乳糖酶溶液及使用其的乳製品的製作方法

2023-05-18 04:41:41

本發明涉及乳糖酶溶液及使用其的乳、乳製品等。
背景技術：
：：乳糖(lactose)不耐受症是指：由於先天性地無法順利分解乳糖，因此會因乳製品等食品中的乳糖而呈現腹痛、腹瀉等諸多症狀的狀態。乳糖為由半乳糖及葡萄糖構成的二糖。為了應對乳糖不耐受症，在食品製造業中進行的是：利用酶乳糖酶使牛奶等中所含的乳糖預先分解為半乳糖和葡萄糖。為了將牛奶等的乳糖分解而使用的乳糖酶溶液一直以來通過以下方式來製造，即，培養乳糖酶產生微生物，從細胞內提取乳糖酶，除去源自培養物的夾雜物而進行純化，然後添加穩定劑，進行過濾滅菌。專利文獻1(日本特公昭60-18394號公報)中公開了由kluyveromyceslactis的某菌株的培養物製造乳糖酶的製造法的發明。根據該方法，在使酵母菌體自消化後，將所得的粗酶溶液通入deae纖維素柱，並利用食鹽濃度梯度進行溶出時，得到2個活性種類(乳糖酶a及乳糖酶b)。並且，公開了這兩個活性種類除了ph穩定性略有不同以外，包括溫度穩定性在內的各種性質幾乎沒有差異，酶製劑可由它們的混合物構成。另外，根據kluyveromyceslactis的乳糖酶的基因解析，推斷出該乳糖酶為包含1025胺基酸的多肽、且分子量為117，618(非專利文獻1)。進而，專利文獻1記載的乳糖酶的最佳溫度為40～50℃，並且記載了在ph7.0下在50℃、10分鐘時失活45％，在55℃、10分鐘時失活100％。但是，並未記載使用該酶使實際上乳中所含的乳糖分解的情況。因此，對於在原料乳中添加乳糖酶時的活性降低、尤其是在乳中施加40℃以上的熱負荷時的酶失活的問題並無任何記載。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特公昭60-18394號公報專利文獻2：日本特表2004-534527號公報專利文獻3：日本特表2009-517061號公報非專利文獻非專利文獻1：pochetal.，gene1992sep1；118(1)：55-63技術實現要素：發明要解決的課題本發明的目的在於提供熱穩定性優異的乳糖酶溶液。用於解決課題的手段本發明人等發現在乳糖酶中通過提高在sds聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds-page)中形成約120kda的條帶的級分的比例，從而使乳糖酶具有高熱穩定性，從而完成了本發明。因此，根據本發明，提供以下技術方案。[1]一種乳糖酶溶液，其特徵在於，基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量約120kda的乳糖酶級分的比例為20％以上；[2]根據[1]所述的乳糖酶溶液，其特徵在於，上述120kda的乳糖酶級分的比例與基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量約80kda的乳糖酶級分的比例之和為30％以上；[3]根據[1]所述的乳糖酶溶液，其特徵在於，基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量約50kda的乳糖酶級分的比例為70％以下；[4]根據[1]～[3]中任一項所述的乳糖酶溶液，其特徵在於，上述約120kda的乳糖酶級分的比例與上述約80kda的乳糖酶級分的比例之和除以基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量約50kda的乳糖酶級分的比例所得的值為0.5以上；[5]根據[1]～[4]中任一項所述的乳糖酶溶液，其特徵在於，其用於製造乳製品；[6]一種乳製品，其含有[1]～[5]中任一項所述的乳糖酶溶液；[7]一種