解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法
2023-05-16 13:34:31
專利名稱：解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法
技術領域：
本發明涉及微孔反應板的檢測技術，具體是一種解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum, Uu)和微小脲原體(Ureaplasma parvum, Up)的檢測方法。
背景技術：
支原體(Mycoplasma)是一類介於細菌和病毒之間，沒有細胞壁，能通過細菌濾器，能在人工培養基上生長繁殖的最小原核生物 。支原體歸屬於柔膜體綱，支原體目，支原體科。支原體科分為支原體，血蟲體，血巴爾通體和脲原體4個屬。其中，多項研究證明脲原體屬的解脲脲原體與女性泌尿生殖道的非淋菌性尿道炎、流產、早產、低體重兒等密切相關。Janet等於1984年報導金屬錳離子對Uu有抑制作用。ImM錳離子不僅抑制解脲脲原體在液體培養基中的生長或減少其生長比例，同時也改變其菌落形態和細胞的超微結構。然而這種抑制效應是獨立的而且具有種特異性，正是由於這種差別，Janet把解脲脲原體劃分為兩種生物群即 parvum群(Ureaplasma parvum, Up)和urealyticum群(Ureaplasmaurealyticum, Uu)(對於parvum群,猛離子對其生長的抑制是短暫的而對於urealyticum群卻是永久的。)。這是最早的對Uu和Up的劃分。隨著分子生物學的發展，從基因水平對脲原體進行了在系統發生學上的深入研究，Kong等報導在16SrRNA基因序列上Uu和Up存在1%位點的差異特別是在176、177和180-183位點，而它們的各血清型之間卻是一致的。同時Kong也對Uu和Up的16_23SrRNA基因間隔區進行了比對，發現它們之間有14個鹼基的差別，而內部各血清型之間也是相似的。隨後Uu和Up之間在脲酶基因、MBA抗原、基因大小等處的差異也相繼報導，從而進一步提出了 Up作為一個獨立的新種即微小脲原體命名的觀點。在臨床致病性上，張帝開等研究表明，在健康婦女中Up為主要的脲原體(82. 5%)，且以血清1、3、6型的單型別陽性為主(共佔87. 1%)。KONG等用宮頸拭子直接用PCR法檢測解脲脲原體，共調查了 100例孕婦，解脲脲原體總體陽性率58%，其中Up佔91. 4 %。這個提示Up是正常人群攜帶菌的可能性較大。與此同時有研究指出，Uu和Up的毒力不同，其致病性亦不同，Uu或其中的某個血清型更容易致病。有學者認為Uu產脲酶量多，與Up相比，對宿主細胞的毒性更大，致病性更強。因此，2007年國際細菌學分類學會正式做出把解脲脲原體原來的parvum群分出獨立命名為新的物種微小脲原體而urealyticum群仍保留原解脲脲原體命名的決定。當前在我國臨床對解脲脲原體的檢測主要是培養法，以液體培養基顏色變紅診斷為陽性。然而，泌尿生殖道中常含有其他具有脲酶基因的微生物(如，變形桿菌、衣原體等)均可導致培養基變紅，故以培養基顏色判讀結果常出現假陽性的情況。同時，由於傳統的培養方法只能檢測出有脲原體的存在而不能準確對其進行Uu和Up的鑑別，這就限制了不同物種與臨床疾病關係的研究和流行病學的調查。因此，建立一種準確、快速同時能進行Uu和Up檢測鑑定的方法將具有重要的臨床意義。
發明內容
本發明就是為了解決以液體培養基顏色改變判斷陽性結果的常規培養法出現假陽性結果，且不能準確對其進行Uu和Up鑑別的問題，而提供的一種具有重要的臨床意義的解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法。本發明是按以下技術方案實現的。一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其是按以下步驟進行的 ①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20 μ I經PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本；
另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經PCR擴增後熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物各20μ I ；
上述各孔分別加180 μ I雜交液混勻，65 1溫箱雜交60min，棄液後，用O. 1%SDS洗液
II、TBST洗板，棄液拍幹；
②.每孔加入鏈黴親和素辣根過氧化物酶封閉液I: 1000稀釋的混合物50 μ I，室溫放置30分鐘，用TBST洗板後加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分鐘；再用TBST洗滌，晾乾；
③.每孔各加入顯色底物Α、B各50μ I，混勻後置於暗處顯色20分鐘，最後加入終止液50 μ I,以顏色變化判斷結果；
④.經PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本加入終止液後，包被Uu探針的孔變黃或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500，而包被Up探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200則證明Uu陽性；
包被Uu探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200，而包被Up探針的孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於O. 500則證明同時感染Uu和Up ；而同時為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均小於O. 200則證明無Uu和Up感染；Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500，Up探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200 ；
Up陽性對照Uu探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200，Up探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500。所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其所述PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本，是將女性受檢者宮頸和陰道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，經PCR擴增後，100 1水浴變性10分鐘後，立即冰浴5分鐘獲得的；
所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其所述經PCR擴增後熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物，是經100 1水浴變性10分鐘後，立即冰浴5分鐘獲得的。所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其Uu特異性探針的核酸序列為5』 NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3』。所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其Up特異性探針的核酸序列為5』 NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3』。這樣設計的本發明，在對擴增產物的觀測上，採用基於DNA-BINDING96孔板的微反應板的核酸雜交反應進行PCR產物的檢測。該反應過程，與傳統的PCR產物電泳檢測相t匕，提高了檢測的敏感度，同時也實現了高通量的檢測，不僅解決以液體培養基顏色改變判斷陽性結果出現假陽性結果的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑑別，可廣泛用於臨床篩查。
