利用dna免疫共沉澱分離和鑑定dna結合蛋白的方法
2023-05-16 14:46:31 3
利用dna免疫共沉澱分離和鑑定dna結合蛋白的方法
【專利摘要】本發明涉及一種分離鑑定DNA結合蛋白的方法，具體涉及利用DNA免疫共沉澱技術分離鑑定DNA結合蛋白的方法。所述分離方法包括：提取細胞的核蛋白；將目標DNA分子與核蛋白混合；加入能夠與該目標DNA分子結合的分子實體，分離得到與目標DNA分子結合的核蛋白組分；對得到的核蛋白組分進行進一步分離，得到DNA結合蛋白。所述鑑定方法還包括對分離得到的DNA結合蛋白進行鑑定的步驟。本發明的方法具有穩定性和重複性好的特點，顯著提高了鑑定未知DNA結合蛋白的實驗效率。為深入研究細胞基因轉錄調控、基因轉錄的分子行為、分子腫瘤學、細胞生物學、生物化學等學科提供了有益的幫助。
【專利說明】利用DNA免疫共沉澱分離和鑑定DNA結合蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分離鑑定DNA結合蛋白的方法，具體涉及利用DNA免疫共沉澱技術分離鑑定DNA結合蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]生物醫學研究已從一個基因一個蛋白的假說演繹到在組學水平分析眾多基因或蛋白的功能。由於細胞的各種生命活動現象紛繁複雜，全基因組的序列信息並不能詮釋細胞的生物功能，而基因的終極產物蛋白才是細胞構成及功能的最終執行者。在細胞生命的過程中，特異基因的開啟和關閉是一個複雜的系統工程，人類基因的轉錄調控一直以來都是生物學家研究的熱點領域。目前，主要利用染色質免疫沉澱技術(ChIP)研究已知蛋白轉錄因子與DNA相互作用，在基因轉錄調控中，轉錄因子及轉錄調節因子與染色質DNA即啟動子區之間存在相互作用，染色質免疫共沉澱技術不僅解決了已知轉錄因子與啟動子DNA直接和間接的相互作用，而且還可以利用實時定量PCR測定轉錄因子與DNA結合的豐度，篩選出轉錄因子所結合的特異的啟動子序列。
[0003]當前，科學家利用大規模的蛋白質組學技術發展並繪製了廣泛的細胞內蛋白質之間相互作用的網絡圖譜。迄今已發展了多種研究蛋白質相互作用的技術方法，包括酵母雙雜交系統、噬菌體展示技術、GSTpy 11-down技術、免疫共沉澱技術和串聯親和純化聯合質譜分析技術，為蛋白質相互作用及蛋白質組學的研究奠定了堅實的基礎。但目前尚缺少利用已知DNA序列分離特異結合細胞核蛋白並進一步鑑定DNA結合蛋白的方法。
【發明內容】
[0004]本發明的發明人經過大量實驗和反覆摸索，提供了一種利用DNA免疫共沉澱技術分離和/或鑑定DNA結合蛋白的方法以及所述方法的用途，具體包括以下幾個方面:
[0005]本發明第一方面涉及一種分離DNA結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0006]I)提取細胞的核蛋白；
[0007]2)將目標DNA分子與核蛋白混合，孵育；
[0008]3)加入能夠與該目標DNA分子結合的分子實體，分離得到與目標DNA分子結合的核蛋白組分；
[0009]4)對步驟3)得到的核蛋白組分進行進一步分離，得到DNA結合蛋白；
[0010]優選地，所述目標DNA分子連接有可檢測的標記。
[0011]在本發明中，所述細胞為真核細胞；所述真核細胞例如可以為哺乳動物細胞；其中所述哺乳動物例如為人、小鼠、大鼠、狗、豬、羊、猴等。
[0012]在本發明中，所述提取細胞核蛋白的方法為本領域所公知。在本發明的實施方案中，所述提取核蛋白的方法包括，採用勻漿器裂解細胞，分離細胞核組分，將核組分經過蔗糖密度梯度離心，純化細胞核組分，並進一步用含有蛋白抑制劑的高鹽裂解液製備細胞核蛋白，然後降低鹽離子濃度，去除核組分的DNA成分。[0013]根據本發明第一方面任一項的方法，其中在步驟I)後還包括去除核蛋白中無關高豐度蛋白的步驟。
[0014]在本發明中，所述無關高豐度蛋白主要包括組蛋白。
[0015]根據本發明第一方面任一項的方法，其中所述去除核蛋白中無關高豐度蛋白的步驟包括:將非特異DNA分子與核蛋白混合，孵育，加入能夠與該非特異DNA分子結合的分子實體，去除能夠與該非特異DNA分子結合的核蛋白；
[0016]優選地，所述非特異DNA分子能夠與無關高豐度蛋白結合。