原料乳的處理方法，其特徵在於，將[1]～[5]中任一項所述的乳糖酶溶液添加到原料乳中，並使該原料乳中所含的乳糖在1～60℃下分解；[8]一種乳糖酶溶液的製造方法，其特徵在於，包括：培養工序，對微生物進行培養；回收工序，從利用上述培養工序得到的培養物中回收乳糖酶；以及純化工序，對利用上述回收工序所回收的乳糖酶進行純化，其中，上述純化工序包括1次或多次進行鹽析處理及脫鹽處理的工序；[9]根據[8]所述的乳糖酶溶液的製造方法，其特徵在於，上述鹽析處理包括：飽和工序，使鹽析劑在上述回收的乳糖酶中10～90％飽和；放置工序，在上述飽和工序後將乳糖酶在4～40℃放置1～80小時；[10]根據[8]或[9]所述的乳糖酶溶液的製造方法，其特徵在於，上述鹽析處理在ph4～9下進行。發明效果根據本發明，可提供即使在添加到原料乳中並施加40℃以上的熱負荷的情況下乳糖分解活性也不易降低的乳糖酶溶液。附圖說明圖1為表示各種乳糖酶溶液的sds-page的結果的圖。泳道1＝實施例1-1、泳道2＝實施例1-2、泳道3＝比較例1-1、泳道4＝比較例1-2、泳道5＝比較例2、泳道6＝比較例3、泳道m＝分子量標準品。予以說明，泳道1及2、泳道3及4表示基於不同的lot的結果。圖2為表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而在43℃、2小時的乳糖分解反應後的sds-page(面板a)及western印跡(面板b)的結果的圖。在各面板中，泳道1＝實施例1-1、泳道2＝實施例1-2、泳道3＝比較例1-1、泳道4＝比較例1-2、泳道5＝比較例2、泳道6＝比較例3、泳道m＝分子量標準品。圖3a為表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而使其在37、40、43、46及49℃反應時的乳糖量的經時變化的圖。關於圖中的圖標，□表示實施例1的結果，○表示比較例1的結果，▲表示比較例2的結果，△表示比較例3的結果。圖3b為表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而使其在37、40、43、46及49℃反應時的乳糖分解率的經時變化的圖。關於圖中的圖標，□表示實施例1的結果，○表示比較例1的結果，▲表示比較例2的結果，△表示比較例3的結果。圖4為表示120kda級分的比例不同的乳糖酶溶液的sds-page的結果的圖。泳道1＝實施例1、泳道2＝實施例2、泳道3＝實施例3、泳道4＝實施例4、泳道5＝實施例5、泳道6＝比較例1、泳道m＝分子量標記物。圖5為表示在原料乳中添加120kda級分的比例不同的乳糖酶溶液而使其在49℃反應時的乳糖量(面板a)及乳糖分解率(面板b)的經時變化的圖。關於圖中的圖標，□表示實施例1的結果，◇表示實施例2的結果，▲表示實施例3的結果，×表示實施例4的結果，*表示實施例5的結果，○表示比較例1的結果。具體實施方式本發明中所使用的乳糖酶為源自酵母(kluyveromyces屬)的乳糖酶。這些乳糖酶的絕大部分是最佳ph為ph＝6～ph＝8的所謂中性乳糖酶。作為kluyveromyces屬的乳糖酶產生酵母，可列舉例如kluyveromyceslactis、kluyveromycesfragillis、kluyveromycesmarxianus等。本發明的乳糖酶溶液理想地具有10～100,000nlu/g的乳糖酶活性。「nlu」為neutrallactaseunit。活性的測定方法如以下所示。利用使基質鄰硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷(onpg)成為鄰硝基苯酚及半乳糖的水解來測定。反應通過碳酸鈉的添加而結束。