一種epsps酶的抗體及其製備方法與專用抗原及應用的製作方法
2023-05-16 12:42:31
專利名稱：一種epsps酶的抗體及其製備方法與專用抗原及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗除草劑草甘膦的EPSPS酶的抗體及其製備方法與專用抗原及應用，特別是涉及一種抗除草劑草甘膦的EPSPS酶的抗體及其製備方法與專用抗原及其在製備轉EPSPS免疫檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
研究表明，將抗除草劑草甘膦EPSPS(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)基因轉化植物(如大豆、棉花、玉米、油菜等)，轉基因植株可獲得除草劑草甘膦抗性。這是由於轉基因植物體內的EPSPS過量表達，對除草劑草甘膦不敏感。目前，轉EPSPS免疫檢測試劑盒已廣泛應用於大規模對轉抗除草劑草甘膦EPSPS基因植物的真偽鑑定，食品中轉EPSPS基因的成分分析及生物安全性的研究。轉EPSPS植物的檢測方法主要有三種(1)生物試法；(2)DNA檢測法；(3)蛋白的免疫檢測法。在這三種方法中，生物試法比較繁瑣，測定結果變異大，且難以進行橫向和縱向的比較；DNA檢測法只是檢測基因，並不代表蛋白水平，且對於抗性的高低並無指導意義；與前兩種方法相比，免疫檢測法方便、實用、快速、經濟。
轉EPSPS免疫檢測試劑盒的好壞完全取決於抗除草劑草甘膦大豆EPSPS抗體的好壞。據國內外文獻報導，抗草甘膦EPSPS抗體是以大腸桿菌發酵、提取、純化的蛋白作為抗原免疫動物得到的。但由於蛋白的分離和純化非常困難，在純化過程中不可避免地會摻入一些雜蛋白，即使是非常純的蛋白，由於多個抗原決定簇的存在，所製備的抗除草劑草甘膦EPSPS抗體往往也會產生交叉反應，影響抗體的特異性。為解決抗體的特異性問題，目前，國外轉EPSPS免疫檢測試劑盒中的EPSPS抗體多是通過合成多肽的方法來製備的，但所利用的是何種多肽大多沒有公開或者已申請專利。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種用於製備EPSPS酶抗體的專用抗原。
本發明所提供的製備EPSPS酶抗體的專用抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的多肽與載體蛋白聯結得到。
序列表中的SEQ ID №1由13個胺基酸殘基組成。肽的合成通常用固相合成法，如叔丁氧(醯)羰基(t-BOC)化學法或9-氟甲氧羰基(FMOC)化學法。
所述載體蛋白既可以聯結於所述多肽的氨基端(N端)，也可以聯結於其羧基端(C端)。
所述載體蛋白可為任意一種常用的載體蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)等。
可採用常規的戊二醛法將多肽與載體蛋白進行聯結。
本發明的第二個目的是提供一種EPSPS酶的抗體。
本發明所提供的EPSPS酶的抗體，是用上述專用抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到的抗體。
所述用於製備EPSPS酶抗體的免疫動物可為雞、兔、鼠、羊或馬等常用的免疫動物。
本發明的另一個目的是提供一種EPSPS酶抗體的製備方法。
本發明所提供的EPSPS酶抗體的製備方法，包括以下步驟1)用上述專用抗原免疫動物；2)從步驟1)經免疫的動物中分離、純化血清，得到EPSPS酶的抗體。
在上述製備方法中，步驟3)中用於製備EPSPS酶抗體的免疫動物可為雞、兔、鼠、羊或馬等常用的免疫動物。
本發明的第四個目的是提供一種轉EPSPS免疫檢測試劑盒。
本發明所提供的轉EPSPS免疫檢測試劑盒，其活性成分為上述EPSPS酶的抗體。
在實際應用中，為方便檢測，可將陰性血清對照、血清稀釋液、洗滌劑、終止劑、顯色劑、抗草甘膦EPSPS蛋白標樣和HRP-羊抗兔IgG抗體等檢測試劑也包裝入上述試劑盒。
本發明提供了一種EPSPS酶的抗體。該抗體具有下述優點1)具有較高的特異性，可用於對轉EPSPS植物(如大豆、玉米、大豆、菸草等)中EPSPS的定性、定量分析；2)製備方法簡單，具有工業化生產的可行性。本發明將在轉EPSPS植物的生物檢測領域發揮重要作用，市場前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、抗草甘膦EPSPS抗體的製備一、EPSPS多肽片斷的選擇和合成對GenBank資料庫中aroA基因(GenBank號為Q9R4E4)所編碼的農桿菌CP4菌株的EPSPS的胺基酸序列進行理化分析，從中選擇一段特定的由13個胺基酸殘基組成的多肽(序列表中的SEQ ID №1)，分子量為1326.66，用常規的固相合成法合成該多肽。
二、免疫抗原的製備將步驟一合成的多肽與牛血清白蛋白(BSA)採用戊二醛方法進行聯結，具體方法包括以下步驟(1)取10mg BSA，完全溶解於5mL 0.01mol/L PBS(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g加水至1000mL，pH7.2)中，再加入4mg步驟一的合成多肽，使其完全溶解；(2)緩慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，與步驟(1)獲得的溶液混合，並在室溫下，攪拌反應2小時；(3)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室溫下攪拌1小時，以終止反應；(4)將步驟(3)獲得的溶液裝入透析袋中，用PBS透析4天進行純化，每天換三次透析液。將透析後得到的多肽-BSA聯結物進行分裝，經-40℃冷凍後，真空濃縮乾燥，保存於-20℃冰箱中。
