開放式全細胞回收循環發酵生產光學純l-乳酸的方法

2023-05-16 18:56:06

專利名稱：：開放式全細胞回收循環發酵生產光學純l-乳酸的方法
技術領域：
：本發明屬於生物發酵工程
技術領域：
中L-乳酸的生產方法，尤其是涉及一種開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法。
背景技術：
：乳酸(C2H5OCOOH)，又名α-羥基丙酸。乳酸可以分為L-乳酸(左旋性)、D_乳酸(右旋性)和DL-乳酸(消旋性)。傳統上乳酸可用於食品、印染、製藥等領域。近年來，隨著白色汙染日益受到關注以及礦物質資源的不可再生性，以可再生資源為原料生產的可生物降解聚合物引起了人們的廣泛關注。其中，聚乳酸作為主要的生物可降解塑料之一，其物理性能與聚苯乙烯非常相似，有希望成為石油基塑料的替代物之一。可生物降解聚乳酸的生產需要高光學純度的L-乳酸，而目前高光學純度的L-乳酸的生產成本還比較高，這是造成可生物降解聚乳酸無法與石油基塑料競爭的重要因素之一。微生物發酵法是生產L-乳酸的主要方法。L-乳酸可以從澱粉、纖維質、有機垃圾等再生資源中甚至廢棄物中發酵獲得，原料的來源廣泛。同時，可以通過菌株篩選和改造，得到可生產高光學純度的L-乳酸的發酵生產菌株，生成的高光學純L-乳酸易於用於聚乳酸的合成。但是在大規模分批發酵過程中，每一批次發酵都需要在滅菌後的培養基中擴大培養多級種子，以保證發酵培養過程中有足夠的生產菌株細胞支持發酵生產的進行。多級種子培養不僅延長了發酵周期，還增加了種子罐等發酵設備的投入。此外，多級種子培養過程中的能量消耗尚無法避免。而在現代大規模發酵過程中，單罐發酵體積越來越大，種子培養體積也相應增大，種子培養過程中的能量消耗不容忽視。為了避免每一批次都要進行的多級種子培養，有報導提出半連續發酵的操作方式，即把部分發酵結束後的培養液作為下一批次發酵的種子。但是這種操作方式把發酵液中的代謝廢物帶入了新的發酵批次，容易引起發酵效率下降和菌株退化。針對這一問題，有報導提出細胞回收發酵操作，即將與發酵液分離後的菌體作為新的發酵批次的種子。目前，細胞回收發酵採用濾膜系統從發酵液中分離菌體。濾膜系統中的濾膜容易堵塞，必須定期更換。常規的細胞分離操作如旋轉離心如能用於細胞回收發酵，可簡化全細胞回收半連續發酵的操作。但目前通常採用的嗜中溫乳酸生產菌株在非無菌條件下的細胞回收時容易汙染雜菌，無法使用開放式細胞回收操作。
發明內容本發明提供了一種操作簡便、純度較高的開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案一種開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法，是以嗜熱乳酸生產菌株，優選凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCN22184為菌種進行開放式發酵，發酵結束後對發酵液進行離心，去除菌體的上清液即為含有高光學純度L-乳酸發酵液，離心後所得菌體再作為種子培養物接入下一批次發酵培養基中，以與上次發酵完全相同的發酵條件進行發酵培養，如此循環，得到光學純L-乳酸。本發明採用凝結芽孢桿菌作為發酵菌種，所述凝結芽孢桿菌(Baci1luscoagulans)CASHCGMCCNa2184已於2007年09月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，並已在中國專利CN200710176060.9中公開。所述發酵培養基配方為葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，餘量為水，pH值6.0。所述發酵條件為發酵溫度50°C55°C，發酵時間4048小時，攪拌轉速130150轉/分，其間自動流加重量比為30%40%鹼液控制發酵液pH值在6.06.5範圍內。所述發酵條件優選為發酵溫度50°C，發酵時間48小時，攪拌轉速150轉/分鐘，旋轉半徑33毫米，流加鹼液為重量比為40%的氫氧化鈉，發酵液pH值6.0。本發明突出特點是每次發酵液均在非無菌條件下以離心方式回收菌體並將菌體用於循環發酵。具體的，所述發酵結束後的發酵液以6，0008，000轉/分轉速在非無菌條件下離心20士2分鐘；所述離心轉速優選為8，000轉/分。所述循環發酵次數優選為28次。為獲得更好的發酵效果，所述凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNo2184菌種在發酵前還可先進行斜面培養和種子培養。