP3蛋白質的殺昆蟲有效部分的殺昆蟲有效部分DNA。從分離的DNA序列的DNA序列可以確定ISP3蛋白質的胺基酸序列。這裡也稱為「截短基因」或「截短DNA」的編碼ISP3蛋白質的DNA序列的「殺昆蟲有效部分(或片段)」意指編碼如下多肽的DNA序列，該多肽比ISP3全長蛋白質形式具有較少的胺基酸，但是具有殺昆蟲活性。
為了在大腸桿菌、在其它Bt菌株和在植物中表達編碼本發明ISP3蛋白質的DNA序列的全部或殺昆蟲有效部分，可以引入適宜限制位點使其位於DNA序列側翼。這可以利用熟知的方法(Stanssens等，1989；White等，1989)，通過定點誘變完成。為了在植物中獲得改進的表達，可以根據PCT公布WO91/16432和WO93/09218和公布EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5,689,052，修飾本發明isp3基因或殺昆蟲有效isp3基因部分的密碼子使用以形成等價的、修飾的或人工的基因或基因部分，或者可以將isp3基因或基因部分插入質體、線粒體或葉綠體基因組並且利用適宜啟動子在那裡進行表達(例如，Mc Bride等，1995；US 5,693,507)。
為了在單子葉植物諸如玉米或水稻中獲得增加的表達，也可以向嵌合基因添加內含子，優選地單子葉植物內含子。例如，已經證明將玉米Adh1基因的內含子插入到5』調節區中可以增加玉米中的表達(Callis等，1987)。同樣地，如在US 5,859,347中所述的HSP70內含子可以用於增加表達。通過定點內含子插入和/或通過改變密碼子使用，例如使密碼子使用適應於植物，優選地特定相關植物屬的最優選密碼子使用(Murray等，1989)，而不明顯改變，優選地不改變所編碼的胺基酸序列，可以進一步以翻譯中性方式改變isp3基因或其殺昆虫部分的DNA序列，以修飾基因部分中存在的可能的抑制DNA序列。
根據本發明一個實施方式，優選將蛋白質靶向細胞內細胞器諸如質體、優選地葉綠體，線粒體，或者從細胞分泌蛋白質從而潛在地優化蛋白質穩定性和/或表達。對於該目的，在本發明一個實施方式中，本發明嵌合基因包含編碼信號肽或導向肽的編碼區，其連接本發明ISP3蛋白質編碼區。本發明蛋白質中待包含的特別優選的肽是用於葉綠體或其它質體導向的轉運肽，特別是來自基因產物靶向質體的植物基因的雙轉運肽區，，Capellades等(US 5,635,618)的優化的轉運肽，來源於菠菜的鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶的轉運肽(Oelmuller等，1993)，Wong等(1992)中所述的轉運肽和在公開的PCT專利申請WO00/26371中的導向肽。也優選引導與其連接的蛋白質分泌到細胞外的肽，諸如馬鈴薯蛋白酶抑制劑II的分泌信號(Keil等，1986)，稻α-澱粉酶基因3的分泌信號(Sutliff等，1991)和菸草PR1蛋白質的分泌信號(Cornelissen等，1986)。
本發明特別有用的信號肽包括葉綠體轉運肽(例如，Van Den Broeck等，1985)或者US 5,510,471和US 5,635,618的優化的葉綠體轉運肽——其引起蛋白質向葉綠體的轉運，分泌性信號肽或將蛋白質靶向其它質體、線粒體、ER或另外的細胞器的肽。在天然導向蛋白質或分泌蛋白質中存在用於靶向細胞內細胞器或分泌到植物細胞外或分泌到細胞壁的信號序列，優選地，如Klsgen等，(1989)，Klsgen和Weil(1991)，Neuhaus Rogers(1998)，Bih等(1999)，Morris等(1999)，Hesse等(1989)，Tavladoraki等(1998)，Terashima等(1999)，Park等(1997)，Shcherban等(1995)中所述的信號序列(這裡併入所有這些文獻為參考文獻)，特別是來源於玉米、棉花、大豆或稻的導向或分泌性蛋白質的信號肽序列。
為了使得ISP3蛋白質分泌到轉化的宿主細胞外面，可以將適宜分泌信號肽融合到ISP3蛋白質的氨基末端(N-末端)。也可以缺失或用適當的信號肽，諸如上述真核生物分泌性信號肽置換任何推定的天然芽孢桿菌屬(Bacillus)分泌性信號肽。具體地，本發明ISP3蛋白質的胺基酸1到54位包含推定的芽孢桿菌屬信號肽。可以從ISP3蛋白質移除或者可以用適當的信號肽，特別是上述真核生物信號肽置換第1到10，優選地1到50，更優選地l到54位胺基酸。利用計算機分析，利用程序諸如信號肽檢索程序(SignalP 1.1或2.0版)，利用用於原核生物革蘭氏陽性細菌的矩陣和小於0.5的閾值，特別是0.25或更小的閾值，可以檢測推定的信號肽(Von Heijne，GunnaF，1986和Nielsen等，1996)。
而且，利用本領域已知的方法(例如，Van Rie等，1990)，可以評估本發明ISP3蛋白質的結合特性，以確定本發明ISP3蛋白質是否結合其它Bt蛋白質不識別(或競爭性識別)的昆蟲腸道，諸如中腸中的位點。在相關敏感昆蟲中不存在結合競爭的具有不同結合位點的殺昆蟲Bt蛋白質是非常有價值的，尤其當其在植物中表達時，可以用其置換昆蟲可能已經發展了抗性的已知Bt蛋白質，或者將其與具有不同作用方式的殺昆蟲Bt蛋白質聯合使用以防止或延遲昆蟲抗Bt蛋白質抗性的發展。因為新分離的Bt毒素的這些特性，它們尤其可用於轉化植物，例如單子葉植物諸如玉米和水稻和雙子葉植物諸如棉花和大豆，以保護這些植物免受昆蟲損害。預期本發明ISP3蛋白質的結合特性與Cry毒素的結合特性比較將不同。通過上述或US 6,291,156和US 6,137,033中的常規結合測定法可以測定這種不同的結合特性。
特別是為了對特定昆蟲害蟲進行昆蟲抗性控制，優選將本發明ISP3蛋白質與另一種昆蟲控制蛋白質，特別是Bt Cry蛋白質或VIP或VIP樣蛋白質，優選地不識別這種ISP3蛋白質所識別的至少一個結合位點的蛋白質聯合。與本發明ISP3蛋白質聯合的優選的昆蟲控制蛋白質，特別是對於在植物，優選地玉米、棉花、稻或大豆植物中同時表達而言，包括Cry蛋白質，諸如Cry1F蛋白質或來源於Cry1F蛋白質的雜合體(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中所述雜合Cry1A-Cry1F蛋白質，或其毒性片段)，Cry1A型蛋白質或其毒性片段，優選地Cry1Ac蛋白質或來源於Cry1Ac蛋白質的雜合體(例如，US 5,880,275中所述雜合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白質)，或者如EP451878中所述Cry1Ab或Bt2蛋白質或其殺昆蟲片段，如WO02/057664中所述Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白質，如WO01/47952中所述Cry蛋白質，如Estruch等(1996)和US 6,291，156中所述VIP3Aa蛋白質或其毒性片段，來源於Xenorhabdus(如WO98/50427中所述)、沙雷氏菌屬(Serratia)(特別是來源於嗜蟲沙雷氏菌(S.entomophila))或光杆狀菌屬(Photorhabdus)種菌株的殺昆蟲蛋白質，諸如在WO98/08932(例如，Waterfield等，2001；Ffrench-Constant和Bowen，2000)中所述來源於光杆狀菌屬(Photorhabdus)的Tc蛋白質。在一個實施方式中，通過用本發明ISP3蛋白質轉化已經表達昆蟲控制蛋白質的植物，或者通過使昆蟲控制蛋白質轉化的植物和一種或多種本發明ISP3蛋白質轉化的植物雜交，可以容易地獲得這種共表達。對於玉米、稻、棉花或大豆植物，優選地，ISP3-327D蛋白質或ISP3-1099E蛋白質或ISP3-2245J蛋白質用作第一昆蟲控制蛋白質，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ae或VIP3Aa蛋白質或其衍生物用作第二昆蟲控制蛋白質。在EP 0 408 403中描述了在相同植物中獲得不同Bt(或者相似地，對於其它昆蟲控制蛋白質而言)殺昆蟲蛋白質表達以最小化或防止針對轉基因抗昆蟲植物的抗性發展的方法。可以理解，不同蛋白質可以在相同植物中表達，或者每種蛋白質可以分別在一種植物中表達，然後通過植物相互的雜交，在相同植物中聯合這些蛋白質。例如，在雜種種子生產中，每種親本植物可以表達單種蛋白質。一旦親本植物雜交產生雜種，雜種植物中兩種蛋白質將聯合。
熟知Bt Cry蛋白質作為原毒素表達，在昆蟲腸道中該原毒素通過蛋白酶解轉化為毒性核心。當本發明ISP3蛋白質與Bt Cry蛋白質聯合時，可以理解，可以利用編碼全長原毒素或毒性核心或任何中間形式的Bt Cry基因。
優選地，為了篩選目的也是為了增強雜草控制目的，還可以用編碼能賦予針對廣譜除草劑的抗性的蛋白質的DNA轉化本發明轉基因植物，所述除草劑是例如基於草丙膦(glufosinate)和草甘膦的除草劑。
