抗紋枯病轉基因水稻的培育及專用載體的製作方法
2023-05-16 13:27:36
專利名稱：抗紋枯病轉基因水稻的培育及專用載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種抗紋枯病轉基因水稻的培育及專用載體。
背景技術：
水稻紋枯病(sheathblight)是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的土傳真菌病害。上世紀60年代以來，伴隨著矮杆品種的推廣、密植和化肥的大量施用，紋枯病在世界範圍內成為水稻三大病害之一，一般造成15% — 20%的減產，嚴重時可減產60%- 70%。該病屬於葉鞘病害，始於植株基部。在水稻群體條件下，一般於分櫱後期至拔節初期和抽穗期前後20天左右形成2個發病高峰，特別是後一個發病高峰，菌絲體不僅快速向植株冠層擴展(縱向擴展)，而且迅速橫向蔓延，使周圍健康植株生病，危害十分嚴重。病原菌(R. solani kuhn)不僅危害葉鞘，而且可致葉片發病或失水枯死，影響群體光合作用，嚴重時會致莖杆腐爛而成片倒伏、穎殼發病、穗子枯死甚至不能完全抽出，對產量和品質影響巨大。由於水稻推廣品種的抗性水平普遍不理想，迄今為止，生產上對該病的控制主要依賴化學防治。但在當前高肥、大群體和農村輕壯年勞動力大量轉移的情況下，常常由於用藥不及時或方法不正確，導致防治效果普遍不佳，紋枯病作為主要病害的地位越來越突出，乃至我國南方稻區的很多地方，該病已上升為水稻第一大病害。培育抗紋枯病水稻新品種是從根本上解決紋枯病危害的唯一出路，也已成為我國水稻生產上的當務之急。隨著分子生物學、植物病理學和基因工程技術的迅猛發展，運用基因工程手段提高植物的抗病性，為抗病育種開闢了一條全新的途徑。
發明內容
本發明一個目的是提供GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體的應用。本發明提供的GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N 『末端第29-171位胺基酸殘基。上述序列表中的序列2由171個胺基酸構成，自氨基末端第1-28位為信號肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。上述應用中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。上述序列表中的序列I由516個核苷酸構成，自5 『末端第1-84位為編碼信號肽的基因，自5 『末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。 上述應用中，所述調控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性；
所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。水稻的品種名具體為水稻「徐稻3號」。上述應用中，所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性；所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起。本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明提供的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因導入目的植物得到轉基因植物，所述轉基因植物的紋枯病抗性高於所述目的植物；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N 『末端第29-171位胺基酸殘基。上述方法中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。
上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻；水稻的品種名具體為水稻「徐稻3號」。所述紋枯病為水稻紋枯病，所述水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn)引起；所述GAFP2蛋白的編碼基因通過下述第三個目的中的重組載體導入所述目的植物中。本發明的第三個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子插入表達載體得到；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N 『末端第29-171位胺基酸殘基。上述啟動子可為組成型、維管組織特異表達或真菌誘導型啟動子，所述組成型啟動子優選為35S啟動子。上述重組載體為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子35S插入表達載體pCambia2300中得到的載體；所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。上述重組載體具體按照如下方法製備I)將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換pBI221載體中的⑶S片段，得到的中間載體pBI 35S-GAFP2 ；將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換PBI221載體中的⑶S片段進一步具體為將上述序列表中序列I所示的核苷酸取代PBI221載體的XbaI和SacI酶切識別位點間的小片段(⑶S片段)得到的重組載體。2)用 HindIII 和 SacI 酶切中間載體 pBI35S_GAFP2 得到 1300bp35S_GAFP2 片段，將所述35S-GAFP2片段插入pCambia2300載體HindIII和SacI酶切位點間得到重組載體。含有上述表達載體的重組菌或轉基因細胞系也是本發明保護的範圍。本發明的實驗證明將含有信號肽的GAFP2基因導入水稻中獲得轉基因水稻，可以高效地抵抗紋枯病菌的侵染，與非轉基因水稻相比，轉GAFP2水稻具有穩定的、明顯增強的抗紋枯病能力，其病指數顯著降低，說明轉GAFP2水稻表達的GAFP2蛋白能夠在信號肽的引導下將成熟肽GAFP2準確定位於胞外，從而有效增強了轉基因植物對真菌病源物侵染的抗性。