所形成的鄰硝基苯酚在鹼性介質中成為黃色，吸光度的變化被用於測定酶活性(以nlu/g表示)。該步驟被公示於「美國食品化學物質規格集(fcc；foodchemicalscodex)第4版、1996年7月1日、第801～802頁/乳糖酶(中性)(β-半乳糖苷酶)活性中。本發明所使用的乳糖酶溶液可以為按照以下的方法從微生物中回收並純化後的乳糖酶溶液。本發明的乳糖酶溶液的製造方法經過以下的4個工序。即，(1)微生物的培養工序、(2)從微生物中的乳糖酶回收工序、(3)乳糖酶的純化工序、及(4)乳糖酶活性的調整工序。以下，對上述4個工序的詳細情況進行說明。(1)關於微生物的培養工序，只要使用公知的培養基並且使用公知的菌株即可。培養條件也公知，可以根據需要進行適當選擇。(2)關於從微生物中的乳糖酶回收工序，在為細胞內酶時，需要包含提取乳糖酶的工序。該提取工序只要是使乳糖酶轉移至細胞外的方法，則並無特別限定，可以使用公知的提取方法。另一方面，若為通過基因引入、變異等而將乳糖酶分泌至細胞外的酶，則使該培養液包含乳糖酶，因此不需要本提取工序。(3)為了得到本發明的乳糖酶溶液，乳糖酶的純化工序較為重要。專利文獻1、專利文獻2及專利文獻3的共同點在於均利用色譜法純化乳糖酶溶液。通過進行該色譜法，從而進行乳糖酶的純化，可以使乳糖酶活性提高。但是，若如後述那樣使用色譜法(分配色譜法或分子篩色譜法、吸附色譜法或離子交換色譜法等)純化乳糖酶，則判明原本120kda的乳糖酶會分別分解為80kda及50kda的乳糖酶。任一分子量的乳糖酶均具有乳糖酶活性，但是在乳糖酶被分解，尤其是50kda的級分的比例增加時，乳糖酶的熱穩定性降低，結果產生在較高溫度下乳糖不易進行分解的問題。本發明的乳糖酶可以通過在純化工序中使用鹽析和脫鹽處理來得到。即，利用鹽析使乳糖酶沉澱後，將該沉澱物回收、再溶解，將沉澱物中所含的鹽進行脫鹽，由此得到本發明的乳糖酶。鹽析、沉澱物的回收、再溶解及脫鹽可以連續進行。另外，只要得到本發明的乳糖酶，則也可以並用其他純化手段(包括色譜法、活性炭處理)。120kda的乳糖酶通過鹽析而不被分解的理由可推測為：通過鹽析而使乳糖酶以高分子形式析出且不溶化，因此導致反應性變低。作為進行鹽析的鹽析劑，可列舉硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀，可以使用其中的1種或2種以上。當在包含乳糖酶的溶液中添加作為鹽析劑的硫酸銨時，優選達到10～90％飽和，更優選達到30～70％飽和。在使用其他鹽析劑時，只要使用與該硫酸銨的添加量相當的量即可。通過添加硫酸銨等鹽析劑，從而可以從包含乳糖酶的溶液中使乳糖酶沉澱。從鹽析劑的添加至使乳糖酶沉澱的條件優選在1～40℃下放置1～80小時。此時的ph條件優選為4～9。更優選4～25℃(室溫)、1～48小時、ph5～8。予以說明，關於溫度條件的下限值，只要為不使包含乳糖酶的溶液凝固的溫度即可。利用過濾將包含乳糖酶的液體與包含乳糖酶的沉澱物進行固液分離後，使固體狀的乳糖酶再度溶解於水或緩衝液等中，利用透析或超濃縮進行脫鹽處理。(4)乳糖酶活性的調整工序只要能夠調整乳糖酶的活性，則並無限制。例如為水、包含鹽類的水溶液的添加、穩定劑的添加等。本發明的乳糖酶溶液也可以在基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量級分的比例滿足規定比例的範圍內將市售的乳糖酶溶液和利用上述的方法得到的乳糖酶溶液混合來得到。乳糖酶溶液中的乳糖酶的分子量可以利用使用10％聚丙烯醯胺凝膠的sds-page進行估算。例如，將乳糖酶溶液根據需要用純化水進行稀釋，並與sds-page用samplebuffer按照1∶1混合，利用95度、5分鐘的加熱處理來製備泳動用樣品。對10％丙烯醯胺凝膠供給標準品及泳動用樣品，進行泳動。