用常規方法，可以將編碼ISP3蛋白質的殺昆蟲有效部分的殺昆蟲有效isp3基因部分或其等同物，優選地isp3嵌合基因穩定地插入到單個植物細胞的核基因組中，並且可以按照常規方法使用這種轉化的植物細胞產生具有昆蟲抗性的轉化植物。在這方面，根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中含有殺昆蟲有效isp3基因部分的T-DNA載體可以用於轉化植物細胞，並且以後利用例如在EP 0 116 718，EP 0 270 822，PCT公開WO84/02913和公開的歐洲專利申請EP0242 246和在Gould等(1991)中所述的方法，可以從轉化的植物細胞再生轉化的植物。本領域熟知用於農桿菌介導的植物轉化的T-DNA載體的構建。如EP 0 120 561和EP 0 120515中所述，T-DNA載體可以是雙元載體，或者如EP 0 116 718所述，T-DNA載體可以是能通過同源重組整合進入農桿菌Ti質粒的共整合載體。優選的T-DNA載體都在T-DNA邊界序列之間，或者至少在右邊界序列的左側含有可操作地連接殺昆蟲有效isp3基因部分的啟動子。在Gielen，等(1984)中描述了邊界序列。當然，利用方法諸如直接基因轉移(例如，在EP 0223 247中所述)，花粉介導的轉化(例如，在EP 0270 356和WO85/01856中所述)，例如US 4,684,611中所述的原生質體轉化，植物RNA病毒介導的轉化(例如，在EP 0 067 553和US 4,407，956中所述)，脂質體介導的轉化(例如，在US 4,536,475中所述)，和其它方法，諸如最近描述的用於轉化一些玉米株系(例如，US 6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和稻(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)的方法和一般性用於轉化單子葉植物的方法(PCT公開WO92/09696)，可以利用其它類型載體轉化植物細胞。對於棉花轉化，特別優選的是PCT專利公布WO00/71733中所述的方法。對於稻轉化，可以參考WO92/09696，WO94/00977和WO95/06722中所述的方法。
這裡所用術語「玉米」指玉米(Zea mays)。這裡所用棉花指棉屬(Gossypium spp.)，特別是陸地棉(G.hirsutum)和海島棉(G.barbadense)。術語「稻」指稻屬(Oryza spp.)，特別地是稻(O.sativa)。「大豆」指大豆屬(Glycine spp.)，特別是大豆(G.max)。
除了核基因組的轉化，本發明也包括質體基因組，優選地葉綠體基因組的轉化。Kota等(1999)描述了在菸草葉綠體中超表達Cry2Aa蛋白質的方法。
可以在常規植物培育方案中使用由此獲得的轉化植物用以產生具有相同特徵的更多轉化植物，或者用以將殺昆蟲有效isp3基因部分引入相同或親緣植物物種的其它品種中。從轉化植物獲得的種子含有作為穩定插入物的殺昆蟲有效isp3基因部分。可以按照常規方法培養轉化植物的細胞以產生ISP3毒素或蛋白質的殺昆蟲有效部分，然後可以將其回收以用在抗鱗翅目的常規殺昆蟲組合物(US 5,254,799)中。
將殺昆蟲有效isp3基因部分插入植物細胞基因組中，使該插入基因在啟動子下遊(即，3』)並且受該啟動子控制，其中該啟動子可以指導植物細胞中此基因部分的表達。這優選地通過在植物細胞基因組中，特別在核或質體(例如，葉綠體)基因組中插入isp3嵌合基因來完成。
優選的啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)分離株CM 1841的強組成型35S啟動子(「35S啟動子」)(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)；Odell等(1985)描述的35S啟動子，來源於泛素家族的啟動子(例如，Christensen等1992，EP0 342 926，也參見Cornejo等1993的玉米泛素啟動子)，gos2啟動子(dePater等，1992)，emu啟動子(Last等，1990)，擬南介肌動蛋白啟動子諸如An等(1996)所述的啟動子，稻肌動蛋白啟動子諸如Zhang等(1991)所述的啟動子和US 5,641,876中所述的啟動子；木薯脈花葉病毒啟動子(WO97/48819，Verdaguer等，(1998))，來源於地下三葉草矮化病毒的pPLEX系列啟動子(WO96/06932，特別是S7啟動子)，醇脫氫酶啟動子，例如pAdh1S(GenBank記錄號X04049，X00581)，和TR1′啟動子和TR2′啟動子(分別是「TR1′啟動子」和「TR2′啟動子」)——它們分別驅動T-DNA的1′和2′基因的表達(Velten等，1984)。可替代地，可以利用不是組成型，而是對植物一個或多個組織或器官(例如，葉片和/或根)特異的啟動子，由此插入的isp3基因部分僅在特定組織或器官的細胞中表達。例如，通過將殺昆蟲有效isp3基因部分置於光誘導型啟動子的控制下，可以在植物(例如，玉米、棉花、水稻、大豆)葉片中選擇性表達殺昆蟲有效isp3基因部分，所述光誘導型啟動子是諸如US 5,254,799中所公開的植物本身或其它植物，諸如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動子。例如，可以選擇啟動子使得僅在靶昆蟲害蟲為食的那些組織或細胞中表達本發明isp3基因，以便，與不表達isp3基因的植物比較，通過敏感靶昆蟲的取食引起對宿主植物減少的昆蟲損害。因此，通過表達根特異性啟動子控制下的isp3基因，可以有效地控制主要損害根的鱗翅目昆蟲害蟲。在WO00/29566中描述了優先在根中有活性的啟動子。用於根優先表達的優選啟動子是US 5,633,363中所述的ZRP啟動子(和其修飾物)。另一替代方案是利用誘導型表達的啟動子，例如由(如通過昆蟲取食引起的)傷口誘導的傷口誘導型啟動子諸如，Cordera等(1994)所述MPI啟動子，或者由化學試劑諸如Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松誘導的啟動子，或者由溫度誘導的啟動子，諸如US 5,447,858中所述熱休克啟動子，或者由其它外部刺激誘導的啟動子。
將殺昆蟲有效isp3基因部分插入到植物基因組中，使插入的基因部分位於適宜的3′末端轉錄調節信號(即，轉錄物形成和聚腺苷酸化信號)的上遊(即，5′)。優選通過在植物細胞基因組中插入isp3嵌合基因完成上述過程。優選的聚腺苷酸化和轉錄物形成信號包括CaMV 35S基因、胭脂鹼合酶基因(Depicker等，1982)、章魚鹼合酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的這種信號，它們在轉化的植物細胞中作為3′-非翻譯DNA序列。
利用已知的方法諸如電穿孔或三親本交配可以將T-DNA載體引入農桿菌。
任選地，該殺昆蟲有效isp3基因部分可以作為雜合基因插入到植物基因組中(US 5,254,799；Vaeck等，1987)，並且與可選擇或可評價的標記基因，如編碼卡那黴素抗性的neo基因(EP 0 242 236)處於相同的啟動子控制下，由此，植物表達易檢測的融合蛋白質。
也可以利用植物細胞的轉化在植物細胞培養中大量生產本發明的蛋白質，例如生產ISP3蛋白質，然後，該蛋白可以在適當配製後施用到玉米作物上。本文中提到轉基因植物細胞時，它指分離的或組織培養中的植物細胞(或也指植物原生質體)，或包含在植物中或分化器官或組織中的植物細胞(或原生質體)，而且特別地本文包括這兩種可能。因此，在說明書或權利要求書中提到植物細胞不僅僅意指培養中的分離的細胞，也指可能位於任何位置或可能存在於任何類型的植物組織或器官中的任何植物細胞。
也可以用編碼抗鱗翅目的蛋白質的整個或部分isp3基因轉化有抗鱗翅目或鞘翅目殺昆蟲活性的其它微生物，如細菌，諸如蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。由此，可以產生轉化的Bt菌株，用於對抗廣譜的鱗翅目和/或鞘翅目昆蟲害蟲或用於對抗其它的鱗翅目昆蟲害蟲。可以用常規方法，優選用如Mahillon等，(1989)和PCT專利公布WO90/06999中所述常規的電穿孔技術，用引入到適宜克隆載體中的整個或部分本發明isp3基因進行細菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、農桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或埃希氏菌屬(Escherichia)細菌的轉化。
可以用常規方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)發酵含有本發明isp3基因的轉化芽孢桿菌屬菌株以提供高產量的細胞。在熟知的適當生長條件下，這些菌株以高產量分泌ISP3蛋白質。
可以表達isp3基因的備選適宜宿主微生物是真菌、藻類或病毒，特別是定居植物(例如，內共生)的物種或作為昆蟲病原體的物種。
可以用isp3基因轉化的微生物或優選它們相應的ISP3蛋白質或ISP3毒素或殺昆蟲有效的毒素部分作為活性組分，一起與適宜的載體、稀釋劑、乳化劑和/或分散劑(例如，如Bernhard和Utz，1993所述)，通過常規方法製成本發明的殺昆蟲的，特別是抗鱗翅目的組合物。該殺昆蟲組合物可以製成可溼性粉劑，丸，顆粒或粉劑，或用水或非水溶劑製成液體製劑，如泡沫，凝膠，懸浮液，濃縮物等。WO96/10083中描述了包含殺昆蟲Bt孢子的組合物的例子。
根據本發明，控制昆蟲，特別是鱗翅目的方法包括向要保護的場所(區域)施用(例如，噴霧)殺昆蟲量的ISP3蛋白質或含有ISP3蛋白質或含有用本發明isp3基因轉化的宿主細胞的組合物。要保護的場所可以包括，例如昆蟲害蟲的棲息地或生長的植物(例如，施用到葉)或將要生長植物的區域(例如，施用到土壤或水)。優選的組合物含有(優選通過細菌宿主產生的)殺昆蟲量的至少一種本發明ISP3蛋白質，組合物優選的施用方式是葉片施用，土壤施用或種子包衣。