圖I為轉GAFP2水稻株系的分子鑑定結果圖2為水稻紋枯病菌的培養及水稻接種圖片
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業 途徑得到。實施例I、含有GAFP2的高效表達載體pCambia2300-35S_GAFP2的構建人工合成GAFP2基因，GAFP2的核苷酸序列為序列表中的序列1，該基因編碼的胺基酸序列為序列表中的序列2。上述序列表中的序列I由516個核苷酸構成，自5 『末端第1-84位為編碼信號肽的基因，自5 『末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。上述序列表中的序列2由171個胺基酸構成，自氨基末端第1-28位為信號肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。將GAFP2基因(序列表中的序列I)連接到pUCm_T (購自上海生工生物工程有限公司)上，構建載體PUCm-GAFP2。用XbaI和SacI酶切pUCm_GAFP2，得到516bp酶切後的GAFP2片段，經該片段與用同樣的酶切去I. 9Kb GUS片段的pBI221載體(購自Clontech Laboratories, Inc.)骨架連接，得到中間載體pBI 35S-GAFP2。用HindIII 和 SacI 酶切中間載體 pBI35S_GAFP2 得到 1300bp35S_GAFP2 片段，該片段與經過同樣酶切後的8740bp的pCambia2300 (購自Cambia Laboratories公司)載體骨架連接，得到表達載體pCambia2300-35S-GAFP2 (經過酶切驗證為陽性)；該表達載體的細菌和植物抗性基因為卡那黴素抗性基因Kan r+和NPTII篩選標記基因，該表達載體pCambia2300-35S-GAFP2 為將 35S_GAFP2(35S+ 序列表 I)插入載體 pCambia2300 的 HindIII和SacI酶切位點間得到的載體。實施例2、轉GAFP2水稻的獲得及功能研究
一、轉GAFP2水稻的獲得I、轉GAFP2水稻的獲得I)將實施例I中獲得的表達載體pCambia2300-35S_GAFP2轉化到根癌農桿菌LBA4404 (購自 Invitrogen 公司)中，得到根癌農桿菌 LBA4404/pCambia2300-35S_GAFP2。2)分別挑取根癌農桿菌LBA4404/pCambia2300-35S-GAFP2單菌落，接種於20ml含50mg/L卡那黴素、50mg/L利福平和30mg/L鏈黴素的YEP培養基中，28° C、280rpm過夜培養至0D600為O. 7 O. 8。然後5000rpm離心，棄上清液，沉澱用NB-液體培養基重新懸浮。最後將水稻「徐稻3號」(徐軍，段祥茂，劉強，楊波，徐宗進，周煒，陳留根和仲維功.2008.徐稻3號水稻超高產栽培試驗研究.江蘇農業科學.3:29-31.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；以下簡稱為野生型水稻)幼胚的愈傷組織在懸浮液中浸泡30分鐘。3)將經過上述2)處理得到的愈傷組織用無菌吸水紙吸乾，放置於NB培養基上，暗培養4 6天後，用無菌水將外植體洗淨，在半固體NB培養基(添加250ug/ml的羧苄青黴素或頭孢噻肟)上培養愈傷組織進行一篩，在冷螢光燈下28°C培養16天，抗性愈傷選擇出來進行二篩。將快速生長的轉化細胞選擇出來，轉到分化培養基中，在12小時光照，12小時黑暗的條件下，繼續培養大約兩周左右直至分化出小芽。4)把小苗轉移到含30ml 1/2MS培養基的盒子中，在冷螢光燈下28°C培養小苗10-14天。最後把幼苗轉移到盆裡，在溫室中培養，得到Ttl代轉GAFP2水稻。NB培養基的配方為每IOOOmL水中含有下述物質N6 (Chu (N6) Basal SaltMixture, Sigma-Aldrich, C1416)大量(20 X) 50ml, B5 (B5 基本培養基，上海恆斐生物試劑有限公司，BS1304)有機(IOOX)IOml, B5 微量(IOOX)IOml,鐵鹽(100X) 10ml，2，4-D (O. 2mg/ml) 10ml,脯氨酸 500mg,水解酪蛋白 300mg,鹿糖 30g,瓊脂 8g, pH 5. 8。生根培養基的配方為MS(Murashige&Skoog 基本培養基，Sigma-Aldrich, M5519)粉劑2. 17g，B5(B5基本培養基，上海恆斐生物試劑有限公司，BS1304)有機(IOOX)IOml,NAA(1_ 蔡乙酸,Sigma-Aldrich, N0640,0. 2mg/ml), 2. 5ml MET(蛋氛酸，Sigma-Aldrich,459240,0. 2mg/ml) 5ml，蔗糖 20g,瓊脂 8g，pH5. 8。 採用同樣的方法，將空載體pCambia2300轉入水稻「徐稻3號〃中獲得Ttl代轉空載體水稻。將Ttl代轉GAFP2水稻和Ttl代轉空載體水稻播種，收種，分別得到T1代轉GAFP2水稻和T1代轉空載體水稻。2、轉GAFP2A稻的分子鑑定I)、提取總 DNA提取T1代轉GAFP2水稻單株的新鮮幼嫩葉片的基因組DNA，採用常規CTAB法提取。2)、PCR 檢測以步驟I)獲得的各單株葉片的基因組DNA為模板，以GAFP2-F引物5』 -AGC CATGGC AGC ATC CGC AAG-3，和 GAFP2-R 引物:5，-GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T-3，作為上下遊引物進行PCR擴增，得到PCR產物。PCR反應的總體積為20μ 1，程序為先94° C3min;然後94° C 40s，55 ° C30s, 72。C40s, 30 個循環後；72。C 延伸 lOmin。以實施例I中獲得的質粒pCambia2300-35S_GAFP2為陽性對照(CK2)，以野生型水稻的基因組DNA為陰性對照(CK1)。反應結束後，PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，結果如圖I所示，1-16為Tl代轉GAFP2水稻；CK1為陰性對照；CK2為陽性對照，可以看出，得到516bp目的片段為陽性Tl代轉GAFP2水稻，圖中泳道為1-5、8-10、12-16的Tl代轉GAFP2水稻為陽性Tl代轉GAFP2水稻，而陰性對照野生型水稻沒有目的片段。