三、製備EPSPS抗體採用體重20克左右的7周齡雌性Balb/c小鼠作為免疫動物。以步驟二製備的多肽-BSA的聯結物作為抗原，免疫動物，製備EPSPS抗體。免疫方法及劑量為共免疫注射六次，將抗原用PBS稀釋至1.0mg·mL-1(以載體蛋白計算)，然後與等體積的福氏完全佐劑(第一次免疫)或福氏不完全佐劑(第二次至第五次免疫)混合後乳化，最後一次用免疫抗原直接免疫，免疫劑量均為0.2mL/小鼠。第三次免疫後耳緣靜脈取血，檢測抗血清效價，檢測結果表明抗血清效價達1/50000。最後一次免疫後的第七天頸動脈放血，分離、純化後得到抗血清，檢測抗血清效價，檢測結果表明抗血清效價達1/50000，可用於EPSPS含量的檢測。
實施例2、EPSPS的免疫檢測用ELISA方法對抗草甘膦的EPSPS轉基因大豆進行檢測，所用的常規大豆品種包括科豐14和中黃13(由中國農業大學農學與生物技術學院化控中心提供)，抗草甘膦轉EPSPS轉基因大豆品種D011可參照文獻(闞貴珍，喻德躍.試紙條法和PCR法檢測抗草甘膦轉基因大豆的外源基因.中國油料作物學報[J].2005，27(4)18-21)中的方法獲得，具體檢測過程包括以下步驟(1)稱取轉基因大豆樣品0.3g，加入3mL PBS提取液後充分研磨，提取4h後3000rpm離心10min，取上清液用於分析；(2)向酶標板每孔中加入步驟(1)獲得的上清液100μl，於37℃溫箱中溫育3h，然後棄去孔內液體，用洗滌液洗板四次，甩幹；
(3)將實施例1製備的EPSPS抗體用樣品稀釋液(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，明膠1.0g，1mL吐溫-20，加水至1000mL，pH7.0)按1∶500的比例進行稀釋，向酶標板每孔中加入100μl，置於37℃溫箱中溫育30min，然後棄去孔內液體，用洗滌液洗板4次，甩幹；(4)將HRP-羊抗兔IgG抗體(Sigma公司)用樣品稀釋液按1∶1000的比例進行稀釋，向酶標板每孔中加入100μl，置於37℃溫箱中溫育30min，然後棄去孔內液體，用洗滌液洗板4次，甩幹；(5)向酶標板每孔中加入100μl底物(鄰苯二胺10-20mg，2-4ul H2O2，溶於20mL底物緩衝液(檸檬酸·H2O 2.55g，Na2HPO4·12H2O 9.215g，加水至500mL，pH5.0)中)，在常溫下進行顯色反應，並用2N硫酸終止反應，在酶標儀上測定各孔492nm處的OD值。
顯色結果表明，EPSPS轉基因大豆明顯比常規大豆顯色深，OD492值見表1，證明用本發明的EPSPS抗體及ELISA方法能夠有效地區別EPSPS轉基因大豆和常規大豆。
表1常規大豆和抗草甘膦大豆中的EPSPS對比
序列表1601210121113212PRT213人工序列220
223
4001Met Ser His Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ala Thr Ala Arg1 5 10
權利要求
1.用於製備EPSPS酶抗體的抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的多肽與載體蛋白聯結得到。
2.根據權利要求1所述的抗原，其特徵在於所述多肽的合成方法為固相合成法；所述固相合成法為叔丁氧羰基化學法或9-氟甲氧羰基化學法。
3.根據權利要求1或2所述的抗原，其特徵在於所述載體蛋白聯結於所述多肽的氨基端或羧基端。
4.根據權利要求1或2所述的抗原，其特徵在於所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蛋白匙孔血藍蛋白或卵清白蛋白。
5.根據權利要求1或2所述的抗原，其特徵在於所述將多肽與載體蛋白進行聯結的方法為戊二醛法。
6.EPSPS酶的抗體，是用權利要求1所述的抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到的抗體。
7.根據權利要求6所述的EPSPS酶抗體，其特徵在於所述用於製備EPSPS酶抗體的免疫動物為雞、兔、鼠、羊或馬。
8.一種製備權利要求6所述的EPSPS酶抗體的方法，包括以下步驟1)用權利要求1所述的抗原免疫動物；2)從步驟1)經免疫的動物中分離、純化血清，得到EPSPS酶抗體。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於所述步驟1)中用於製備EPSPS酶抗體的免疫動物為雞、兔、鼠、羊或馬。
10.轉EPSPS免疫檢測試劑盒，其活性成分為要求6所述的EPSPS酶抗體。
全文摘要
本發明公開了一種EPSPS酶的抗體及其製備方法與專用抗原及應用，其目的是提供一種抗除草劑草甘膦的EPSPS酶的抗體及其製備方法與專用抗原及其在製備轉EPSPS免疫檢測試劑盒中的應用。用於製備EPSPS酶抗體的抗原，是將具有序列表中SEQ ID №1的多肽與載體蛋白聯結得到。EPSPS酶的抗體，是用所述抗原免疫動物，再從所免疫的動物中分離、純化血清得到的抗體。該抗體具有下述優點1)具有較高的特異性，可用於轉EPSPS植物中EPSPS的定性、定量分析；2)製備方法簡單，具有工業化生產的可行性。本發明將在轉EPSPS植物的生物檢測領域發揮重要作用，市場前景廣闊。
文檔編號C07K16/40GK1869073SQ20061008930
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月16日 優先權日2006年6月16日
發明者王保民, 劉威, 鄧艾興, 李召虎, 趙靜, 何素平, 南鐵貴, 俞彩霞, 何鍾佩 申請人:中國農業大學