這裡所用術語「接觸」意指「與......發生物理接觸」。用殺昆蟲蛋白質接觸植物意指內部地(例如，通過在植物中表達)或外部地(例如，通過向植物外部施用包含殺昆蟲蛋白質的組合物)使殺昆蟲蛋白質與植物細胞接觸。可以理解，儘管該術語未指出接觸的時間長度，但是包括任何接觸時間(例如，短暫接觸，長期接觸)。當涉及包括用本發明殺昆蟲蛋白質接觸植物(或其細胞或組織)以保護植物免受昆蟲損害的方法時，優選足夠長和足夠廣泛的接觸(即，足夠大量的細胞接觸足夠高數量的蛋白質)以防止或減少昆蟲損害。
本發明還涉及控制鱗翅目棉花昆蟲害蟲，特別是棉鈴蟲、捲葉蛾、earworms的方法，優選地鱗翅目棉花昆蟲害蟲選自美洲棉鈴蟲，棉鈴蟲，Helicoverpa punctigera(Native Bollworm)，煙芽夜蛾，草地粘蟲和棉花紅鈴蟲，該方法包括向要保護的區域或植物施用這裡所述的ISP3蛋白質，優選地這裡所述的ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質(即，例如通過種植用本發明isp3基因轉化的棉花植物，或者通過噴霧含有本發明ISP3蛋白質的組合物，用本發明ISP3蛋白質接觸棉花植物)。
本發明也涉及本發明ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質對抗鱗翅目棉花昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對棉花植物的損害的用途。
本發明還涉及控制鱗翅目玉米昆蟲害蟲，特別是earworm、粘蟲、玉米螟的方法，優選地，玉米昆蟲害蟲選自美洲棉鈴蟲，小地老虎，歐洲玉米螟，草地粘蟲，該方法包括向要保護的區域或植物施用這裡所述的ISP3蛋白質，優選地這裡所述的ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質(即，例如通過種植用本發明isp3基因轉化的玉米植物，或者通過噴霧含有本發明ISP3蛋白質的組合物，用本發明ISP3蛋白質接觸玉米植物)。本發明也涉及本發明ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質對抗鱗翅目玉米昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對玉米植物的損害的用途。
本發明還涉及控制鱗翅目水稻昆蟲害蟲，特別是二化螟、稻苞蟲、稻切根蟲、稻葉夜蛾、稻縱卷葉螟，美洲稻弄蝶的方法，優選地，水稻昆蟲害蟲選自三化螟，稻縱卷葉螟，大螟和Corn spotted stem Borer(Chilopartellus)，該方法包括向要保護的區域或植物施用這裡所述的ISP3蛋白質，優選地這裡所述的ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質(即，例如通過種植用本發明isp3基因轉化的稻植物，或者通過噴霧含有本發明ISP3蛋白質的組合物，用本發明ISP3蛋白質接觸稻植物)。本發明也涉及本發明ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質抗鱗翅目水稻昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對稻植物的損害的用途。
本發明還涉及控制鱗翅目大豆昆蟲害蟲的方法，優選地，大豆昆蟲害蟲選自藜豆夜蛾，大豆夜蛾，甜菜夜蛾，yellow stripedarmvworm(Spodoptera ornithogalli)，美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)，PodBorer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.，該方法包括向要保護的區域或植物施用這裡所述的ISP3蛋白質，優選地這裡所述的ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質(即，例如通過種植用本發明isp3基因轉化的大豆植物，或者通過噴霧含有本發明ISP3蛋白質的組合物，用本發明ISP3蛋白質接觸大豆植物)。本發明也涉及本發明ISP3蛋白質，特別是ISP3-1099E蛋白質和/或ISP3-327D蛋白質和/或ISP3-2245J蛋白質對抗鱗翅目大豆昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對大豆植物的損害的用途。
為了獲得ISP3毒素或蛋白質，可以通過常規方法在適宜培養基上生長表達ISP3蛋白質的重組宿主細胞。可以從生長培養物分離和純化分泌的毒素。可替代地，如果蛋白質不被分泌，可以利用常規方法如酶降解或去汙劑等裂解細胞。然後，用標準技術，如層析法，提取，電泳等分離和純化毒素。
術語「基因」意指包含可在細胞中轉錄為RNA分子(例如，mRNA)的區域(「轉錄的區域」)的任何DNA或RNA片段，其中所述區域可操作地連接適宜的調節區域，例如植物可表達的啟動子。因此，基因可以包含幾個可操作地連接的片段，諸如啟動子、5』前導序列、編碼區和包含聚腺苷酸化位點的3』非翻譯序列。特定生物體(諸如植物物種或細菌菌株)的內源基因是在自然界中天然存在於該生物體中的基因。當提到本發明isp3 DNA時，嵌合基因指具有的5』和/或3』調節序列不同於驅動isp3基因在其天然宿主細胞中表達的天然細菌5』和/或3』調節序列的isp3 DNA序列。
術語「基因表達」指可操作地連接適當調節區域，特別是啟動子的DNA或RNA區域轉錄為生物活性RNA的過程，所謂生物活性RNA即該RNA能與另一核酸相互作用，或者其能翻譯為生物活性多肽或蛋白質。當基因表達的終產物是生物活性RNA，諸如反義RNA、核酶或複製中間體時，稱基因編碼RNA。當基因表達終產物是生物活性蛋白質或多肽時，稱基因編碼蛋白質。
對於本發明目的，以百分數表示的兩個相關核苷酸或胺基酸序列的「序列同一性」，指在此兩個最佳聯配的序列中具有相同殘基的位置的數目除以所比較的位置數(×100)。空位，即，聯配中在一個序列中存在殘基而在另一個序列中不存在殘基的位置，其被視為具有不同殘基的位置。對於本發明目的，為了計算兩個序列之間的序列同一性，利用GAP程序，該程序利用了Needleman和Wunsch算法(1970)，並且由WisconsinPackage，版本10.2，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711，USA，提供。所用GAP參數是空位產生罰分＝50(核苷酸)/8(胺基酸)，空位延伸罰分＝3(核苷酸)/2(胺基酸)，和記分矩陣″nwsgapdna″(核苷酸)或″blosum62″(胺基酸)。
GAP利用了Needleman和Wunsch全局聯配算法以就兩個序列的全長進行聯配，從而最大化匹配數和最小化空位數。預設參數是空位產生罰分＝50(核苷酸)/8(蛋白質)和空位延伸罰分＝3(核苷酸)/2(蛋白質)。對於核苷酸，所用的預設記分矩陣是″nwsgapdna″；對於蛋白質，預設記分矩陣是″blosum62″(HenikoffHenikoff，1992)。
在權利要求的文字中反映了本發明這些和/或其它實施方式，其形成本下面的實施例示例了本發明，但是不旨在對本發明和其保護範圍的限制。實施例、權利要求和說明書中提到的序列表如下SEQ ID No.1DNA序列isp3-1099ESEQ ID No.2胺基酸序列ISP3-1099ESEQ ID No.3DNA序列isp3-327DSEQ ID No.4胺基酸序列ISP3-327DSEQ ID No.5DNA序列isp3-2245JSEQ ID No.6胺基酸序列ISP3-2245J除了在實施例中另外說明外，根據標準方法進行所有重組DNA技術，所述標準方法是Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中，Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的1和2卷中，和Brown(1998)Molecular Biology Labfax，第二版，Academic Press(UK)的卷I和II中所述的標準方法。在R.D.D.Croy著Plant Molecular Biology Labfax(1 993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK聯合出版)中描述了用於植物分子工作的標準材料和方法。可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，中和McPherson等.(2000)PCR-BasicsFromBackground to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中發現用於聚合酶鏈式反應的標準材料和方法。
實施例實施例1細菌菌株的鑑定從比利時的谷塵(grain dust)分離到這裡命名為BTS01099E的細菌菌株。從西班牙的馬糞分離到這裡命名為BTS00327D的另一種細菌菌株。從菲律賓的谷塵分離到這裡命名為BTS02245J的另一種細菌菌株。