標準品使用bio-rad#161-0313(經過預染)等。泳動後的凝膠利用cbb染色液(aprosp-4010)進行蛋白染色。本發明的乳糖酶溶液在sds-page及cbb染色後使用tefco聚丙烯醯胺凝膠乾燥試劑盒(商品名cleardrysolution)使其乾燥。乾燥後的凝膠利用epson公司制掃描儀gt-x820以灰色標度的圖像的形式取入，利用imagej軟體(nih，bethesda，md)測定各條帶的濃度(蛋白量)。本發明的乳糖酶溶液的特徵在於利用上述的方法測定的分子量約120kda的級分的比例高。在本發明中，「基於sds聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量約120kda的乳糖酶級分」是指：在利用上述的方法進行電泳後，與分子量標準品的遷移率相比，在相當於約120kda的位置(約100kda～約150kda之間)形成條帶的分子的級分。本發明的乳糖酶溶液在sds-page及cbb染色後利用imagej軟體(nih，bethesda，md)測得的約120kda的級分的比例為20％以上、優選為50％以上、更優選為80％以上、最優選為90％以上。上限值並無特別限定，例如為100％。該比例利用下述的方法來計算。在sds-page及cbb染色後，使用imagej軟體(nih，bethesda，md)對各條帶的濃度進行定量，計算將包含相當於約120kda(100～150kda)、約80kda(80～100kda)、約50kda(49～54kda)及約30kda(28～32kda)的條帶的主要條帶的全體設為100％時的約120kda的條帶的比例。關於本申請的技術方案中的記載，只要沒有特別記載，則記載的是將上述4個條帶的整體設為100％時的值。本發明的乳糖酶溶液利用與上述同樣的方法計算出的約80kda的級分的比例與上述120kda的級分的比例之和優選為30％以上、更優選為60％以上、進一步優選為90％以上。上限值並無特別限定，例如為100％。若約120kda的乳糖酶(以下有時稱作乳糖酶i)分解，則成為約80kda的乳糖酶(以下有時稱作乳糖酶ii)，若乳糖酶i或乳糖酶ii分解，則成為約50kda的乳糖酶(以下有時稱作乳糖酶iii)。乳糖酶溶液中的乳糖酶i及乳糖酶ii均具有乳糖酶活性及耐熱性。乳糖酶iii具有乳糖酶活性，但是耐熱性不充分。即使對於任一級分，乳糖酶活性也是同等的。乳糖酶ii為乳糖酶i的分解物，因此從耐熱性的觀點出發，優選使乳糖酶溶液中的乳糖酶i的比例多於乳糖酶ii。乳糖酶溶液中的乳糖酶iii的比例優選為70％以下，更優選為40％以下，進一步優選為10％以下。下限值並無特別限定，例如為0％。乳糖酶i的比例與乳糖酶ii的比例之和除以乳糖酶iii的比例所得的值優選設為0.5以上、更優選為1.0以上、進一步優選為5.0以上。若不足0.5，則存在耐熱性不足的傾向。最優選使乳糖酶溶液中完全不包含乳糖酶iii、即、乳糖酶iii為零，因此上限值並無限定。原料乳是添加乳糖酶溶液的對象。本發明中，只要使用公知的原料乳即可。原料乳包括殺菌前的原料乳和殺菌後的原料乳。原料乳只要是使用乳的原料乳即可。作為構成原料乳的材料，可列舉水、生乳、殺菌處理後的乳、脫脂乳、全脂粉乳、脫脂粉乳、酪乳、黃油、奶油、乳清蛋白濃縮物(wpc)、乳清蛋白分離物(wpi)、α-la、β-lg等。通過將本發明的乳糖酶溶液添加到原料乳中，從而可以使該原料乳中所含的乳糖分解。分解溫度為1～60℃，分解時間為10分鐘～24小時。作為乳糖酶溶液的具體利用形態，例如被用於製造發酵乳。經乳糖分解的發酵乳的製造方法包括：1.在殺菌前的乳中添加乳糖酶而進行乳糖的分解後，在乳的加熱殺菌的同時使乳糖酶失活，之後使乳發酵的方法(日本特開平5-501197號公報)；2.