一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法
2023-05-16 20:57:46 1
專利名稱：一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法
技術領域：
本發明涉及植物種質資源保存及組織培養技術領域，尤其涉及一種彩色馬 蹄蓮種質資源離體保存的方法。
背景技術：
彩色馬蹄蓮(Z朋^o^c力^ A^Wofe)系天南星科(Isceae)馬蹄蓮屬 (Za/7"&sc力j^)多年生單子葉草本球根花卉，其形態高雅、色彩豔麗，在歐洲 國家一直是切花中的佼佼者，盆花栽培也是一大消費渠道。近幾年來也逐漸受 到我國消費者的喜愛，種植面積正不斷擴大。生產上彩色馬蹄蓮多為一年生栽 培，通過球莖進行無性繁殖。彩色馬蹄蓮種質資源的繁殖和保存也主要依靠球 莖為繁殖材料每年進行田間種植，這需要消耗人量的人力、物力和財力，而且 彩色馬蹄蓮球莖本身很容易感染細菌性軟腐病，通過多年的無性繁殖後很容易 造成細菌、病毒等病蟲害蔓延，造成資源損失，給種質資源的利用和保存帶來 難題。
當前，植物種質資源的保存方法主要有田間生長保存，離體低溫保存、超 低溫保存，組織培養保存等方法。其中，常規田間種植保存中，存在因季節變 換、病蟲害等自然災害的侵襲而造成工作量大和種質資源容易丟失；而超低溫 保存需要嚴格的保存條件，風險較大。植物離體保存因不受外界環境條件的影 響，具有田間生長保存無法比擬的優點。對植物進行離體保存技術已多有報導， 如專利申請號為CN200710019345和CN200710019346分別報導了通過減少培養基 中大量元素和添加脫落酸進行菊花離體保存的方法，發明名稱為"茅蒼朮組培 繁殖的種質保存方法"，發明名稱為"一種營養繁殖花卉石蒜的超低溫保存方
法"，等分別通過常溫抑制生長，普通組織培養方式或超低溫方式對植物進行 了離體保存。但簡單的運用以上保存方法並不適用於彩色馬蹄蓮，首先，彩色 馬蹄蓮球莖本身很容易攜帶歐文氏菌(可導致細菌性軟腐病)，尤其通常以帶 芽眼的切塊為外植體，在快繁過程中隨著培養代數的增加，此內生菌也大量繁 殖蔓延，導致組培快繁無法繼續；其次，該歐文氏菌系內生菌，若以常規的升 汞表面消毒則達不到理想的防治效果，這對彩色馬蹄蓮的長期離體保存也是一 個瓶莖問題；再次，在常規組培保存中必需對彩色馬蹄蓮種質資源進行頻繁的 繼代培養(約每月繼代一次)才能較好地保持其種性；此外，彩色馬蹄蓮球莖 除攜帶歐文氏菌外，也往往攜帶有大量病毒，這在組培與離體保存中也是必須 考慮的問題。
發明內容
本發明目的是，針對以往彩色馬蹄蓮常規組培離體保存中， 一方面以種球 帶芽眼切塊為外植體和常規的表面消毒，對球莖本身所攜帶的內生菌種一歐文 氏菌，難以達到好的滅菌、脫菌的效果，另一方面在常規保存培養條件下需頻 繁繼代培養所帶來的大工作量等缺陷；提出一種成本低廉，操作簡便，滅菌效 果較好，保存期長達一年以上不需要頻繁繼代培養而仍能保持優良種性的彩色 馬蹄蓮種質資源離體保存方法。
本發明目的通過以下技術方案來實現
一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法，按如下步驟進行
(1)培養基的配製各階段培養基組分和各組分在每升培養基內所含重量為 A)基本培養基其中，誘導、增殖培養基以蔗糖30g/L ，瓊脂7g/L的MS 為基本培養基；生根培養基以蔗糖30g/L ，瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養基； 試管球莖膨大培養基以蔗糖40 50g/L ，瓊脂6g/L的MS為基本培養基；種質
保存培養基以蔗糖20g/L ，瓊脂8g/L的1/2MS為基本培養基；pH均為5. 6
5.8;
B) 誘導培養基Ml: MS+6-BA1. 0-2. Omg/L+IBAO. 3-0. 5mg/L+青黴素50mg/L;
C) 增殖培養基M2: MS+6-BAO, 5-1. Omg/L+IBAO. 1-0. 5mg/L+青黴素100mg/L;
D) 生根培養基M3: 1/2MS+6-BAO. 2-0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L;