在28℃，在LB瓊脂板(添加1.5％瓊脂的LB培養基；LB培養基10g/l胰蛋白腖，10g/l NaCl，5g/l酵母提取物，pH7.3)上過夜生長每個菌株。對於小規模培養，接種20ml TB培養基(Terrific肉湯12g/l胰蛋白腖，24g/l酵母提取物，3.8g/l KH2PO4，12.5g/l K2HPO4，5ml/l甘油，pH7.1)，在28℃，在每分鐘約70轉的旋轉平臺上生長65小時。65小時後，向培養物添加蛋白酶抑制劑混合物。該混合物具有下面的組分(所給的體積為添加到一份20ml培養物所需的體積)200μl PMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)和ε-氨基-正-己酸(500 mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巰基乙醇(14M)。
然後，在3000rpm，離心已經添加了蛋白酶抑制劑混合物的培養基20分鐘。在一些情況下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)濃縮上清液約4倍。
為了進行長期貯藏，將一環形成孢子的細胞加入到0.5ml的25％甘油中，渦旋後，在-70℃貯藏。通過在LB瓊脂板上生長菌株直到孢子形成，獲得形成孢子的細胞(在光學顯微鏡下可觀察看到)。
將單細胞菌落在LB瓊脂板上培養後，BTS01099E、BTS00327D和BTS02245J菌株培養物的顯微鏡分析表明存在杆狀的、運動的、單個營養細胞和包含卵圓形孢子的孢子囊。在BTS00327D，BTS01099E和BTS02245J培養物中檢測到伴胞晶體。
根據杆樣形狀、有氧生長和伴胞晶體的存在，認為這3株是蘇雲金芽孢桿菌種菌株。
可以在常規標準培養基上，優選地T3培養基(胰蛋白腖3g/l，胰蛋白 2g/l，酵母提取物1.5g/l，5mg MnCl2，0.05M Na2HPO4.2H2O，0.05MNaH2PO4.H2O，pH6.8和1.5％瓊脂)上，優選在28℃，培養每個菌株。為了長期貯藏，優選地，混合等體積的孢子晶體懸浮液和等體積的50％甘油，並且將它貯藏在-70℃或凍幹孢子晶體懸浮液。優選在28℃，72小時，在T3培養基上生長以實現孢子形成。
實施例2芽孢桿菌菌株的昆蟲生物測定(利用含有殺昆蟲蛋白質的培養物懸浮液)對美洲棉鈴蟲，煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)，草地粘蟲(spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)的新生幼蟲進行生物測定。
在抗各種鱗翅目昆蟲的昆蟲測定中(「表面汙染測定」)，使用不同芽孢桿菌菌株的細菌培養物的無細胞上清液。
在28℃，在TB培養基上生長菌株BTS01099E，BTS00327D或BTS02245J。培養開始後65小時收穫無細胞培養物上清液，進行稀釋並施用到固化人工餌料(瓊脂20g，水1000ml，玉米粉96g，酵母30g，麥胚64g，Wesson鹽7.5g，酪蛋白15g，山梨酸2g，金黴素0.3g，Nipagin 1g，麥胚油4ml，蔗糖15g，膽固醇1g，抗壞血酸3.5g，Vanderzand mod.vit.mix12g(根據Vanderzand 1962))表面，所述餌料分配在Costar 48孔平板孔中並允許其固化。將25μl上清液溶液加到每個孔的表面(1cm2)。每個孔放置一個新生(L1一齡期)昆蟲幼蟲，每個樣品使用18-20個幼蟲。保持該培養皿在25℃±1℃，7天後記錄死亡率(死亡幼蟲對活的幼蟲的百分數)。利用TB和標準餌料作為陰性對照。
結果(下面表1中所示)表明菌株BTS01099E，BTS00327D和BTS02245J的無細胞上清液顯示了對煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)和歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼蟲的毒性。此外，菌株BTS02245J的上清液還顯示了對草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)幼蟲的毒性，BTS00327D的上清液顯示了對小地老虎(Agrotisipsilon)幼蟲的毒性。
表1

Hv煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，Hz美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)；On歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，Sf草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)；Ai小地老虎(Agrotis ipsilon)；nt沒有測定。
陰性對照(標準餌料)BTS02245JHv 9％，Hz 0％，On 0％，Sf 0％BTS00327DHv 10％，Hz 6％，On 4％，Ai 0％BTS01099EHv 10％，Hz 0％，On 0％其它的觀測項目gi幼蟲的生長抑制(7天後，活的幼蟲仍舊在L1/L2齡期)ir幼蟲的無規律生長(7天後，活的幼蟲一部分在L1/L2齡期，一部分在L3/L4齡期)菌株BTS02245J的無細胞上清液引起了煙芽夜蛾幼蟲11％和33％的死亡率，美洲棉鈴蟲幼蟲94％和50％的死亡率，歐洲玉米螟幼蟲50％的死亡率和草地粘蟲幼蟲78％的死亡率，表明該菌株的上清液有殺昆蟲活性，特別是抗美洲棉鈴蟲和草地粘蟲的殺昆蟲活性。毒性可能是由於該菌株分泌到培養基中的蛋白質引起的。
菌株BTS00327D的無細胞上清液引起了煙芽夜蛾幼蟲70％的死亡率，美洲棉鈴蟲幼蟲35％到78％的死亡率，歐洲玉米螟幼蟲100％的死亡率和小地老虎幼蟲100％的死亡率。因此，該菌株的上清液顯示了對至少4種不同的鱗翅目昆蟲物種的強毒性。毒性可能是由於該菌株分泌到培養基中的殺昆蟲活性蛋白質引起的。
菌株BTS01099E的無細胞上清液引起了煙芽夜蛾(H.virescens)幼蟲25％的死亡率，美洲棉鈴蟲(H.zea)幼蟲10％的死亡率，歐洲玉米螟(O.nubilalis)幼蟲46％的死亡率，表明該菌株的上清液有抗不同鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲物種的毒性活性。毒性可能是由於該菌株分泌到培養基中的殺昆蟲活性蛋白質引起的。
實施例3isp3基因的克隆從菌株BTS01099E克隆編碼ISP3-1099E的核苷酸序列製備菌株BTS01099E的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性鹼性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)後，將範圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然後，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌(E.coli)XL1-Blue細胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上鋪轉化體，選擇白色菌落用於濾膜雜交試驗。然後，用如下製備的DIG標記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來源於菌株BTS01099E的細胞作為模板進行PCR。凝膠純化所得的擴增產物，並且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標記的dNTPs和與第一次PCR反應中相同的引物，使用所得的質粒做為PCR反應中的模板。在雜交反應中使用適當量的該擴增產物。
鑑定含有包含全長isp3基因的質粒的陽性菌落後，利用染料終止子標記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測序儀測定該基因的序列。測定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.1中所示的是在陽性菌落的克隆DNA片段中發現的開放讀框序列(isp3-1099E)。發現該DNA序列編碼SEQ ID No.2中所示的新的蛋白質(ISP3-1099E)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲活性的原因，在細菌菌株中表達該序列，在昆蟲生物測定中測定重組菌株的上清液或細胞裂解液的殺昆蟲活性。
從菌株BTS00327D克隆編碼ISP3-327D的核苷酸序列製備菌株BTS00327D的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性鹼性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)後，將範圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然後，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌(E.coli)XL1-Blue細胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上塗轉化體，選定白色菌落用於濾膜雜交試驗。然後，用如下製備的DIG標記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來源於菌株BTS00327D的細胞作為模板進行PCR。凝膠純化所得的擴增產物，並且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標記的dNTP和與第一次PCR反應中相同的引物，使用所得的質粒做為PCR反應中的模板。在雜交反應中使用適當量的該擴增產物。