在殺菌乳中添加乳糖酶進行乳糖的分解後，利用加熱處理使乳糖酶失活，之後使乳發酵的方法；3.利用固定化的乳糖酶將乳中的乳糖分解後，使乳發酵的方法(日本特開昭46-105593號公報、日本特開昭59-162833號公報)；4.將預先經過乳糖分解或乳糖除去後的原材料用於殺菌乳而使其發酵的方法等。本發明的乳糖酶溶液特別適合用於製造乳製品。在此，乳製品是指：冰激凌、長保質期的牛奶等牛奶類、酸奶、鮮奶油、酸奶油、乳酪等。本發明的乳糖酶溶液尤其可優選用於施加40℃以上的熱負荷的情況。作為此種用途，包括例如酸奶。實施例1.乳糖酶溶液的製造(實施例1)將含有玉米漿7％、乳糖2％的液體培養基加壓殺菌後(殺菌後的ph5.5)，接種kluyveromyceslactisno.013-2(atcc8585株)，在30℃且12000l/min的通氣下培養24小時。培養結束後，邊冷卻邊放置4小時後，從罐上部除去上清液，在罐底部得到凝聚沉降了的菌體1500kg。接著，將在此得到的菌體中的1500g用自來水清洗後，加入甲苯80ml進行混合後，加入1500ml的0.05m磷酸緩衝液(ph7.0)，進行攪拌使其均勻，蓋嚴，在30℃放置15小時，使其自消化。將該消化液離心分離，在所得的上清2500ml中加入等容的冷丙酮，放置一夜。將產生的沉澱通過離心分離進行收集，溶入600ml的自來水中，得到濃縮前酶溶液。邊將該濃縮前酶溶液600ml冷卻至4℃，邊用60分鐘一點點地添加硫酸銨粉末，得到50％飽和水溶液。將該水溶液在4℃放置(靜置)80小時，使乳糖酶沉澱後，利用過濾進行固液分離，回收固體狀的乳糖酶。使該乳糖酶再度溶解於600ml的自來水後，進行超濃縮。在脫鹽後的乳糖酶中添加自來水，按照使終濃度達到50％的方式添加甘油，得到實施例1的乳糖酶溶液(5,000nlu/g)。(實施例2)將實施例1的乳糖酶溶液和下述比較例1按照重量比達到80∶20的方式進行混合，得到實施例2的乳糖酶溶液(5,000nlu/g)。(實施例3)將實施例1的乳糖酶溶液和下述比較例1按照重量比達到60∶40的方式進行混合，得到實施例3的乳糖酶溶液(5,000nlu/g)。(實施例4)將實施例1的乳糖酶溶液和下述比較例1按照重量比達到40∶60的方式進行混合，得到實施例4的乳糖酶溶液(5,000nlu/g)。(實施例5)將實施例1的乳糖酶溶液和下述比較例1按照重量比達到20∶80的方式進行混合，得到實施例5的乳糖酶溶液(5,000nlu/g)。(比較例1)將市售的乳糖酶製劑即商品名「godo-ynl2ss」(合同酒精公司制、5000nlu/g)作為比較例1的乳糖酶溶液。(比較例2)將市售的乳糖酶製劑即商品名「maxilactlg5000」(dsm公司制、5000nlu/g)作為比較例2的乳糖酶溶液。(比較例3)將市售的乳糖酶製劑即商品名「maxilactlgx5000」(dsm公司制、5000nlu/g)作為比較例3的乳糖酶溶液。2.乳糖酶溶液的電泳將乳糖酶溶液用milliq水稀釋成10nlu/g，與sds-page用samplebuffer(0.125mtris-hclph6.8、0.0125％溴百裡酚藍、20％甘油、2.5％sds、2.5％2-巰基乙醇)以1∶1進行混合，利用95℃、5分鐘的加熱處理製備泳動用樣品。對10％丙烯醯胺凝膠(4％積層凝膠、凝膠厚1mm、泳動距離50mm)供給分子量標準品及泳動用樣品，利用marisol產業泳動漕，以堆積(ス夕ッキング)10ma恆定電流、分離(セパレ一ティンゲ)20ma泳動至泳動前線到達凝膠下端附近。分子量標準品(泳道m)使用bio-rad#161-0313(經過預染)。泳動後的凝膠利用cbb染色液(aprosp-4010)進行1小時的蛋白染色。結果如圖1所示。