E) 球莖膨大培養基M4: MS+6-BA1. 0-3. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L;
F) 種質保存培養基M5: 1/2MS+6-BA0. 1-0. 3mg/L+NAA0. 1-0. 4mg/L +甘露醇 15. 0-20. Og/L+青黴素100mg/L;
(2) 外植體消毒、接種及誘導培養選取彩色馬蹄蓮健康、飽滿母球，用自 來水刷洗掉母球上泥土及最外層褐色表皮，衝洗約20分鐘後，用解剖刀切取母 球上lcm3的塊莖芽眼，經自來水衝洗乾淨後，於超淨操作臺上用75%酒精浸泡 0.5分鐘，無菌水衝洗3次，0. P/oHgCl2水溶液常規滅菌12min，無菌水衝洗3 5次，剝取0. 5mm以下莖尖分生組織，接種於誘導培養基M1中，於22_26QC，光 強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；或選取彩色馬蹄蓮組培生產過 程中無內生菌汙染且生長健康的植株，剝取0.5mm以下莖尖分生組織為誘導、 增殖對象；
(3) 增殖培養將步驟(2)已成活且無汙染的叢生芽轉接到增殖培養基M2 中，於22-26°C，光強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；繼代周期為 一個月，將塊狀芽叢剪成小塊進行擴繁；
(4) 生根培養挑選步驟(3)中健壯叢狀小植株剪成單株轉接到生根培養 基M3中，於22-26。C，光強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月，長成 4-6條白色長根的小苗；
(5) 球莖膨大培養挑選步驟(4)中根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大
培養基M4中進行試管養球，在22-25°C，光照12-16h/d，光強2000-3000Lx下 培養約一個月時間；
(6) 種質保存培養挑選歩驟(5)小子球飽滿的植株轉接到種質保存培養 基M5中，在10-15"，光照10h/d，光強IOOO Lx環境下保存，保存期長達15 個月以上；
(7) 恢復培養將步驟(6)保存培養一年以上已進入半休眠狀態的小子球 植株，先轉移到同步驟(2)培養條件下恢復培養一個月，再轉接到新鮮的誘導 培養基M1中進行二代或二代以上的組培繁殖；
(8) 遺傳穩定性檢測與利用觀察並挑選步驟(7)組培繁殖的小子球生長、 增殖狀況正常，長勢旺盛，增殖率為3. 8-4. 2，經可溶性蛋白和過氧化物酶(POD) 檢測未發生遺傳變異的植株；該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體 再保存；或按步驟(3)至(5)用於種苗擴繁生產。
所述的1/2MS基本培養基為大量元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養基。
本發明的有益效果是
一、 本發明採用0.5mm以下彩色馬蹄蓮莖尖分生組織為外植體，並在誘導、 增殖及保存培養基中分別添加了 50mg/L與100mg/L的青黴素以獲得培養材料， 有效地克服了內生菌造成的汙染問題，同時，通過莖尖脫毒種球內的病毒也得 到了較好的控制；而通常以帶芽眼切塊為外植體且在培養基中不添加青黴素的 培養方式中，經過4-5代增殖培養後會開始出現內生菌的汙染現象，以此種材料 為保存對象，很可能造成保存的失敗。
二、 本發明通過在保存培養基中添加了 10.0 20.0g/L甘露醇，將大量無 機鹽成分減半，並輔以較低溫度、低光照的生長環境(10-15°C，光照10h/d，
光強1000 Lx)，抑制了保存材料的生長，達到長期保存目的，比在普通MS培 養基中保存期延長6-8個月，不需頻繁繼代，可在有限的空間內保存更多的種質 資源，並減輕了工作量。
三、本發明保存的小球莖苗經恢復培養與繁殖後，既可用於再保存，也可 直接用於組培快速繁殖，後代生長正常，增殖第2代的增殖係數平均為3. 8-4. 2， 與正常球莖苗相當，亦無遺傳變異發生；這種保存方法相對於超低溫保存安全、 設備簡單、易操作，成本可降低50%以上。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明做進一步的詳細說明，但本發明的內容並不僅限 於此。