鑑定含有包含全長isp3基因的質粒的陽性菌落後，利用染料終止子標記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測序儀測定該基因的序列。測定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.3中所示的是在陽性菌落的克隆DNA片段中發現的開放讀框序列(isp3-327D)。發現該DNA序列編碼SEQ ID No.4中所示的新的蛋白質(ISP3-327D)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲活性的原因，在細菌菌株中表達該序列，在昆蟲生物測定中測定重組菌株的上清液或細胞裂解液的殺昆蟲活性。
從菌株BTS02245J克隆編碼ISP3-2245J的核苷酸序列製備菌株BTS02245J的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性鹼性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)後，將範圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然後，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌XL1-Blue細胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上塗轉化體，選定白色菌落用於濾膜雜交試驗。然後，用如下製備的DIG標記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來源於菌株BTS02245J的細胞作為模板進行PCR。凝膠純化所得的擴增產物，並且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標記的dNTP和與第一次PCR反應中相同的引物，使用所得的質粒做為PCR反應中的模板。在雜交反應中使用適當量的該擴增產物。
鑑定含有包含全長isp3基因的質粒的陽性菌落後，利用染料終止子標記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測序儀測定該基因的序列。測定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.5中所示的是在陽性菌落的克隆DNA片段中發現的開放讀框序列(isp3-2245J)。發現該DNA序列編碼SEQ ID No.6中所示的新的蛋白質(ISP3-2245J)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲活性的原因，在細菌菌株中表達該序列，在昆蟲生物測定中測定重組菌株的上清液或細胞裂解液的殺昆蟲活性。
實施例4ISP3蛋白質在大腸桿菌中的重組表達將SEQ ID No.1(isp3-1099E)，SEQ ID No.3(isp3-327D)和SEQ ID No.5(isp3-2245J)亞克隆到表達載體中位於cry1Ab啟動子的控制下，並且在大腸桿菌菌株WK6中表達。在亞克隆期間，在ATG起始密碼子處引入NcoI限制位點，因此將SEQ ID No 2，SEQ ID No 4和SEQ ID No.6的第二個胺基酸從天冬醯胺(Asn)改變為天冬氨酸(Asp)。
轉化的大腸桿菌的細胞裂解液的SDS-PAGE分析證明三個基因都產生了預期分子量(±88kDa)的蛋白質。利用未轉化的大腸桿菌wK6的細胞裂解液做為陰性對照。
如實施例5所述，在昆蟲測定(表面汙染測定)中使用表達isp3-327D和isp3-1099E的重組大腸桿菌培養物的細胞裂解液。在下面的表2中概述了該結果。加號表示超過陰性對照的顯著性昆蟲死亡率。
表2

Hz美洲棉鈴蟲，Hv煙芽夜蛾，Sf草地粘蟲，Dvv玉米根蟲(Diabroticavirgifera virgifer)，Ag藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
生物測定Hz在48多孔Costar平板中，在實夜蛾屬食物上表面汙染，25μl/孔(1cm2)，每濃度18×1L1，Hv在24多孔Costar平板中，在實夜蛾屬食物上表面汙染，50μl/孔(2cm2)，每濃度20×1L1，Sf在48多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面汙染，25μl/孔(1cm2)，每濃度18×1L1，Ag在24多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面汙染，50μl/孔(2cm2)，每濃度12×2L1，在25±1℃溫育；7天後計數。
對於ISP3-327D和ISP3-1099E蛋白質，在利用美洲棉鈴蟲，煙芽夜蛾，草地粘蟲和藜豆夜蛾的表面汙染測定中發現了顯著的死亡率。此外，表達ISP3-327D或ISP3-1099E的重組大腸桿菌的沒有稀釋的細胞裂解液顯示了抗歐洲玉米螟的顯著性死亡率(與對照WK6的0％的死亡率比較，對於ISP3-327D是50％(gi)死亡率，對於ISP3-1099E是26％(gi)的死亡率)。
實施例5ISP3蛋白質在Bt中的重組表達將SEQ ID No.1(isp3-1099E)和SEQ ID No.5亞克隆到穿梭載體中，並且在晶體缺陷型的Bt菌株(IPS 78/11或Berliner 1715cry-)中表達。在生物測定中，利用此未轉化的Bt菌株的上清液做為陰性對照。
利用上述(實施例2)和下述(以測定LC50值)表面汙染測定法，測定重組Bt菌株的無細胞培養物上清液抗鱗翅目昆蟲幼蟲，特別地抗煙芽夜蛾，美洲棉鈴蟲，歐洲玉米螟，草地粘蟲，小地老虎，棉花紅鈴蟲和藜豆夜蛾(A.gemmatalis)的毒性。
如下獲得重組Bt菌株的上清液。在28℃，在含有紅黴素(20μg/ml)的LB瓊脂板上過夜生長Bt菌株。對於小規模培養，接種含有紅黴素(20μg/ml)的20ml TB培養基，在28℃，在每分鐘約70轉的旋轉平臺上生長65小時。65小時後，向培養物添加蛋白酶抑制劑混合物。該混合物具有下面的組分(所給的體積為添加到一份20ml培養物所需的體積)200μlPMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)/ε-氨基-正己酸(500mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巰基乙醇(14M)。
然後，在3000rpm，離心已經添加了蛋白酶抑制劑混合物的培養基20分鐘。在一些情況下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)濃縮上清液約4倍。
對於美洲棉鈴蟲和煙芽夜蛾，在表面汙染測定中利用下面的人工餌料水1L，瓊脂20g，大豆粉81g，麥胚36g， Wesson鹽混合物10g，蔗糖14.7g，Nipagin 1g，山梨酸1.1g，Vanderzant vit.mix.9.5g，玉米油5ml，制黴菌素0.06g，金黴素0.17g。
在用於其它鱗翅目昆蟲的表面汙染測定中，利用下面的人工餌料水1L，瓊脂20g，玉米粉112g，麥胚28g，酵母30g，山梨酸1.2g，Nipagin 1g，金黴素0.06g，制黴菌素0.03g，抗壞血酸4.8g。
在Costar 24多孔板的孔中分配人工餌料，使其固化。將50μl稀釋的上清液施用到每個孔的表面上(2cm2)。將1或2隻幼蟲(L1一齡)放置到每個孔上(這取決於物種，例如對於歐洲玉米螟是2隻幼蟲/孔)，每個上清液稀釋物使用約20到24隻幼蟲。檢測範圍在約4050到0.21ng/cm2的6到8個上清液稀釋物(稀釋倍數約是3)。保持該培養皿在25℃±1℃，7天後記錄死亡率(死亡幼蟲對活的幼蟲的百分數)。利用TB和標準餌料做為陰性對照。利用程序POLO PC(來自LeOra Software，1987，Berkely，California)，用probit分析計算LC50值和/或LC90值。LC50值是當殺死50％試驗的昆蟲幼蟲時的總上清液蛋白質濃度。
生物測定表明克隆序列isp3-1099E和isp3-2245J編碼的蛋白質各自都引起了抗所選自鱗翅目昆蟲的顯著性殺昆蟲活性。
將SEQ ID No.3(isp3-327D)亞克隆到穿梭載體中，並且在晶體缺陷型Bt菌株IPS78/11中表達。在生物測定中，利用此未轉化的Bt菌株的上清液做為陰性對照。
SDS-PAGE分析表明培養物上清液含有分子量接近ISP3-327D蛋白質的計算分子量(±88kDa)的蛋白質。
利用實施例2中所述的表明汙染測定法，表達SEQ ID No.3(isp3-327D)的Bt菌株IPS78/11的無細胞培養物上清液顯示了抗歐洲玉米螟(On)，棉花紅鈴蟲(Pg)和美洲棉鈴蟲(Hz)的顯著性殺昆蟲活性，如表3中所示表3

gi幼蟲的生長抑制/Dvv玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera)