[0017]根據本發明第一方面任一項的方法，其中所述DNA結合蛋白是指轉錄因子或者轉錄活化因子。
[0018]根據本發明第一方面任一項的方法，其中所述能夠與該DNA分子結合的分子實體為能夠與該標記特異性DNA結合的分子實體；和所述分子實體還偶聯有易分離的物質，例如磁珠。
[0019]在本發明中，所述可檢測的標記為本領域所公知。在本發明的實施方案中，其中所述可檢測的標記為生物素，其中所述能夠與該標記的DNA分子結合的分子實體為親和素，例如鏈黴親和素。
[0020]根據本發明第一方面任一項的方法，其中步驟4)中所述分離得到與目標DNA分子結合的核蛋白組分，包括對結合的核蛋白組分進行洗脫的步驟。
[0021 ] 在本發明中，·可以根據不同的標記分子選擇洗脫液。
[0022]在本發明的實施方案中，所述洗脫液可以將結合在DNA分子上的蛋白複合體洗下，而分子實體與易分離的物質保持結合。
[0023]根據本發明第一方面任一項的方法，其中步驟4)中所述分離的方法為分離蛋白的方法，例如為電泳，例如為蛋白質電泳，例如為聚丙烯醯胺凝膠電泳。
[0024]在本發明的實施方案中，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳可以為SDS-PAGE，脈衝場凝膠電泳(PFGE )，雙向電泳等。
[0025]在本發明的實施方案中，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳為十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
[0026]本發明第二方面涉及一種鑑定DNA結合蛋白的方法，所述方法包括本發明第一方面任一項的方法，以及對分離得到的DNA結合蛋白進行鑑定的步驟；
[0027]任選地，在鑑定後還包括對鑑定得到的蛋白進行比對和分析的步驟。
[0028]在本發明的實施方案中，其中所述鑑定的方法為質譜鑑定方法，例如為高質量精度質譜、MALD1-TOF、LTQ 等。
[0029]本發明第三方面涉及本發明第一或第二方面任一項的方法用於分離和/或鑑定DNA結合蛋白的用途。
[0030]根據本發明第三方面任一項的用途，其中所述DNA結合蛋白為轉錄因子或轉錄活化因子。
[0031]本發明第四方面涉及一種去除核蛋白中無關高豐度蛋白的方法，所述方法包括將非特異DNA分子與核蛋白混合以及孵育的步驟；
[0032]優選地，所述方法還包括加入能夠與該非特異DNA分子結合的分子實體的步驟；
[0033]優選地，所述非特異DNA分子連接有可檢測的標記；[0034]優選地，所述非特異DNA分子能夠與無關高豐度蛋白結合。
[0035]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述能夠與該DNA分子結合的分子實體為能夠與該標記特異性結合的分子實體；和/或，所述分子實體還偶聯有易分離的物質，例如磁珠。
[0036]在本發明中，所述轉錄因子或轉錄活化因子包括通用轉錄因子和調控性轉錄因子，其中通用轉錄因子與RNA聚合酶一起構成了轉錄機器，通過與DNA轉錄起點臨近位點啟動子區結合實現基因轉錄；調控性轉錄因子一般與多樣的增強子序列結合，再與轉錄機器發生作用，調控基因的轉錄；所述轉錄因子例如為p53、c-myc, p300 ;所述轉錄活化因子例如為轉錄活化因子-3 (STAT3)、轉錄活化因子-1 (STATl)等。
[0037]在本發明中，所述目標DNA分子可以為任何感興趣的DNA分子，例如可以為任何感興趣序列，例如為任何感興趣的基因的調控基因部分(例如啟動子序列，增強子序列)。在本發明的實施方案中，所述目標DNA分子為基因的啟動子序列或其部分序列。
[0038]在本發明中，所述非特異DNA分子可以為任何能夠與組蛋白結合的DNA雙螺旋分子，例如為與目標DNA分子不同的DNA分子,例如為基因組中的外顯子DNA部分，例如為目標DNA分子的基因外顯子DNA部分。
[0039]在本發明中，所述能夠與組蛋白結合的DNA分子是指該DNA分子所攜帶的負電荷足以與組蛋白結合以形成DNA-組蛋白複合物；優選地，該DNA分子能夠被標記分子所標記。
[0040]在本發明中，所述非特異DNA分子的長度例如為大於lOObp，例如為大於200bp。[0041 ] 在本發明中，所述外顯子DNA是指編碼蛋白質序列的基因的DNA序列。
