體外誘導胚胎幹細胞分化為心肌細胞的方法
2023-05-16 04:45:31 1
專利名稱：體外誘導胚胎幹細胞分化為心肌細胞的方法
技術領域：
本發明屬幹細胞組織工程領域，具體涉及一種誘導胚胎幹細胞分化為心肌細胞的方法。
背景技術：
心肌缺血是臨床治療中常見的心臟損傷類型，為實現缺血心肌在結構與功能的再修復，最近有學者提出細胞水平心肌重塑(cellular cardiomyocyteplasty，CCM)即移植外源細胞至受損心肌，通過促進和提高心肌細胞再生能力及血運供給以減少心室重構、改善心肌功能。迄今已有多種細胞被應用於CCM研究，但均存在來源受限，數量不足等問題。因此尋找更佳來源的供體細胞已成為CCM研究應用的關鍵。幹細胞作為一類兼具自我更新和多向分化潛能的細胞群體，近年來愈來愈受到國內外學者的關注。目前，通過對幹細胞進行體外誘導和人工操作，科學家們正致力於實現對某些損傷性疾病的細胞替代治療。
1981年，小鼠胚胎幹細胞系(ES)的建立開闢了研究的新紀元。基於ES細胞本身所具有的無限增殖能力及分化的全能性，研究者嘗試著將ES細胞定向誘導分化為心肌細胞，並應用於缺血性心肌損傷的細胞治療。許多實驗室的研究工作已經表明ES細胞可以自發性分化形成跳動的心肌合胞體，其表型特徵及超微結構皆與成熟的心肌細胞相類似。將ES源性心肌細胞移植至mdx小鼠，同時發現其能夠形成穩定的心肌細胞移植體。可見，以ES細胞作為CCM的供體細胞是相當有應用前景的。
但是，在ES形成的擬胚體(EB)只有約5％的細胞可自發分化為心肌細胞，因此，提高ES來源心肌細胞的誘導分化率以及實現分化細胞的體外富集成為CCM研究領域的主要制約因素。目前，已有學者報導一定劑量5-氮胞苷、維甲酸或二甲基亞碸等均可作為誘導分化劑而成功地誘導出小鼠心肌細胞，從而使誘導分化率得到不同程度的提高。此外，還有一些細胞因子也應用於上述相關研究。儘管如此，由於ES細胞其定向分化的機制尚未明確，各種誘導分化劑的作用機理也並不清晰，所以在應用ES源心肌細胞進行心肌組織工程等下遊工作時，通過上述誘導分化劑所獲得的心肌細胞的數量並不理想。基於此，誘導ES細胞分化為心肌細胞的方法有待進一步更新與完善。
發明內容
本發明的目的是提供一種獲得胚胎幹細胞來源的心肌細胞的體外誘導方法，其特徵是將帶有螢光標記的小鼠胚胎幹細胞(ES-GFP)與新生鼠原代心肌細胞和成纖維細胞進行體外共培養，於體外創造胚胎幹細胞向心肌細胞分化誘導分化的微環境，從而促進ES細胞向心肌細胞的誘導分化。其方法為大鼠心肌細胞共培養體系的建立所述原代心肌細胞取自1-2日齡新生大鼠，經胰蛋白酶消化製備為1-2×105/ml的細胞懸液，接種至明膠包被的培養皿。體外培養48-72小時，其間經過0.1mmol/ml BrdU處理以抑制成纖維細胞的過度增殖。PBS充分衝洗後將擬胚體加入到該培養體系中進行誘導分化培養。129小鼠源性小鼠胚胎幹細胞建首先經過去飼養層細胞後懸浮培養成為擬胚體，6天後再與原代心肌細胞進行共培養。因其帶有GFP報告基因，因此ES源心肌細胞易於與心肌細胞相鑑別。
誘導胚胎幹細胞向心肌細胞分化復甦ES-GFP細胞，常規生長培養基培養1-2天，胰酶消化，1∶3傳代。2天後收集細胞，將細胞懸液置於100mm細菌級培養皿內(0.1％明膠預處理)懸浮培養30分鐘，待大部分飼養層細胞貼壁後，重新吸取細胞懸液至另一細菌級培養皿懸浮培養，該步驟可去除飼養層細胞，以後定期換液，懸浮培養5天後，形成擬胚體(EB)。將上述EB加入到備用的原代心肌細胞培養體系中(約20個/皿)，同時設實驗對照組對照組1∶10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；對照組215％H-DMEM。各實驗及對照組均設3個平行皿。
所述方法的優點為1)建立小鼠胚胎幹細胞與原代心肌細胞的共培養體系，細胞來源不受限制，取材方便，操作簡單易行。其中，原代心肌細胞取材自新生大鼠心臟，分離技術已經成熟，過程中無須克服成纖維細胞的汙染，因為成纖維細胞的存在有助於在體外進一步模擬構建ES細胞誘導分化為心肌細胞的微環境。2)該體外誘導分化的培養體系成分構成比較簡單，除含15％胎牛血清的H-DMEM培養基外，不需要添加任何的細胞因子或其他的誘導分化劑，而這些促分化成分的經濟價格比較昂貴，因此該培養方法在實際科研工作中經濟適用。3)誘導分化為心肌細胞的比率比較高(可達50-60％)，有助於獲得理想數量的供體細胞。本發明利用與原代心肌細胞共培養體系，於體外創造ES誘導分化的微環境，從而促進ES細胞向心肌細胞的分化，以獲得理想數量的ES源心肌細胞，最終提供基礎科研、臨床應用之所需。
具體實施例方式