用上述方法獲得的光學純L-乳酸也屬於本發明的保護範圍。本發明提供了一種開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法。本發明採用非無菌條件下回收菌體作為種子用於循環發酵。這種開放式全細胞回收技術可以採用常規的菌體分離單元操作如旋轉離心回收菌體，避免了膜單元的使用，降低了細胞回收費用，提高了細胞回收效率，使細胞回收操作更加簡便易行。開放式離心全細胞回收技術可以在非無菌條件下進行，降低了細胞回收操作對設備和環境的要求，可以利用現有設備進行細胞回收，減少了設備投資，降低了細胞回收操作複雜程度。本發明採用的芽孢桿菌屬於嗜熱乳酸生產菌，可以在培養基不滅菌的條件下進行開放式發酵生產高光學純度L-乳酸，這是由於其能夠在50°C以上生長並生成乳酸，而普通菌株不能在如此高溫條件下生長，即使在離心操作時混入雜菌，由於其高生長溫度，在以其為種子的後續發酵中也能夠成為優勢菌株，抑制雜菌生長，保證乳酸發酵的順利進行。嗜熱乳酸生產菌株不僅能夠實現開放式發酵，其高生長溫度和抗汙染能力還能夠使常規的菌體分離操作如旋轉離心能夠應用於全細胞回收發酵。而普通菌株在非無菌離心操作時容易被雜菌。此外，本方法實現了非無菌條件下以常規離心方式回收細胞作為循環發酵的種子，簡化了循環發酵細胞回收過程，有利於簡化操作，降低L-乳酸發酵生產設備投入。本發明光學純L-乳酸的生產方法明顯優於現有的光學純L-乳酸生產方法，具有純度高、低汙染、生產效率高、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，適合大面積推廣和應用。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。其目的是為了更好的理解本發明的內容，因此，所舉例的實例並不限制本發明的保護範圍。實施例1、開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，瓊脂15g/L，溶劑為水；所述斜面培養基的PH值為6.5，121°C滅菌20分鐘。種子培養基葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，碳酸鈣3g/L，溶劑為水；所述種子培養基的PH值為6.5，121°C滅菌20分鐘。發酵培養基葡萄糖130g/L，酵母粉10g/L，餘量為水；所述發酵培養基的pH值為6.0，發酵培養基沒有經過滅菌。用本發明開放式全細胞回收循環發酵的方法生產光學純L-乳酸，具體方法包括以下步驟1.斜面培養將凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184以常規方法接種於斜面培養基上，50°C培養12小時。2.種子培養將步驟1培養的菌株在無菌條件下用接種環接2環於裝有30mL種子培養基的IOOmL三角瓶中，搖床振蕩培養(150轉/分)12小時，培養溫度50°C。製得種子培養液。3.發酵培養(第一次發酵)將上述種子培養液以體積比10%的接種量接種到3升置於5升發酵罐中的發酵培養基(發酵培養基沒有經過滅菌)中，以培養溫度500C(50°C55°C均可)，攪拌轉速150轉/分(130150轉/分均可)，培養48小時(4048小時均可)，結束髮酵。培養過程中自動流加重量比為40%(30%40%均可)氫氧化鈉調節發酵液PH值維持在6.0(6.06.5均可)。4.細胞回收將步驟3中發酵液在非無菌條件下，以8，000轉/分(6，0008，000轉/分轉均可)離心20分鐘(20士2分鐘均可)回收菌體，上清液用於分離L-乳酸。5.重複發酵(第二次發酵)將回收的菌體作為種子培養物以體積比不低於5%的接種量接入下一批次發酵培養基中，以與第一次發酵完全相同發酵條件進行發酵培養，培養結束後離心回收菌體，上清液用於分離L-乳酸。6.發酵液檢測菌體濃度採用分光光度計於620nm處檢測。L-乳酸濃度採用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學院生物研究所)測定。L-乳酸光學純度採用AgilentllOO液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)分別測定發酵液中L-如酸和D-乳酸濃度，通過公式計算出L-乳酸光學純度。