實施例1的乳糖酶溶液(泳道1及2)僅觀察到分子量約120kda的主條帶，與此相對，比較例1(泳道3及4)中，分子量約120kda的條帶大部分消失，檢測到分子量約80kda、約50kda、約30kda的3條主條帶。比較例2(泳道5)、比較例3(泳道6)均未觀察到分子量約120kda的條帶以及分子量約80kda的條帶，主條帶為約50kda、約30kda這兩條。具有乳糖酶活性的是約120kda、約80kda及約50kda的條帶，約30kda的條帶並不具有乳糖酶活性。3.各條帶的定量及結果1利用上述的方法，對泳動後的凝膠通過條帶的定量計算出比例。結果如表1所示。表1記載了包含全部條帶的值。進而，在表2中示出計算出僅以主要的4個條帶為全體的各個條帶的比例的結果。表1～表4中，即使將各實施例、比較例等的值進行合計也不為100的原因在於，將所得的測定結果的小數點第2位進行了四捨五入。雖然未示於表1、2中，但是與上述實施例1等同樣地對通過追加試驗專利文獻1的實施例1所得的a種類及b種類進行了電泳，結果顯示出與比較例2、3同樣的傾向。表1表1實施例1-1實施例1-2比較例1-1比較例1-2比較例2比較例3約12萬78.876.613.08.73.93.5約8萬23.914.15.33.5約5萬25.732.636.737.9約3萬37.543.053.755.1其他21.223.51.60.4表2表2實施例1-1實施例1-2比較例1-1比較例1-2比較例2比較例3約12萬100.0100.013.08.93.93.5約8萬23.914.35.33.5約5萬25.733.136.937.9約3萬37.543.753.955.14.乳糖分解反應後的電泳及western印跡在uht殺菌(130℃、2秒)牛奶(商品名「明治美味牛奶」、株式會社明治制)中分別按照終濃度達到0.05％(w/v)的方式添加實施例1的乳糖酶溶液(泳道1及泳道2)、比較例1(泳道3及泳道4)、比較例2(泳道5)或比較例3(泳道6)，在43℃下進行2小時乳糖分解反應。將反應後的溶液用純化水稀釋成20倍(w/v)，與上述同樣地與sds-page用samplebuffer以1∶1進行混合，利用95℃、5分鐘的加熱處理製備出泳動用樣品。對2片10％丙烯醯胺凝膠供給分子量標準品及泳動用樣品，同時進行泳動。分子量標準品(泳道m)使用bio-rad#161-0313(經過預染)。泳動後的凝膠中的1片與上述同樣地利用cbb染色液進行蛋白染色，另1片供於western印跡。western印跡的轉印膜使用硝基纖維素膜片(bio-rad#162-0114)，利用溼法方式進行轉印。轉印後的膜片利用blockace溶液(雪印乳業blockace粉末4g/純化水100ml)進行封閉(blocking)操作後，用tween-pbs進行清洗。作為一次抗體，使用按照以下方式自家製備的抗乳糖酶多克隆抗體。進行實施例1所得的乳糖酶溶液的sds-page，利用凝膠將120kda的條帶切細碎後，與difco公司制弗氏完全佐劑(adjuvantcompletefreund)混合，進行乳化。將其在balb-c小鼠的尾部根部皮下注射共計3次，確認到血清中抗體效價的上升後，將所採集的全血的離心分離上清作為抗乳糖酶多克隆抗體。利用該抗體可以檢測乳糖酶的120、80、50kda的條帶。使上述的抗乳糖酶抗體在用blockace稀釋液(將blockace溶液用純化水稀釋10倍)稀釋成1,000倍的液體中於室溫反應2小時。用tween-pbs清洗4次後，使2次抗體(gorta-mouseigg(h+l)-hrp；southernbiotech1034-05)在用blockace稀釋液稀釋成5,000倍的液體中於室溫反應2小時。用tween-pbs清洗後，利用3，3』-二氨基聯苯胺(dab)進行染色。dab基質使用dabbuffertablets(merck1.02924.0001)。