實施例體外共培養誘導小鼠ES細胞分化為心肌細胞1)新生大鼠心肌細胞的分離和培養實驗準備無菌解剖剪2把；5號鉗子2把；調溫攪拌器；25ml帶塞錐形瓶(攪拌子)；冰臺；一次性無菌塑料培養皿試劑H-DMEM培養基(Gibico)，胎牛血清胰酶的配製鹽水A 90毫升1％胰酶1∶30010毫升使用當天配製，無菌過濾。
鹽水A配製Nacl 8gKcl 0.3gNaHCO3 0.35g葡萄糖 1g溶解於1L蒸餾水中，無菌過濾備用。
具體操作流程(該操作流程適用於20-30隻新生鼠)冰臺經乙醇擦拭後放入超淨臺，3個60mm組織培養皿內各裝5ml鹽水A，置於冰臺，分別標記1，2，3號↓新生鼠經75％乙醇處理後操作間內無菌取出心臟，置於1號培養皿內去除結締組織及血塊，轉入2號漂洗，再到3號皿中。吸棄3號皿鹽水，加入2ml預熱胰酶，剪碎心臟組織↓將組織碎塊移入有攪拌子的錐形瓶，補加胰酶到10ml，置於37℃水浴，轉速60r/min，消化15min。所得主要為紅細胞，棄上清後重新加入胰酶10ml消化。吸管吹打，機械分散細胞，孵育10min↓取裝有10毫升預冷全培養基的離心管，轉移上清到離心管中停止消化。此為第一次收集到的分離細胞。餘下的組織塊繼續胰酶消化，重複消化細胞至散開所有細胞團↓離心收集細胞，吸棄上清後重懸細胞。細胞計數，接種密度調整為5-6×105/ml，將懸液轉移至經過0.1％明膠預處理100mm組織培養皿。孵育4-6小時後，可更換培養基過夜培養↓用含0.1mmol/ml BrdU的培養基處理48小時，以抑制成纖維細胞的過度增殖。後以0.1mol/LPBS緩衝液洗滌3-5次，備用2)ES細胞形成擬胚體準備工作常規ES細胞生長培養基(H-DMEM)；60mm無菌組織培養皿；小鼠成纖維細胞飼養層。具體操作流程復甦ES-GFP細胞，常規生長培養基培養1-2天，胰酶消化，1∶3傳代↓2天後收集細胞，將細胞懸液置於100mm細菌級培養皿內(0.1％明膠預處理)懸浮培養30分鐘，待大部分飼養層細胞貼壁後，重新吸取細胞懸液至另一細菌級培養皿懸浮培養，該步驟可去除飼養層細胞↓定期換液，懸浮培養5天後，形成擬胚體(EB)
3)共培養誘導ES-GFP向心肌細胞分化將上述EB加入到備用的原代心肌細胞培養體系中(約20個/皿)，同時設實驗對照組對照組1——10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；對照組2——15％H-DMEM。各實驗及對照組均設3個平行皿。
結果觀察到實驗組EB於2小時內完全貼壁，而對照組1和組2中EB在48小時後仍未完全貼壁。培養6-7天後，相差顯微鏡下可觀察到多個跳動的心肌細胞合胞體。其收縮節律為47--60次/分。具體見表不同組別ES細胞分化為心肌合胞體的數目比較組別 接種EB數目 心肌合胞體數目(個/皿) (個，X±SD)試驗組20 10.9±2.0對照組1*20 5.0±1.2對照組2**20 1±0.3(n＝3，實驗組與對照組比較，t檢驗分析P*＜0.05；P**＜0.01)結果表明大鼠心肌細胞共培養體系可顯著提高胚胎幹細胞向心肌細胞分化水平。
權利要求
1.體外誘導胚胎幹細胞分化為心肌細胞的方法，其特徵是包括胚胎幹細胞與原代心肌細胞的共培養體系的建立。
2.權利要求1中所述的胚胎幹細胞，其特徵是可以是人源的，也可以是小鼠的或是其它動物的。
3.權利要求1所述的原代心肌細胞，取材自1-2日齡新生大鼠活小鼠的心臟，其中可以包括有成纖維細胞。
4.權利要求1中所述的原代心肌細胞，其分離方法是新生鼠經75％乙醇處理後操作間內無菌取出心臟，置於1號培養皿內去除結締組織及血塊。剪碎心臟組織，加入預熱的0.05～0.25％胰蛋白胰酶，將組織碎塊移入有攪拌子的錐形瓶，補加胰酶，置於37℃水浴，消化5～15min。吸管吹打，機械分散細胞，孵育5～10min。離心收集細胞。
5.權利要求1中所述的原代心肌細胞與成纖維細胞培養體系，其特徵是通過0.1mmol/mlBrdU處理48小時，以抑制成纖維細胞的過度增殖。
6.權利要求1中所述的共培養體系，其特徵是可以是將胚胎幹細胞直接與心肌細胞接觸，或者在雙室培養裝置中共用培養液但不接觸。
全文摘要
本發明涉及建立一種體外誘導胚胎幹細胞分化為心肌細胞的方法，屬於幹細胞組織工程領域。即通過胚胎幹細胞與原代心肌細胞的共培養，構建體外誘導分化的微環境，以促進胚胎幹細胞向心肌細胞的分化。該方法可用於基礎科研，並為心肌組織工程提供種子細胞。
文檔編號C12N5/06GK1566332SQ0314789
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月30日 優先權日2003年6月30日
發明者王常勇, 王秀麗, 郭希民, 段翠密, 趙雲山 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所