青黴素與甘露醇均為上海化學試劑廠生產化學純； 實施例l:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法l) (1)培養基的配製 基本培養基
1) 誘導、增殖培養基以庶糖30g/L ，瓊脂7g/L的MS為基本培養基；
2) 生根培養基以蔗糖30g/L ，瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養基；
3) 試管球莖膨大培養基以蔗糖40 50g/L ，瓊脂6g/L的MS為基本培養基;
4) 種質保存培養基以蔗糖20g/L ，瓊脂8g/L的1/2MS; 以上基本培養基pH均為5. 6 5. 8;
其中，1/2MS基本培養基為大量元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養基； (2)外植體消毒、接種及誘導培養選取健康、飽滿彩色馬蹄蓮母球，用自 來水刷洗掉母球上泥土及最外層褐色表皮，經流水下衝洗約20分鐘後，用解剖刀切取母球上lcm3的塊莖芽眼，經自來水衝洗乾淨後，於超淨操作臺上用75% 酒精浸泡0.5分鐘，無菌水衝洗3次，0. 1。/。的HgCl2水溶液常規滅菌12min，無 菌水衝洗3 5次，剝取0. 5mm以下莖尖分生組織，接種於莖尖誘導培養基Ml: MS+6-BA2. Omg/L+IBAO. 4mg/L+青黴素50mg/L中，於26°C，光強2500Lx，光照12h/d 條件下培養；
(3) 增殖培養 一個月後將步驟(2)中已成活且無汙染的叢生芽轉移到增 殖培養基M2: MS+6-BA1. Omg/L+IBAO. 45mg/L+青黴素100mg/L中，於22QC，光強 3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月進行擴繁；繼代周期為一個月，將塊狀 芽叢剪成小塊進行擴繁；
(4) 生根培養挑選歩驟(3)中健壯小植株剪成單株轉接到M3: 1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L培養基中，於22°C,光強2000Lx，光照 12h/d條件下培養一個月，可長成4-6條白色壯而長根的小苗；
(5) 球莖膨大培養挑選步驟(4)中根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大 培養基M4: MS+6-BA3.0mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L中進行試管養球，光照期間培 養溫度為25'C，黑暗期間為15i:，光照時間為12h/d，光強3000Lx，約一個月 時間即可；
(6) 種質保存培養挑選步驟(5)中小子球飽滿的植株保存於培養基M5: 1/2MS+6-BA0. lmg/L+NAA0. lmg/L +甘露醇20. Og/L+青黴素100mg/L中，培養溫 度為15°C，光照為10h/d，光強1000 Lx環境下保存可達15個月以上。
(7) 恢復培養對步驟(6)中保存一年以上己進入半休眠狀態的小子球轉 移到，同步驟(2)相同培養條件下進行恢復培養一個月後，轉移到新鮮的Ml 培養基中進行二代或二代以上的組培繁殖；
(8) 遺傳穩定性檢測與利用可觀察到步驟(7)中恢復培養的小子球生長
增殖狀況正常，長勢旺盛，到第2代增殖率與正常組培條件下已形成相應大小
試管球莖的組培苗相當，為3.8-4.2，通過可溶性蛋白和過氧化物酶(P0D)檢測 未發生遺傳變異。該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體再保存；或 按步驟(3)至(5)用於種苗擴繁生產。
實施例2:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法2)
本例誘導培養基為M1: MS+6-BA1. 5mg/L+IBA0. 3mg/L+青黴素50mg/L，培養條 件為24。C，光強3000Lx，光照12h/d;