[0042]在本發明中，所述調 控基因是指調控基因轉錄的DNA序列。
[0043]發明的有益效果
[0044]本發明的方法具有穩定性和重複性好的特點，顯著提高了鑑定未知DNA結合蛋白的實驗效率。為深入研究細胞基因轉錄調控、基因轉錄的分子行為、分子腫瘤學、細胞生物學、生物化學等學科提供了有益的幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1:整個分離純化及鑑定過程模式圖。
[0046]引物5』端標記上生物素後進行PCR擴增出目的片段。引入一段與目的片段相當的隨機對照片段以除去核組分中高豐度的蛋白，如組蛋白。將對照片段與鏈黴親和素磁珠孵育，使片段5』端帶上磁珠，再加入核組分蛋白中進行孵育，使對照片段與核組分充分結合，通過磁力系統分離出對照片段結合的大部分非特異高豐度蛋白。然後將去除過高豐度蛋白的核組分再與目的片段孵育，抓取片段特異結合的蛋白分子，將這些蛋白洗脫後走膠銀染，發現其中的特異性條帶，切膠進行質譜鑑定。
[0047]圖2:經過富集和未經過富集的SDS-PAGE圖。其中BC8S為未經過與非特異片段(對照片段)孵育的電泳結果，BM5為經過與未特異片段孵育的電泳結果。其中BM5P2是指將核組分進行了一次對照片段去除高豐度蛋白後的電泳結果，BM5P3是指將核組分進行了兩次對照片段去除高豐度蛋白後的電泳結果。可以看到與未進行富集的組BC8S相比，BM5P2和BM5P3大部分條帶有逐漸加強的趨勢，如35-40kDa之間的條帶。
[0048]圖3 =SDS-PAGE及質譜鑑定結果圖[0049]如圖所示(其中BC8S、BM5P2和BM5P3的含義與圖2相同)，基於DIP方法富集了BM5P3片段特異結合的蛋白。取上圖箭頭所指處的特異性條帶，切膠，進一步質譜鑑定。中圖為鑑定樣本的一級分離譜圖，箭頭框包括的部分是我們感興趣的其中一個肽段所處在的分離位置，下圖為該蛋白的二級質譜圖，經過搜庫該肽段對應的蛋白是PURA (核轉錄因子)。
[0050]圖4:DNA與PURA的相互作用
[0051]Western blotting分析驗證了特異DNA序列與PURA (PUR α )的相互作用，食管癌細胞系KYSE510細胞核蛋白提取，經DIP方法免疫共沉澱，免疫印跡分析驗證質譜的鑑定的轉錄因子PURA，文獻調研發現TORA與E2F家族有相互調控關係，免疫印跡驗證了該特異DNA序列與PURA和E2F-2蛋白都具有相互作用。
[0052]圖5:DNA與PARP的相互作用 [0053]Western blotting分析驗證了特異DNA序列與PARP-1的相互作用，圖中NP為未經處理的食管癌細胞系KYSE510細胞核組分蛋白，I~4為經過非特異序列去除高豐度蛋白，再經目的的DNA序列結合的蛋白複合體組分。經DIP免疫共沉澱，免疫印跡分析驗證了核因子PARP-1與特異DNA的相互作用。
【具體實施方式】
[0054]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0055]實施例1:採用DNA免疫共沉澱聯合質譜鑑定I3URA轉錄因子
[0056]1.核組分蛋白的提取
[0057]I)使用T75培養瓶培養食管癌細胞KYSE510 (由日本Kyoto大學Shimada教授惠贈)，使用4°C預冷的IXPBS洗細胞，IOml/次Xl次。用胰酶消化下來後，完全培養基(RPMI1640,含10%胎牛血清)IOml終止胰酶翻譯，PBSlOml/次X 2次洗細胞，棄掉PBS留下沉澱細胞；用 ImL Buffer AClOmM HEPES, pH7.9，1.5mM MgCl2, IOmM NaCl, 0.5mM DTT)重懸細胞，置於冰上15min ；
[0058]2)在步驟I)的細胞懸液中加入終濃度0.3%NP40裂解液(50mM Tris (pH7.4)，150mM NaCl, 1%NP_40)，混勻後將細胞懸液加入勻漿器中，上下勻漿20次；
[0059]3)勻漿後，將細胞裂解懸液至228g，4°C離心lOmin，棄去上清；
[0060]4)用 3OO μ I Buffer B (0.3M sucrose(蔗糖)，IOmM HEPES, pH7.9, 5mM MgCl2, IOmMNaCl)重懸細胞核沉澱，在另一個管中加入900 μ I buffer C (1.8M sucrose, IOmMHEPES, ρΗ7.9，5mMMgCl2, IOmM NaCl )，將重懸液加到 buffer C 中；