生物測定在TB中26小時培養及隨後加入蛋白酶抑制劑混合物後，利用濃縮的上清液進行上述表面汙染測定。實夜蛾屬人工餌料(如上述)用於美洲棉鈴蟲，而littorals人工餌料用於歐洲玉米螟和棉花紅鈴蟲。對於美洲棉鈴蟲和歐洲玉米螟，使用48孔Costar板，25μl/孔(1cm2)，18個孔，每孔1隻L1幼蟲。對於棉花紅鈴蟲，使用24孔Costar板，50ul/孔(2cm2)，12個孔，每孔2隻L1幼蟲。Dvv人工餌料(如上述)用於Dvv，24孔板中，50μl/孔(2cm2)，6個孔，每孔4隻L1幼蟲。
生物測定表明克隆序列isp3-327D編碼的蛋白質具有抗所選鱗翅目昆蟲的顯著性殺昆蟲活性。
實施例6ISP3-327D的進一步鑑定表達SEQ ID No.3(isp3-327D)的晶體缺陷型Bt菌株IPS78/11的上清液用於檢測ISP3-327D蛋白質的胰蛋白酶消化能力和所得到片段的毒性。如SDS-PAGE分析所測定，轉化的IPS78/11的培養物上清液的胰蛋白酶處理產生了約65kDa和約23kDa的兩條主要條帶。
在抗美洲棉鈴蟲的表面汙染測定中，利用胰蛋白酶處理的上清液(4小時處理；用終濃度0.1mM的PMSF終止反應)和沒有被胰蛋白酶處理的上清液。在48多孔板的實夜蛾屬食物上進行表面汙染測定(25μl/孔；1cm2)。檢測6種上清液稀釋度。每個稀釋度18個孔，每個孔使用1個L1幼蟲。在7天後，在25±1℃溫育後，計算死亡率。
沒有處理的和胰蛋白酶處理的ISP3-327D蛋白質的LC50值顯示了90％置信區間的重疊，表明胰蛋白酶處理的蛋白質保留了抗美洲棉鈴蟲的毒性活性。
實施例7重組ISP3蛋白質的稻昆蟲生物測定在上述大腸桿菌中表達isp3-1099E(SEQ ID No.1)、ISP3-327D(SEQID NO.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)序列。
在昆蟲生物測定中，檢測重組大腸桿菌的細胞裂解液抗4種鱗翅目水稻害蟲的活性。每種蛋白質檢測5到6個劑量。
(a)三化螟的生物測定從稻田收集三化螟成蟲。收集成蟲產出的卵，在30℃保持在培養皿中以孵化。在生物測定中使用新孵出的幼蟲。
利用6cm的水稻莖鞘。從敏感品種TN1新切割的水稻莖上切下6cm長的葉鞘段。沿著一個鞘外殼(sheath cover)分別將片段的最內部分浸入不同劑量蛋白質中30秒。在樣品試管(7cm長；2.5cm直徑)中的2cm瓊脂凝膠上垂直固定處理的莖鞘。向每個處理的莖加入10-15隻三化螟新生幼蟲，密封試管，溫育5天。5天後，計算存活和死亡的幼蟲數量。
(b)稻縱卷葉螟的生物測定從北部印度的稻田收集昆蟲，在溫室中水稻植物上飼養昆蟲幼蟲。將出現的成蟲限於產卵室中，將產卵的植物保持在有水淺盤中進行幼蟲孵化。一天齡的幼蟲用於生物測定中。
利用從分櫱期水稻植物新切割的葉片，在圓柱形小室中進行生物測定。從水稻分櫱枝中間輪生體切下8cm長的葉片。將葉片放置於小室中，並且施用不同的蛋白質劑量。30分鐘後，向每個葉片上加5到10隻幼蟲。每個蛋白質劑量至少利用3片葉片。溫育後5天，計算死亡和存活幼蟲的數量。
(c)大螟生物活性測定從北部印度的稻田收集昆蟲，在水稻植物上飼養。利用幹豆粉、釀酒酵母、山梨酸、抗壞血酸、羥苯甲酸甲酯、瓊脂和水製成的人工餌料，在小玻璃瓶(直徑7.5cm×2.5cm)中進行生物測定。將餌料分配到小玻璃瓶中不超過2cm的深度。每種蛋白質劑量至少製備3個小玻璃瓶。將40μl試驗劑量均勻地塗抹到每個小玻璃瓶的餌料表面，進行1小時的乾燥。每個小玻璃瓶添加10到15隻一齡期大螟幼蟲。7天後，計算死亡和存活幼蟲的數量。
(d)Corn Spotted Stem Borer(Chilo partellus)的生物活性測定
在由紅豆粉、釀酒酵母、山梨酸、高梁葉粉、抗壞血酸、甲基對羥基苯甲酸、維生素、麥胚油、Wesson鹽混合物，瓊脂，甲醛和水製成的人工餌料上飼養昆蟲。在生物測定中使用來自這些培養物的新生幼蟲。如用於大螟所述方式進行生物測定。
(e)水稻昆蟲生物測定的結果在下面表4中概述了昆蟲生物測定的結果，表明ISP3-327D和ISP3-1099E對4種鱗翅目水稻害蟲，即，三化螟，稻縱卷葉螟，大螟和Corn Spotted Strn Borer(Chilo partellus)具有高度毒性。而且，ISP3-2245J蛋白質顯示了對3種鱗翅目水稻害蟲，即三化螟，稻縱卷葉螟和大螟的顯著性毒性，而沒有檢測到ISP3-2245J蛋白質抗Chilo partellus的毒性。
表4

YSB三化螟，LF稻縱卷葉螟，PSB大螟，SSBSpotted Stem Borer；加號(+)表示與陰性對照比較顯著性的死亡率。
實施例8轉化植物中ISP3蛋白質的產生構建包含植物可表達啟動子的植物表達載體，該啟動子可操作地連接編碼ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J(或其毒性片段或變異體)的DNA序列和3』聚腺苷酸化信號。將前導序列，諸如來源於碧冬茄屬(Petunia)(Harpster等，1988)葉綠素a/b結合蛋白質基因的前導序列插入isp3 DNA的5』。優選地，例如，如WO94/24264中所述，改變isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J的密碼子使之適於宿主植物(例如，玉米、棉花或水稻)的密碼子使用。
用於驅動isp3基因的啟動子選自組成型啟動子CaMV 35S(Hull和Howell，1987)，玉米泛素啟動子，水稻肌動蛋白啟動子和木薯脈花葉病毒啟動子。使用的3』35S、3』nos(Depicker等，1982)、3』ocs或3』基因7做為3』轉錄終止和聚腺苷酸化信號。對於農桿菌介導的轉化，將表達盒子插入T-DNA載體的左右邊界序列之間。
玉米(Zea mays)，棉花(陸地棉或海島棉和稻(Oryza sativa)的轉化。
如US 6,140,553中所述，通過農桿菌介導的轉化法穩定地轉化玉米細胞，這裡將這篇文獻併入為參考文獻。如WO00/71733所述，通過農桿菌介導的轉化穩定地轉化棉花細胞，這裡併入這篇文獻為參考文獻。如WO92/09696所述穩定地轉化水稻細胞。
如上述文獻所述，再生轉化的細胞和小植株。對於另外含有選擇性標記基因，諸如除草劑抗性基因，例如賦予對草甘膦抗性的2mEPSPS(EP0508 909和EP 0 507 698，併入其為參考文獻)或賦予對草丙膦銨抗性的bar或PAT基因(EP0242236和EP0242246，併入作為參考)的構建體，在含有選擇性試劑的選擇性培養基上生長轉化的細胞，這樣大多數選定的再生體都是轉化的。
通過ELISA、Southern印跡、Northern印跡和/或PCR分析從再生體中選定表達isp3基因的轉化體。然後針對抗鱗翅目昆蟲害蟲的殺昆蟲活性，(利用生物測定)選擇轉化事件，特別是單拷貝事件。與非轉化的對照植物比較，含有嵌合基因isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的後代植物顯示提高的抗鱗翅目昆蟲的抗性。特別地，具有高水平昆蟲耐受性的植物表達高水平的ISP3蛋白質和isp3 mRNA。
進一步篩選轉化體的農藝學性狀(正常的表型、產量、植物體系結構(plant architecture)等)。種子增加後，在存在敏感昆蟲害蟲的不同地區進行轉化的玉米、棉花或水稻植物的田間試驗，證明在不同環境的田間條件下，表達ISP3蛋白質的植物具有增加的昆蟲耐受性。特別地，與沒有轉化的對照植物比較，在昆蟲害蟲的(人工或天然)的侵襲後，轉化植物的產量損失減少。
為了產生具有廣泛殺昆蟲活性的植物，ISP3表達事件可以互相雜交並與表達具有不同，優選地互補殺昆蟲譜的殺昆蟲蛋白質的其它轉基因植物雜交。利用針對一系列不同昆蟲害蟲的生物測定法，測定雜交後代的殺昆蟲活性。以此方式產生抗期望的一系列昆蟲的具殺昆蟲活性的植物。
本發明不限於上述玉米、棉花、大豆或水稻植物、轉化方法、載體構建體(啟動子、3』末端等)和所用的特定ISP3蛋白質或DNA序列。本發明包括保留殺昆蟲活性的ISP3蛋白質的變異體或等同物。
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序列表110拜爾生物科學公司(Bayer BioScience N.V.)120新的蘇雲金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白質130isp3150US 60/3662761512002-03-22150US 60/4239991512002-11-061606170PatentIn version 3.021012112364212DNA213人工序列220
223蘇雲金芽孢桿菌isp3-1099E的核苷酸序列4001atgaacatga ataatactaa attaaacgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120gatacaggtg gtaatctaac cctagacgaa atcttaaaga atcagcagtt actaaatgag 180atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagcct gcaaatagaa 420tacttaagta aacaattgca agaaatttcc gataagttag atattattaa cgtaaatgtt 480cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactc taaaagtaaa agaggatgga 600tcccctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aattagcgaa aagtgtaaca 660aaaaatgaag tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcgg aattaattgc taaagaaaat 780gtgaaaacaa gtggcagtga ggtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgga aattattagg attagcagat 900attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgtaaa agctaaagga1020