附圖是本發明吸光度值坐標圖。
具體實施方案
下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細說明。I.標本女性的宮頸和陰道分泌物；男性首段尿IOml ；
Uu,Up陽性對照Up血清型3標準菌株(ATCC 27815)和Uu血清型8標準菌株(ATCC27618),購自 American Type Culture Collection, ATCC。2.標本核酸DNA的提取
a.用無菌棉拭子分別採集女性的宮頸和陰道分泌物，洗脫在磷酸緩衝液(PBS:磷酸二氫鉀(KH2P04) :0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) O. 2g,加去離子水約800mL充分攪拌溶解,然後加入濃鹽酸調pH至7. 4,最後定容到IL0高溫高壓滅菌後室溫保存。)中，12，000轉/分，離心10分鐘，棄去上清液，用Iml生理鹽水溶解沉澱，取Iml加入EP管中，用細菌基因組提取試劑盒(DP302，天根生化科技有限公司，北京)提取核酸，步驟如下
⑴取含有Iml菌液的EP管，10, 000轉/分Γ ，500Χ克)離心I分鐘，儘量吸淨上清。⑵向菌體沉澱中加入200 μ I緩衝液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。⑶向管中加入20 μ I蛋白酶K溶液，混勻。⑷加入220 μ I緩衝液GB，振蕩15秒，70°C放置10分鐘，溶液應變清涼，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。(5)加220 μ I無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉澱，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。(6)將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000轉/分Γ13，400Χ克)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩衝液GD，12，000轉/分Γ13，400克)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600 μ I漂洗液PW，12，000轉/分Γ13，400克)離心30秒，
倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑶重複操作步驟8。(10)將吸附柱CB3放回收集管中，12，000轉/分Γ13，400克)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。
(11)將吸附柱CB3轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ I洗脫緩衝液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000轉/分Γ13，400克)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。b.用無菌尿液收集管，收集男性首段尿10ml，12，000轉/分，離心10分鐘，棄去上層尿液，用Iml生理鹽水溶解沉澱，取Iml加入EP管，按上述步驟提取菌液的核酸DNA。3. PCR擴增反應
本發明採用特異性擴增Uu和Up脲酶基因的引物，對臨床標本和Uiu Up陽性對照進行特異性PCR擴增。PCR 反應體系 PCR 反應系(50μ I) :2XTaq PCR MasterMix (KT201,天根，北京)25μ 1，上遊引物U5 2μ I,下遊引物U4 2μ I,去離子水18. 5μ1,標本核酸提取液 2. 5 μ I。所述上遊引物U5:5，CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA C 3，；
下遊引物U4: 5，Biotin-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T 3』。PCR反應條件94°C 3分鐘，94°C 30秒，56°C I分鐘共35循環，然後72 °C 5分鐘。4. PCR產物微孔板雜交
a.用於區分Uu和Up特異性探針的設計本發明採用特異性擴增Uu和Up脲酶基因的引物，利用Genbank資料庫找出該引物所擴增的Uu和Up的核酸序列，並用Blast軟體比對找出Uu和Up之間的差異，最後依據差異設計特異性Uu和Up的捕獲探針。Uu 的特異性探針核酸序列為:5，NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3，； Up 的特異性探針核酸序列為:5，NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3』。b.選擇包被核酸的微孔板本發明採用DNA-BIND96孔微孔板(購自Corning LifeScience, American),該微孔板能較容易的結合5』端或3』端有氨基修飾的核酸,使核酸能穩定的包被到微孔板上。c.捕獲探針的包被用包被液(Na2HP04 · 2H20 179. 07g, EDTANa2 · 2H20 O. 372g,用NaOH調PH8. 5，最後定容至1L)稀釋Uu、Up探針，使其終濃度為1000nmol/l，每孔加50 μ IUu或Up探針到DNA結合微孔板上；封孔後置37 V I小時或4 °C過夜，棄液，用TBST (Tris3g, NaCl 8. 0g, KCl O. 2g溶解於800ml蒸餾水中，用lmol/L HCl調PH至8. 0，補充蒸餾水至1L，加O. 5mlTween-20 (JF0134,上海源葉生物科技有限公司))洗3次，洗去未結合的Uu、Up探針。再加入200μ1/孔封閉液(O. Ig胎牛血清白蛋白(BSA) (D0008-1，上海滬宇生物科技有限公司)，2mg賴氨酸溶於ImlTBST中)，封閉未結合位點，37 °C，60分鐘後棄去。d. PCR產物雜交，取臨床樣本的PCR擴增產物40 μ 1，100 1水浴變性10分鐘後立即置冰浴5分鐘。將熱變性的PCR擴增產物分別加入包被有Uu、Up探針的DNA結合微孔板內各加入20 μ 1，接著加入180 μ I 65°C預熱的雜交液(20 X SSC 10ml，去離子水30ml，十二烷基硫酸鈉(SDS) O. 04g, 20 X SSC:NaCl 175g，檸檬酸三鈉88g，溶解於800ml去離子水中，加入IOmoVlNaOH調節PH至7. 0，定容至1L)，混勻，65°C溫箱雜交60min。棄液後，用65 V預溫的0. 1%SDS洗液II (2 X SSC, 0. 1%SDS. 2 X SSC由20 X SSC稀釋10被而來)洗滌3次，然後用TBST再洗一次，棄液，拍幹。每孔加鏈黴親和素辣根過氧化物酶封閉液為I : 1000稀釋的混合物50 μ 1，室溫放置30分鐘；用BST洗3次，然後加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分鐘；再用TBST洗2遍，晾乾。加入顯色底物A(檸檬酸鈉，Η202)、B (四甲基聯苯胺(TMB))各50 μ 1，混勻後置於暗處顯色20分鐘，加入終止液(lmol/1 H2S04)50y I,以顏色變化判斷結果。另外，用Uu血清型8標準株(ATCC27618)和Up血清型3標準株(ATCC27815)取PCR擴增後熱變性處理的產物，分別作為Uu、Up陽性對照孔。5.結果判讀，參照附表。包被Uu探針的孔變黃或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500，而同時包被Up探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200則證明Uu陽性； 包被Uu探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200，而同時包被Up探針的孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於O. 500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於O. 500則證明同時感染Uu和Up ;同時為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均小於O. 200則證明無Uu和Up感染；
Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於O. 500，Up探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200 ；
Up陽性對照Uu探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於O. 200，Up探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於O. 500。結合附表可知結果如下
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SEQUENCE LISTING天津醫科大學
〈120〉解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法
〈130〉I
〈160〉2
PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉22
〈212〉DNA
2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum〈220〉
〈221〉Uu
〈222〉(1)..(22)
〈400〉I
agcaattaac ttcgctgaag gc22〈210〉2
〈211〉22
〈212〉DNA
2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum〈220〉
〈221〉Up
〈222〉(1)..(22)
〈400〉I
ggcaattaat ttcgctagtg gt22。
權利要求
1.一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其是按以下步驟進行的 ①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20 ill經PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本； 另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經PCR擴增後熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物各20u I ； 上述各孔分別加180 u I雜交液混勻，65 1溫箱雜交60min，棄液後，用0. 1%SDS洗液II、TBST洗板，棄液拍幹； ②.每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶封閉液I: 1000稀釋的混合物50 Ul，室溫放置30分鐘，用200 u I TBST洗板後加入含1%SDS的洗液II浸泡15分鐘；再用TBST洗漆，晾乾； ③.每孔各加入顯色底物A、B各50Ul，混勻後置於暗處顯色20分鐘，最後加入終止液50 u I,以顏色變化判斷結果； ④.經PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本加入終止液後，包被Uu探針的孔變黃或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於0. 500，而同時包被Up探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於0. 200則證明Uu陽性； 包被Uu探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於0. 200，而同時包被Up探針的孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大於0. 500則證明Up陽性； Uu,Up探針孔同時為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於0. 500則證明同時感染Uu和Up ;而同時為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均小於0. 200則證明無Uu和Up感染； Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於0. 500，Up探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於0. 200 ； Up陽性對照Uu探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小於0. 200，Up探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大於0. 500。
2.根據權利要求I所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特徵在於所述PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本，是將女性受檢者宮頸和陰道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，經PCR擴增後，100 1水浴變性10分鐘後，立即冰浴5分鐘獲得的。
3.根據權利要求I所述解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特徵在於所述經PCR擴增後熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物，是經100 °C水浴變性10分鐘後，立即冰浴5分鐘獲得的。
4.根據權利要求I所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特徵在於Uu特異性探針的核酸序列為:5，NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C。
5.根據權利要求3所述一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其特徵在於Up特異性探針的核酸序列為5』 NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T。
全文摘要
本發明公開了一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，屬於微孔反應板的檢測技術。本發明是在包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入經PCR擴增後熱變性處理的臨床樣本，另外設立分別加入Uu、Up血清型標準株PCR擴增後熱變性處理的陽性對照孔；經溫箱雜交後洗板，拍幹；每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶結合物，後經洗板，晾乾；每孔加入顯色底物A、B，混勻後暗處顯色，最後加入終止液，以顏色變化判斷結果。本發明不僅解決了以液體培養基顏色改變判斷陽性結果出現假陽性的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑑別，提高了檢測的敏感度，同時也實現了高通量的檢測，可廣泛用於臨床篩查。
文檔編號C12Q1/68GK102952888SQ201210530739
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月11日 優先權日2011年12月20日
發明者劉運德, 王蓉, 李雪, 張楠, 谷亞軍, 鮑會靜, 齊新, 李建 申請人:天津醫科大學