採用同樣的方法檢測T1代轉空載體水稻也沒有目的片段。二、轉GAFP2水稻的紋枯病抗性檢測(田間接病實驗)I、菌種及其培養方法水稻紋枯病的病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)菌株RH-9 (記載在如下文獻中左士敏，張亞芳，殷躍軍，陳宗祥和潘學彪.2006.田間水稻紋枯病抗性鑑定體系的建立和完善，揚州大學學報 農業與生命科學版.27(4) :57-61 ;公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；也可以從江蘇省農科院植物保護研究所獲得。菌種培養方法扁平的木質短棒(10X2X2) mm，置於培養皿中(只鋪I層)Jppda培養基(不漫過接種物)，滅菌後，接入菌絲塊，室溫下暗培養3-4天後，待菌絲遍布培養基表面時，可用於接種水稻。2、鑑定材料田間種植採用隨機區組設計，3次重複，每小區種植水稻3行，每行12株。株行距為22.5cmX12.0cm。中等施肥水平，保持淺水灌溉不脫水。鑑定材料在田中隨機分布，按水稻正常的播種時間和田間管理方式進行種植，保持田間的適當溼度，以利於紋枯病的發生。上述水稻為編號為SG2陽性Tl代轉GAFP2水稻、水稻「徐稻3號」和T1代轉空載體水稻。3、田間接種方法待上述步驟2種植的編號為SG2陽性Tl代轉GAFP2水稻、水稻「徐稻3號」和T1代轉空載體水稻生長到大田拔節初期(正常半旱秧育秧的秧苗，約在移栽後35天左右)以鑷子將短火柴棒嵌入自上向下第3葉鞘內側，使葉鞘包莖狀態不變，並在相應的葉片上做好 標記。每株接種3個莖杆，詳見圖2。以非轉基因野生型水稻「徐稻3號」作為對照(CK)，T1代轉空載體水稻也作為對照。4、發病檢測感病對照充分發病，且病情基本穩定時(大約在抽穗後30天左右)，進行病情調查。調查小區中間行中間8株(即兩邊各去除2株)，採用揚州大學農學院潘學彪研究組制定的基於葉鞘位的0-9級病級調查標準其中O級為植株無病；9級為植株因病非正常死亡；O 3級為抗病；4 6級為中等抗病至中等感病；7 9級為感病，作為評級指標(詳見左士敏，張亞芳，殷躍軍，陳宗祥和潘學彪.2006.田間水稻紋枯病抗性鑑定體系的建立和完善，揚州大學學報·農業與生命科學版.27(4) :57-61 ;王子斌，左示敏，李剛，陳夕軍，陳宗祥，張亞芳和潘學彪.2009.水稻紋枯病幾種田間病級調查標準的比較研究.揚州大學學報·農業與生命科學版.3(4) :9-14)。每個小區取三個單株鑑定，最高病級為一株植物各個分櫱莖杆中發病最重莖杆的病級為指標，平均病級是以主莖和大分櫱病級的平均數為指標，以此兩種指標(病級指數)的鑑定分析結果見如下表I和表2所示。T1代轉空載體水稻對照抗病結果與非轉基因對照
無差異。表I為以最高病級為指標，進行的抗病結果鑑定情況田間小田間小田間小待瀾!品種株系號區重複區重複區$復重複平均載體平均
權利要求
1.GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N『末端第29-171位胺基酸殘基。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於 所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特徵在於 所述調控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於 所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性； 所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起。
5.一種培育轉基因植物的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因導入目的植物得到轉基因植物，所述轉基因植物的紋枯病抗性高於所述目的植物；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N 『末端第29-171位胺基酸殘基。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻； 所述紋枯病為水稻紋枯病，所述水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn)引起； 所述GAFP2蛋白的編碼基因通過下述權利要求8或9所述的重組載體導入所述目的植物中。
8.—種重組載體，為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子插入表達載體得到；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N 『末端第29-171位胺基酸殘基。
9.根據權利要求8所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子35S插入表達載體pCambia2300中得到的載體； 所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端第85-516位核苷酸。
10.含有權利要求8或9所述表達載體的重組菌或轉基因細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種GAFP2蛋白在培育抗紋枯病轉基因水稻中的應用及專用載體。本發明提供了GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N『末端第29-171位胺基酸殘基。本發明的實驗證明將GAFP2導入水稻中獲得轉基因水稻，可以有效增強對水稻紋枯病的抗性。
文檔編號C12N15/84GK102965392SQ20121053056
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者儲成才, 王義琴, 劉豐澤, 陳帥 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所