液相系統採用手性分離柱(日本三菱化學公司，MCIGEL-CRSlOff(3μ)4.6IDX50mm，光學異體分離用)，0.002mol/L硫酸銅為流動相，流量0.5mL/min,進樣量20μL，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L0625，L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。L-乳酸光學純度(％)=L-乳酸濃度/(L-乳酸濃度+D-乳酸濃度)X100%發酵結束後，取各批次分離的發酵液樣品，根據上述檢測和計算方法檢測發酵液中菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學純度。結果顯示，第一批次發酵最大細胞濃度8.9(0D620nm)，上清液中L-乳酸濃度63g/L，生產強度1.4g/L/h，L-乳酸光學純度99.4%。第二批次發酵最大細胞濃度9.8(0D620nm)，上清液中L-乳酸濃度70g/L，生產強度1.6g/L/h，L-乳酸光學純度99.0%。由此可知，開放式全細胞回收循環發酵能夠提高乳酸生產效率，同時保持L-乳酸光學純度在99%以上。實施例2、開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸不進行斜面培養和種子培養，直接進行發酵培養將實施例1中第二次發酵所得發酵液在非無菌條件下，以8，000轉/分離心20分鐘回收菌體。去除菌體上清液即為含高光學純度L-乳酸發酵液。將回收菌體作為種子培養物以體積比不少於5%的接種量接入3升置於5升發酵罐中的發酵培養基中，以與實施例1中相同的發酵條件進行第三次循環發酵。第三次循環發酵結束，再如上述操作進行第四次循環發酵。取各批次分離的發酵結束時的發酵液，檢測菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學純度。實驗結果顯示，第三批次發酵最大細胞濃度10.8(0D620nm)，L-乳酸濃度71g/L，生產強度1.6g/L/h，L-乳酸光學純度99.3%。第四批次發酵最大細胞濃度11.5(0D620nm)，L-乳酸濃度74g/L，生產強度1.7g/L/h，L-乳酸光學純度99.0%。由此可知，隨著開放式全細胞回收發酵的循環，乳酸生產效率有進一步的提升，L-乳酸光學純度保持在99%以上。實施例3以不同酵母粉濃度開放式全細胞回收循環發酵生產含高光學純L-乳酸發酵液發酵培養基設計4種培養基，所變化的是實施例1所述發酵培養基中酵母粉濃度分別為2g/L、10g/L、15g/L、20g/L，葡萄糖130g/L，餘量為水；所述發酵培養基的pH值為6.0，發酵培養基沒有經過滅菌。不進行斜面培養和種子培養，直接進行發酵培養將實施例2中第4批次發酵得到的發酵液以8，000轉/分非無菌條件下離心20分鐘得到的菌體作為種子，以2g/L酵母粉為氮源的發酵培養基進行發酵。再將發酵結束後得到的發酵液以8，000轉/分非無菌條件下離心收集的菌體作為種子，以10g/L酵母粉為氮源的發酵培養基進行發酵。再將發酵結束後離心收集的菌體作為種子，以15g/L酵母粉為氮源的發酵培養基進行發酵。再將發酵結束後以8，000轉/分非無菌條件下離心收集的菌體作為種子，以20g/L酵母粉為氮源的發酵培養基進行發酵。每次發酵接種量不低於5%。上述每一批次發酵結束後，根據上述實施例1所述的檢測和計算方法，檢測發酵液中菌體濃度、L-乳酸濃度以及L-乳酸光學純度。試驗結果見表1，表明增加酵母粉濃度有利於提高L-乳酸生產效率。最大細胞光吸收可達31.8(0D620nm)。L-乳酸濃度最高可達107g/L，L_乳酸光學純度可達99.8%，生產強度2.9g/L/h。表1酵母粉濃度對開放式全細胞回收發酵的影響酵母粉濃度I最大細胞濃度IL-乳酸濃度I生產強度IL-乳酸光學純度(g/L)(0D620nm)(g/L)(g/L/h)(%)~~27Γ226O993tableseeoriginaldocumentpage7實施例4、開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基配方與實施例1相同。發酵培養基葡萄糖130g/L，酵母粉20g/L，餘量為水；所述發酵培養基的pH值為6.0，發酵培養基沒有經過滅菌。用本發明開放式全細胞回收循環發酵的方法生產光學純L-乳酸，具體方法包括以下步驟1.斜面培養與實施例1相同。2.種子培養與實施例1相同。3.