在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸c4生物合成途徑的基因及其構建方法

2023-05-16 21:51:16

專利名稱：在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸c4生物合成途徑的基因及其構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和微生物發酵領域，具體涉及一種在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因及其構建方法。
背景技術：
5-氨基乙醯丙酸(ALA)是一種含氧元素和氮元素的碳氫化合物，是生物體合成四氫吡咯的前體，還是卟啉、(亞鐵)血紅素、葉綠素以及維生素B12的結構類似物。ALA是一種生理活性非常活躍的非蛋白類胺基酸，其應用範圍非常廣闊。在農業上，作為一種光活化綠色無公害的除草劑、殺蟲劑、抗微生物藥劑和植物生長促進劑而得到廣泛應用。在醫學上，ALA被應用到癌症的光動力學治療和診斷上；還具有促進血紅素生成的作用。另外，5-氨基乙醯丙酸作為外用藥可用於痤瘡的治療和作為生髮劑使用。ALA在生物體內存在著兩條合成途經(如

圖1所示)，一種途徑稱為碳四途徑(C4pathway),存在於動物、真菌和α家族細菌中，由5_氨基乙醯丙酸合酶(ALA synthase,ALAS)催化琥珀醯COA和甘氨酸縮合成ALA。另一條途徑被稱為碳五途徑(C5 pathway)，存在於植物、藻類以及大部分細菌中，ALA來源於穀氨酸的碳骨架，由3個酶催化。由碳四途徑和碳五途徑獲得的ALA均被共同的下遊代謝酶ALA脫水酶催化形成膽色素原，然後進一步向下遊轉化。大腸桿菌本身通過C5途徑合成ALA，但是，由於大腸桿菌不需要合成葉綠素，僅需要以ALA為前體合成少量的維生素B12等四吡咯類化合物，因此其天然的ALA合成能力很弱。

目前，ALA的合成方法分為化學法和生物法兩種。化學合成法合成步驟複雜，原料來途徑窄，合成造價較高，致使目前ALA產品市場價格昂貴(約326美元/克)，制約了它的推廣應用。生物合成ALA因工藝簡單、產率高，具有工業化生產前景。近年來，國內外研究者利用基因工程菌生產ALA已經取得了一些進展。Kiatpapan和Murooka將類球紅細菌iM.sphaeroides)的ALA合成酶的基因在費氏丙酸菌中實現表達，ALA積累量達到
1.1g/L。Mariet和Zeikus通過過表達獲co/i重組菌,ALA發酵產量達到了 3.79 g/L。Xie L.等利用含有基因的重組大腸桿菌，經過發酵優化，ALA產量達到
5.2g/L。浙江大學Lin J.等通過優化基因的表達和發酵條件，ALA產量達到7.3 g/L。但是上述有關ALA的合成方法中，只是針對基因進行分子操作，所構建的基因工程菌都僅限於過表達ALA合成酶一個基因，沒有強化C4生物合成途徑中的中間物的合成和強化ALA的分泌途徑。