增殖培養基為M2: MS+6-BAO. 8mg/L+IBA0. 3mg/L+青黴素100mg/L，培養條件 為25QC，光強2500Lx，光照12h/d條件下培養一個月；
生根培養基為M3: 1/2MS+6-BA0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培養條件為23°C， 光強3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；
球莖膨大培養為M4: MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L，培養條件為光照 期間22。C，黑暗時間溫度為13'C，光照時間為14h/d，光強2500Lx;
種質保存培養基為M5: 1/2MS+6-BAO. 2mg/L+NAA0. 3mg/L +甘露醇15. Og/L+青 黴素100mg/L，培養條件為1(TC，光照為10h/d，光強IOOO Lx;
其餘步驟，工藝均同於實施例l。
實施例3:(彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法3)
本例誘導培養基為M1: MS+6-BA1.0mg/L+IBA0. 5mg/L+青黴素50mg/L上；培養 條件為22。C，光強2000Lx，光照12h/d;
增殖培養基為M2: MS+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 15mg/L+青黴素100mg/L，培養條件 為23°C，光強2000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；
生根培養基為M3: 1/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培養條件為26°C， 光強2500Lx，光照12h/d條件下培養一個月；
球莖膨大培養為M4: MS+6-BA1. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培養條件為光照 期間培養溫度為24°C，黑暗期間培養溫度為13°C，光照時間為16h/d，光強 2000Lx;
種質保存培養基為M5: 1/2MS+6-BAO. 3mg/L+NAA0. 4mg/L +甘露醇18. Og/L+青 黴素100mg/L，培養條件為13。C,光照為10h/d,光強1000Lx; 其餘步驟，工藝均同於實施例l。 試驗例(遺傳穩定性檢測)
(1) 植物材料
a) 對照材料以常規正常繁殖生產的莖尖組培苗為材料；
b) 處理材料以恢復培養的保存材料二代繁殖苗為檢測對象；
(2) 將對照與處理材料經過增殖、生根後種植田間，觀察生長、開花情況均 趨一致，葉片與花均無變異發生；
(3) 對照與處理材料蛋白質和同工酶樣品溶液的製備分別準確稱取2.0g試 管苗葉片，剪碎後加入適量的石英砂於冰浴下勻漿，勻漿過程加入4ml稀釋4 倍的濃縮膠緩衝(pH值6. 7)， 5000r/min離心20min，取上清液2ml加入lml 蔗糖溶液(40%)和1滴溴酚藍溶液(O. 1%)混勻，於-2(TC冰箱內貯存備用；
(4) 電泳操作採用垂直PAGE不連續凝膠系統。每個樣品槽上樣30ul，電泳 開始時控制電流為15mA，待樣品進入分離膠後，調整電流為25mA。待溴酚藍 遷移至瓊脂層lcm時停止電泳,整個過程約3h;為防止溫度對酶活的影響， 電泳均在4'C冰箱內進行；
(5) 染色電泳結束後，打開膠板取出凝膠，標記溴酚藍泳動前沿；可溶性蛋
白採用考馬斯亮R2250法染色；P0D採用抗壞血酸-醋酸聯苯胺法染色；
(6) 譜帶結果與對照無明顯多態性，表明保存過程中無遺傳變異發生。
權利要求