agcgatagag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gatatgcttt ggttggattt1080gaaatgagta atgattcaat gacagtatta aaagcatatc aggccaagct aaagcaagat1140tatcaagttg ataaggattc attatcagaa attgtctatg gtgatatgaa taagttatta1200tgtccggatc aatctgaaca aatatattat acaaataata tagcatttcc ccgtgaatat1260gttattacta aacttacttt tacaaaaaaa atgaacagtt taaggtatga ggcgacagct1320aatttttatg attcttctac aggagatatg gatctaaata agacaaaagt agaatcaagt1380gaagcggagt atagtaggct aagtgctagt aatgatggag tctatatgcc gttaggtctt1440atcagtgaaa catttttgac tccaattaat ggttttggac tcgtagtcga tgaaaattca1500agattagtaa ctttaacatg taaatcatat ttaagagaga tattattagc aacagactta1560agtaataaag aaactaaatt gattgtccca cctaatggtt ttattagcaa tattgtagaa1620aatgggaact tagagggaga aaacttagag ccgtggaaag caaataacaa aaatgcgtat1680atagatcata caggcggcgt aaaaggaact aaagtattat atgttcataa ggatggagag1740ttctcacaat ttattgggta taaattgaaa tcgaaaacag aatatgtaat tcaatatatt1800gtaaaaggaa aagctgttat ttatttaaaa gatgaaaaaa atggggatta catttatgaa1860gaaataaata atgaattaga agattttcaa acggttacta aacgttttat tacaggaaca1920gattcttcag gagttcattt aatttttacc agtcaaaatg gcgaggaagc attcgggggg1980aactttatta tttcagaaat taggccatcc gaagagttat taagtccaga attgattaag2040tcggatgctt gggttggaac tcagggagct tggaattcag ggaattctct cacaatttat2100actaatacaa atggaacctt tcgacaaaac cttccgttag aaagttattc aacttatagt2160atgaacttta atataactgg atttggcaag gtgacaataa ggaattctcg tgaagtatta2220tttgaaaaga acttttccca gctttcgcct aaagattatt ctgaaaaatt tacaactgca2280gccaataata ccggattcta tgtagagctt tctcgcggaa cgcagggtgg taatataact2340ttccgagatt tttcaattaa gtaa 23642102211787212PRT213人工序列220
223蘇雲金芽孢桿菌ISP3-1099E的胺基酸序列4002Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe1 5 10 15Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
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attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga1020agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt ggttgggttt1080gaaatgagca atgattcaat cacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat1140tatcaagttg ataaggattc cttatcggag gttatttatg gtgatacgga taaattattt1200tgtccagatc aatctgaaca aatatattat acaaataaca tagtattccc aaatgaatat1260gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg1320aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt1380gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatggag tgtatatgcc attaggtgtc1440atcagtgaaa catttttgac tccgataaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca1500agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta1560agcaataaag aaactaaatt gatcgtccca ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag1620aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat1680gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga1740ttttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact1800gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa1860gatacaaata ataatttaaa agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact1920gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat1980aaatttacaa ttttagaaat taagcctgcg gaggatttat taagcccaga attaattaat2040ccgaattctt ggattacgac tccaggggct agcatttcag gaaataaact tttcattaac2100ttggggacaa atgggacctt tagacaaagt ctttcattaa acagttattc aacttatagt2160ataagcttta ctgcatcagg accatttaat gtgacggtaa gaaattctag ggaagtatta2220tttgaacgaa gcaaccttat gtcttcaact agtcatattt ctgggacatt caaaactgaa2280tccaataata ccggattata tgtagaactt tcccgtcgct ctggtggtgg tggtcatata2340tcatttgaaa acgtttctat taaataa23672104211788212PRT213人工序列220