發明內容
本發明要解決的技術問題，是提供一種在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因及其構建方法，對ALA合成酶基因(Ad)、輔酶A轉移酶基因(cat)以及ALA分泌基因(7^i)進行基因操作，藉助pETDuet-Ι共表達載體，構建了一株具有較高表達水平的基因，通過共表達和YBi使細胞外ALA的產量達到1124 mg/L。 為解決上述技術問題，本發明所釆取的技術方案是:
一種在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因，藉助pETDuet-Ι載體，共表達三個基因:ALA合成酶基因Ad、輔酶A轉移酶基因cat和ALA分泌基因7仍.，所述工程菌序列如下:
權利要求
1.一種在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因，其特徵在於藉助pETDuet-Ι載體，共表達三個基因:ALA合成酶基因Ae▲輔酶A轉移酶基因cat和ALA分泌基因！Si，所述基因序列如下:
2.一種如權利要求1所述的在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因的構建方法，其特徵在於其按照以下步驟順序進行: (1)以Rhodobacter sphaeroides基因組為模板，利用引物hemA -F和hemA -R擴增hemA基因; (2)通致以Propionibacteriumshermanil基因組為模板，利用和擴增Cat基因； (3)ALA分泌基因Wi藉助啟動子表達-.V丄Escherichiacoli基因組為模板，通過重疊PCR，利用引物Prom-F、Prom-R, Yb1-F、7況-7 得到含有完整表達盒的YBi基因； (4)各基因片段經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測後切膠回收，並與pMD18-T simple載體連接，轉化萬.co7i DH5a ； (5)塗布在含100μ g/L Amp的LB固體培養基上，藍白斑篩選的陽性克隆經質粒PCR及酶切鑑定後進行測序； (6)共同表達載體pETA、pETAC、pETACY的構建 質粒pETDuet-Ι和質粒pMD18-T- hemA分別用限制性內切酶EcoR I和Not I進行雙酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶將兩片段連接得到質粒pETA ;將質粒pETA和質粒pMD18-T-fei分別用限制性內切酶Nde I進行單酶切，回收兩目的片段，將Cat基因片段作為插入片段連接到PETA單酶切得到的較大片段上，得到重組質粒pETAC ； 質粒pETAC和質粒pMD 18-T-7Si分別用限制性內切酶Not I進行單酶切，回收兩目的酶切片段，將ALA分泌基因Wi連接到pETAC單酶切得到的較大片段上，得到重組質粒pETACY ;將以上構建得到的質粒載體轉化萬.coli DH5 a，提取質粒，採用酶切和PCR方法鑑定陽性克隆； (7)重組質粒的誘導表達 將重組質粒pETA、pETAC、pETACY分別轉化到E.coli BL21 (DE3)中，菌株分別命名為E.coli K,B.coli AC,B.coli ACY，挑取含重組質粒的BL21 (DE3)單菌落，接種至含50 μ g/L Amp的液體LB培養基中，37°C培養過夜，加入的甘氨酸終濃度為IOOmM ； 然後以1:100的比例接種至20mL的液體LB培養基中，37°C放大培養至0D600為0.6 0.8，然後降溫至28°C，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度為I mM，繼續培養12小時； (8 ) PT-PCR驗證基因的轉錄 採用多糖多酚植物總RNA快速提取離心柱型試劑盒提取菌株疋coli ACY中的RNAJf提取的RNA作為第一鏈cDNA合成的模板，採用20 μ I的反應體系，加入各種反應試劑，輕輕混勻，42°C孵育 30min,85°C加熱 5min 使 EasyScript 失活； 取2μ I的反轉錄產物作為PCR模板，分別擴增Xai及!Si基因，陽性對照組分別以pETA、pETAC、pETACY質粒為模板擴增、Cat及YBi。
3.根據權利要求2所述的在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因的構建方法，其特徵在於:所述的步驟(I)中的引物的序列為CGGAATTCGATGGACTACAATCTGGCACTCGATACCGC T ；hemA-R 的序列為 ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCAACGACCTCGGCG ； 相應的酶切位點分別為EcoR I和Not I。
4.根據權利要求2所述的構建新型的5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑大腸桿菌基因的方法，其特徵在於:所述的步驟(2)中的引物Cat-F的序列為GGAATTCCATATGAACGAACGCATCTCCA ； Cat-R 的序列為 GGAATTCCATATGTCAACGGTAGTGCGAAAGC ;相應的酶切位點分別為 Nde I。
5.根據權利要求2所述的在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因的構建方法，其特徵在於:所述的步驟(3)中的引物/的序列為AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCCGCATAATCGAAATTAATAC ； Prom-R 的序列為 ACGTAATGAACCAGGCATTATATCTCCTTCTTATACTT ； 7辦i的序列為 AGAAGGAGATATAATGCCTGGTTCATTACGT ； Yb1-R 的序列為 AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTAT 'Prom-F取 Yb1-R 的酶切位點為Not I。
全文摘要
本發明公開了在大腸桿菌構建5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的基因及其構建方法，通過分析5-氨基乙醯丙酸C4生物合成途徑的限速步驟、中間體供給及產物分泌等問題，克隆Rhodobactersphaeroides來源的ALA合成酶基因(hemA)、Propionibacteriumshermanil來源的輔酶A轉移酶基因(Cat)以及Escherichiacoli來源的ALA分泌基因(YBi)，藉助pETDuet-1共表達載體，共表達了合成5-氨基乙醯丙酸的hemA、生成5-氨基乙醯丙酸合成的中間體琥珀酸COA的Cat和促進5-氨基乙醯丙酸的分泌的Ybi，三個基因的共表達加強了5-氨基乙醯丙酸的生物合成，通過本發明所製備的具有C4生物途徑的基因，提高了Escherichiacoli的5-氨基乙醯丙酸產量，分泌到細胞外的ALA達到1124mg/L。
文檔編號C12N15/70GK103146694SQ20131006323
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者馮惠勇, 劉天佳, 李天明, 戴寶新, 劉靜文 申請人:河北科技大學