1、一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法，其特徵在於該方法按如下步驟進行(1)培養基的配製各階段培養基組分和各組分在每升培養基內所含重量為A)基本培養基其中，誘導、增殖培養基以蔗糖30g/L，瓊脂7g/L的MS為基本培養基；生根培養基以蔗糖30g/L，瓊脂7g/L的1/2MS為基本培養基；試管球莖膨大培養基以蔗糖40～50g/L，瓊脂6g/L的MS為基本培養基；種質保存培養基以蔗糖20g/L，瓊脂8g/L的1/2MS為基本培養基；pH均為5.6～5.8；B)誘導培養基M1MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青黴素50mg/L；C)增殖培養基M2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青黴素100mg/L；D)生根培養基M31/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L；E)球莖膨大培養基M4MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac 1 g/L；F)種質保存培養基M51/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青黴素100mg/L；(2)外植體消毒、接種及誘導培養選取彩色馬蹄蓮健康、飽滿母球，用自來水刷洗泥土及最外層褐色表皮，衝洗約20分鐘後，切取母球上1cm3的塊莖芽眼，經自來水衝洗後，於超淨操作臺上用75％酒精浸泡0.5分鐘，無菌水衝洗3次，0.1％HgCl2水溶液常規滅菌12min，無菌水衝洗3～5次，剝取0.5mm以下莖尖分生組織，接種於誘導培養基M1中，於22-26℃，光強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；或選取彩色馬蹄蓮組培生產過程中無內生菌汙染且生長健康的植株，剝取0.5mm以下莖尖分生組織為誘導、增殖對象；(3)增殖培養將步驟(2)已成活且無汙染的叢生芽轉接到增殖培養基M2中，於22-26℃，光強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月；繼代周期為一個月，將塊狀芽叢剪成小塊進行擴繁；(4)生根培養挑選步驟(3)中健壯叢狀小植株剪成單株轉接到生根培養基M3中，於22-26℃，光強2000-3000Lx，光照12h/d條件下培養一個月，長成4-6條白色長根的小苗；(5)球莖膨大培養挑選步驟(4)根與莖葉皆健壯植株轉接到球莖膨大培養基M4中進行試管養球，在22-25℃，光照12-16h/d，光強2000-3000Lx下培養約一個月時間；(6)種質保存培養挑選步驟(5)小子球飽滿的植株轉接到種質保存培養基M5中，在10-15℃，光照10h/d，光強1000Lx環境下保存，保存期長達15個月以上；(7)恢復培養將步驟(6)保存培養一年以上已進入半休眠狀態的小子球植株，先轉移到同步驟(2)培養條件下恢復培養一個月，再轉接到新鮮的誘導培養基M1中進行二代或二代以上的組培繁殖；(8)遺傳穩定性檢測與利用觀察並挑選步驟(7)組培繁殖的小子球生長、增殖狀況正常，長勢旺盛，增殖率為3.8-4.2，經可溶性蛋白和過氧化物酶(POD)檢測未發生遺傳變異的植株；該植株或按步驟(3)至(6)進行種質資源離體再保存；或按步驟(3)至(5)用於種苗擴繁生產。
2、按權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的1/2MS基本培養基為大量 元素減半的Murashige-Skoog (MS)培養基。
全文摘要
本發明公開了一種彩色馬蹄蓮種質資源離體保存方法，屬於植物種質資源保存及組織培養技術領域。該方法包括培養基的配製；外植體消毒、接種及誘導培養；增殖培養；生根培養；球莖膨大培養；種質保存培養；恢復培養及遺傳穩定性檢測與利用等步驟。該方法取彩色馬蹄蓮0.5mm莖尖分生組織為外植體，減少了培養基中大量元素並添加了甘露醇和青黴素，在10-15℃，光照10h/d，光強1000Lx環境下保存球莖苗，15個月後無歐文氏菌汙染，存活率達100％，恢復培養後生長、增殖仍正常，無可遺傳變異發生。該方法具成本低廉，操作簡便等特點，可在彩色馬蹄蓮種質保存領域中推廣應用。
文檔編號A01N3/00GK101185433SQ20071016473
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月10日 優先權日2007年12月10日
發明者玫 劉, 吳延軍, 孫崇波, 張慧琴, 蔣桂華, 鳴 謝, 郭方其, 黃普樂 申請人:浙江省農業科學院