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223蘇雲金芽孢桿菌ISP3-2245J的胺基酸序列4006Met Asn Met Asn Asn Ala Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe1 5 10 15Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp20 25 30Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Ser Asn Leu Thr Leu35 40 45Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys50 55 60Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn65 70 75 80Leu Asn Thr Glu Leu Ala Lys Gln Ile Leu Lys Val Ala Asn Glu Gln85 90 95Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Ser100 105 110Met Leu Lys Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val115 120 125Met Lys Gln Asn Tyr Val Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys130 135 140Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val145 150 155 160Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Met165 170 175Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr180 185 190Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Pro Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu195 200 205Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val210 215 220Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly225 230 235 240Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile245 250 255Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr260 265 270Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr275 280 285Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr290 295 300Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
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1.包含與SEQ ID No.4具有至少91％序列同一性的胺基酸序列的分離的殺昆蟲蛋白質。
2.包含與SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性的胺基酸序列的分離的殺昆蟲蛋白質。
3.包含與SEQ ID No.2具有至少91％序列同一性的胺基酸序列的分離的殺昆蟲蛋白質。
4.包含SEQ ID No.2的胺基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲蛋白質。
5.包含SEQ ID No.4的胺基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲蛋白質。
6.包含SEQ ID No.6的胺基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲蛋白質。
7.如前述權利要求所述的蛋白質，其中所述蛋白質具有抗至少一種選自以下的昆蟲物種的殺昆蟲活性美洲棉鈴蟲、煙芽夜蛾、歐洲玉米螟、草地粘蟲、小地老虎、棉花紅鈴蟲、三化螟、稻縱卷葉螟、大螟、Chilopartellus和藜豆夜蛾。
8.編碼權利要求1至6任一項所述蛋白質的分離的核酸序列。
9.編碼權利要求1至6任一項所述蛋白質的分離的核酸序列，其中所述蛋白質具有抗至少一種選自以下的昆蟲物種的殺昆蟲活性美洲棉鈴蟲、煙芽夜蛾、歐洲玉米螟、草地粘蟲、小地老虎、棉花紅鈴蟲、三化螟、稻縱卷葉螟、大螟、Chilo partellus和藜豆夜蛾。
10.包含與SEQ ID No.1具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
11.包含與SEQ ID No.3具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
12.包含與SEQ ID No.5具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
13.包含SEQ ID No.1的第1到2364位核苷酸的分離的核酸序列。
14.包含SEQ ID No.3的第1到2367位核苷酸的分離的核酸序列。
15.包含SEQ ID No.5的第1到2361位核苷酸的分離的核酸序列。
16.包含編碼殺昆蟲蛋白質的核酸序列的分離的核酸，其中該殺昆蟲蛋白質包含在嚴格雜交條件下與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQID NO.5雜交的核酸序列的翻譯產物的胺基酸序列。
17.編碼權利要求1至6任一項所述蛋白質的分離的核酸序列，其中所述核酸序列是合成序列，該合成序列已被優化用於單子葉植物或雙子葉植物中的表達。
18.包含可操作地連接權利要求8至17任一項所述核酸序列的啟動子序列的嵌合基因。
19.包含可操作地連接核酸序列的啟動子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.2的胺基酸序列或其最小毒性片段。
20.包含可操作地連接核酸序列的啟動子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.4的胺基酸序列或其最小毒性片段。
21.包含可操作地連接核酸序列的啟動子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.6的胺基酸序列或其最小毒性片段。
22.包含權利要求18至21任一項所述嵌合基因的載體。
23.包含權利要求18至21任一項所述嵌合基因的轉基因宿主細胞。
24.如權利要求23所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞。
25.如權利要求23所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是微生物。
26.包含權利要求18至21任一項所述嵌合基因的轉基因植物。
27.如權利要求26所述的植物，其中所述植物是玉米、棉花、稻或大豆植物。
28.保護植物免受昆蟲損害的方法，包括用殺昆蟲蛋白質接觸所述植物，其中所述蛋白質具有SEQ ID No.2的胺基酸序列。
29.保護植物免受昆蟲損害的方法，包括用殺昆蟲蛋白質接觸所述植物，其中所述蛋白質具有SEQ ID No.4的胺基酸序列。
30.保護植物免受昆蟲損害的方法，包括用殺昆蟲蛋白質接觸所述植物，其中所述蛋白質具有SEQ ID No.6的胺基酸序列。
31.如權利要求28至30任一項所述的方法，其中所述殺昆蟲蛋白質由整合在所述植物的基因組中的嵌合基因編碼。
32.如權利要求28至30任一項所述的方法，其中給所述植物外部施用所述蛋白質。
33.如權利要求28至30任一項所述的方法，其中所述植物是玉米、棉花、大豆或稻植物。
34.包含權利要求8所述核酸序列的蘇雲金芽孢桿菌菌株。
35.包含權利要求1至6任一項所述蛋白質的殺昆蟲組合物，當給植物外部施用這種殺昆蟲組合物時，與沒有施用這種組合物的對照植物比較，該組合物增加植物對昆蟲損害的抗性。
36.進化編碼ISP3蛋白質的核酸序列的方法，該方法包括步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6的胺基酸序列、或SEQID No.2和/或4和/或6的胺基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQID No.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段的群體以形成重組核酸分子，(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲活性的蛋白質的重組核酸分子，(d)用在步驟(c)中選擇的重組核酸分子重複步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經發現編碼的蛋白質具有期望的殺昆蟲特性的重組核酸分子。
全文摘要
本發明涉及植物害蟲控制領域，特別是昆蟲控制。提供了來源於蘇雲金芽孢桿菌的、編碼殺昆蟲蛋白質的核苷酸序列。進一步提供了利用所述核苷酸序列控制植物昆蟲害蟲的方法和手段。
文檔編號A01N65/00GK1642977SQ03806654
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月20日 優先權日2002年3月22日
發明者G·阿爾諾, A·伯特斯, K·德魯德爾, S·萬內斯特, J·范瑞 申請人:拜爾生物科學公司