發酵培養將上述種子培養液以體積比10%的接種量接種到3升置於5升發酵罐中的發酵培養基(發酵培養基沒有經過滅菌)中，以培養溫度55°C，培養40小時，結束髮酵。培養過程中自動流加重量比為30%氫氧化鈉調節發酵液pH值維持在6.5。4.細胞回收將步驟3中培養液在非無菌條件下，以6，000轉/分離心20分鐘回收菌體，上清液用於分離L-乳酸。5.重複發酵與實施例1相同。發酵結束後，取各批次分離的發酵液樣品，檢測發酵液中菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學純度。結果顯示，第一批次發酵最大細胞濃度10.5(0D620nm)，L-乳酸濃度88g/L，生產強度2.2g/L/h，L-乳酸光學純度99.4%。第二批次發酵最大細胞濃度12.1(0D620nm)，L-乳酸濃度95g/L，生產強度2.4g/L/h，L-乳酸光學純度99.3%。由此可知，開放式全細胞回收循環發酵能夠提高乳酸生產效率，同時保持L-乳酸光學純度在99%以上。權利要求一種開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法，是以嗜熱乳酸生產菌為菌種在發酵培養基中進行50℃～55℃下開放式發酵，發酵結束後對發酵液進行離心，去除菌體的上清液即為含有高光學純度L-乳酸發酵液；離心後所得菌體再作為種子培養物接入下一批次發酵培養基中，以與上次發酵完全相同的發酵條件進行發酵培養，然後再對此次發酵液進行離心操作；如此循環多次，得到光學純L-乳酸。2.根據權利要求1所述的生產方法，其特徵在於所述嗜熱乳酸生產菌為凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184。3.根據權利要求1或2所述的生產方法，其特徵在於所述發酵培養基配方為葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，餘量為水，pH值6.O。4.根據權利要求1或2或3所述的生產方法，其特徵在於所述發酵條件為發酵溫度50°C55°C，發酵時間4048小時，攪拌轉速130150轉/分，其間自動流加重量比為30%40%鹼液，控制發酵液pH值在6.06.5範圍內。5.根據權利要求4所述的生產方法，其特徵在於每次發酵的接種量不少於5%，發酵溫度50°C，發酵時間48小時，攪拌轉速150轉/分鐘，流加鹼液為重量比為40%的氫氧化鈉，發酵液PH值6.0。6.根據前述任一權利要求所述的生產方法，其特徵在於每次發酵液均在非無菌條件下以離心方式回收菌體並將菌體用於循環發酵；具體的，所述發酵結束後的發酵液以6，0008，000轉/分轉速在非無菌條件下離心20士2分鐘；所述離心轉速優選為8，000轉/分。7.根據前述任一權利要求所述的生產方法，其特徵在於所述循環發酵次數為28次。8.根據權利要求7所述的生產方法，其特徵在於所述每次循環發酵中所用發酵培養基中，酵母粉含量逐次遞增；例如，第一次發酵時發酵培養基中酵母粉含量為2g/L，第二次發酵時發酵培養基中酵母粉含量為10g/L，第三次發酵時發酵培養基中酵母粉含量為15g/L，第四次發酵時發酵培養基中酵母粉含量為20g/L。9.根據權利要求1-8任一項所述的生產方法，其特徵在於所述凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184菌種在發酵前還需進行斜面培養和種子培養。10.用權利要求1-9任一項所述方法獲得的光學純L-乳酸。全文摘要本發明公開了一種開放式全細胞回收循環發酵生產光學純L-乳酸的方法。該方法是以凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCC№2184為菌種進行開放式發酵，發酵結束後對培養液進行離心，去除菌體的培養液即為含有高光學純度L-乳酸發酵液，離心後所得菌體再作為種子培養物接入下一批次發酵培養基中，以與上次發酵完全相同的發酵條件進行發酵培養，如此循環，得到光學純L-乳酸。本發明光學純L-乳酸的生產方法明顯優於現有的光學純L-乳酸生產方法，具有純度高、低汙染、生產效率高、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，適合大面積推廣和應用。文檔編號C12P7/56GK101805757SQ20101014802公開日2010年8月18日申請日期2010年3月24日優先權日2010年3月24日發明者唐鴻志,孫際賓,王麗敏,許平,趙博,馬延和申請人:天津工業生物技術研究所