[0061]5)4°C條件下，25000g離心35min,棄掉上清,小心保留沉澱；
[0062]6)加入Iml Buffer B洗兩遍沉澱；
[0063]7)取 Iml 左右 Buffer D (IOmM HEPES, pH7.9, 1.5mMMgCl2, 0.42M NaCl, 0.5mMDTT, 0.3M sucrose, 0.5%Triton X-100)加入蛋白酶抑制劑(該蛋白酶抑制劑包括AEBSF、抑肽酶、抑氨肽酶、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、PMSF(氟化苯基甲磺醯氟)，Roche公司)，裂解以上所得沉澱，渦旋震蕩，4°C條件下，充分裂解；[0064]8)將裂解液分裝於兩個1.5ml離心管中，4°C離心，15min。收集上清，Bradford法蛋白定量。lmg/ml蛋白裂解液分裝到Iml凍存管中，冰上保存。
[0065]2.生物素標記DNA片段的製備
[0066]I)確定目標DNA片段和非特異DNA的序列，以及目標DNA片段和非特異DNA片段的引物序列，合成引物，同時在5』端加上生物素標記；
[0067]A.非特異DNA序列如下:
【權利要求】
1.一種分離DNA結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: 1)提取細胞的核蛋白； 2)將目標DNA分子與核蛋白混合，孵育； 3)加入能夠與該目標DNA分子結合的分子實體，分離得到與目標DNA分子結合的核蛋白組分； 4)對步驟3)得到的核蛋白組分進行進一步分離，得到DNA結合蛋白； 優選地，所述目標DNA分子連接有可檢測的標記。
2.權利要求1的方法，其中在步驟I)後還包括去除核蛋白中無關高豐度蛋白的步驟。
3.權利要求2的方法，其中所述去除核蛋白中無關高豐度蛋白的步驟包括:將非特異DNA分子與核蛋白混合，孵育，加入能夠與該非特異DNA分子結合的分子實體，去除能夠與該非特異DNA分子結合的核蛋白； 優選地，所述非特異DNA分子連接有可檢測的標記； 優選地，所述非特異DNA分子能夠與無關高豐度蛋白結合。
4.權利要求1的方法，其中所述DNA結合蛋白是指轉錄因子或者轉錄活化因子。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述能夠與該DNA分子結合的分子實體為能夠與該標記特異性結合的分子實體；和/或，所述分子實體還偶聯有易分離的物質，例如磁珠。
6.權利要求1-4的方法，其中所述標記為生物素，其中所述能夠與該標記的DNA分子結合的分子實體為親和素， 例如鏈黴親和素。
7.權利要求1的方法，其中所述分離得到與目標DNA分子結合的核蛋白組分，包括對結合的核蛋白組分進行洗脫的步驟。
8.權利要求1的方法，其中步驟4)中所述分離的方法為分離蛋白的方法，例如為電泳，例如為蛋白質電泳，例如為聚丙烯醯胺凝膠電泳。
9.一種鑑定DNA結合蛋白的方法，所述方法包括權利要求1-8任一項的方法，以及對分離得到的DNA結合蛋白進行鑑定的步驟； 任選地，在鑑定後還包括對鑑定得到的蛋白進行比對和分析的步驟。
10.權利要求9的方法，其中所述鑑定的方法為質譜鑑定方法。
11.權利要求1-10任一項的方法用於分離和/或鑑定DNA結合蛋白的用途；優選地，其中所述DNA結合蛋白為轉錄因子或轉錄活化因子。
12.—種去除核蛋白中無關高豐度蛋白的方法，所述方法包括將非特異DNA分子與核蛋白混合的步驟； 優選地，所述方法還包括加入能夠與該非特異DNA分子結合的分子實體的步驟； 優選地，所述非特異DNA分子連接有可檢測的標記； 優選地，所述非特異DNA分子能夠與無關高豐度蛋白結合。
13.權利要求12的方法，其中所述能夠與該DNA分子結合的分子實體為能夠與該標記特異性結合的分子實體；和/或，所述分子實體還偶聯有易分離的物質，例如磁珠。
【文檔編號】C07K1/14GK103739664SQ201410042740
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月29日 優先權日:2014年1月29日
【發明者】趙曉航, 許楊, 林正偉, 郭志敏, 趙楠 申請人:中國醫學科學院腫瘤醫院, 中國人民解放軍海軍總醫院