結果如圖2所示。在cbb染色像(面板a)中，無論乳糖酶溶液為何，均觀察到大致同樣的結果。與此相對，在western印跡的結果(面板b)中，與反應前的乳糖酶溶液同樣地觀察到由乳糖酶溶液帶來的不同。即，實施例1僅觀察到分子量約120kda的主條帶，與此相對，比較例1中，分子量約120kda的條帶大部分消失，檢測到分子量約80kda、約50kda這2條主條帶。比較例2或比較例3均未觀察到分子量約120kda的條帶以及分子量約80kda的條帶，主條帶為約50kda。由以上可知：在分解反應的前後各乳糖酶溶液中所含的乳糖酶的分子量及各分子量級分的比例均未觀察到變化。5.乳糖分解試驗1在uht殺菌牛奶(130℃、2秒)中分別按照終濃度達到0.05％(w/v)(2.5nlu/100ml牛奶)的方式添加實施例1的乳糖酶溶液、比較例1、比較例2及比較例3，在49℃、46℃、43℃、40℃及37℃下進行乳糖分解反應。經時性地以hplc(transgenomiccarbosepcho620柱)測定乳糖分解反應前的乳糖含量和反應中的乳糖含量(watersalliancehplc系統、柱溫：85℃、溶劑：h2o、流速：0.5ml/min、檢測器：waters2414ri檢測器)。乳糖分解率按照以下方式來計算。乳糖分解率(％)＝100-(使用各實施例或各比較例的乳糖酶溶液的乳糖分解反應後的牛奶中所含的乳糖含量/使用各實施例或各比較例的乳糖酶溶液的乳糖分解反應前的牛奶中所含的乳糖含量)×100)結果如圖3所示。圖3a示出乳糖量，圖3b示出乳糖分解率的經時變化的結果。通過2小時的反應，而在37℃下在實施例1、比較例1、比較例2或比較例3中未觀察到分解率的差異，但是，確認到以下傾向：隨著反應溫度的上升，實施例1的分解率最高，比較例1次高，分解率最低的是比較例2或比較例3。如上述所示，可知：本發明的乳糖酶溶液即使在提高反應溫度的情況下乳糖酶也不失活，熱穩定性高。實施例1的乳糖酶溶液通過提高溫度而也可以以較短的反應時間更有效地分解乳糖。予以說明，即使在不同lot的乳糖酶溶液中也確認到該結果的再現性。各乳糖酶溶液中的主要的乳糖酶級分的分子量在反應前後未發生變化，因此可認為分解率的降低是由反應中乳糖酶的活性降低而產生的。另外，120kda級分的含量越高，則在40℃以上的反應中的分解率越高。6.混合乳糖酶溶液的研究將實施例1的乳糖酶溶液和比較例1的乳糖酶溶液以上述比例進行混合，並對所得的乳糖酶溶液、實施例2～5進行以下研究。6-1.各條帶的定量及結果2對於實施例2～5，利用上述的方法進行電泳後，進行各條帶的定量。電泳的結果如圖4所示，定量的結果如表3所示。表3記載了包含全部條帶的值。進而，在表4中示出計算出僅以主要的4個條帶為全體的各條帶的比例的結果。予以說明，為了比較而示出對實施例1及比較例1也同時進行泳動及定量的結果。表3表3實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5比較例1約12萬82.877.866.544.323.85.5約8萬1.92.26.37.712.9約5萬11.716.326.332.738.8約3萬4.913.821.932.540.8其他17.23.71.21.13.42.0表4表4實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5比較例1約12萬100.080.867.344.824.65.7約8萬2.02.26.47.913.1約5萬12.116.526.633.839.6約3萬5.114.022.233.641.7乳糖分解試驗2使用實施例1～5及比較例1的乳糖酶溶液，利用上述的乳糖分解試驗的方法在49℃進行乳糖分解反應。所得的結果示於圖5。面板a示出乳糖量，面板b示出乳糖分解率的經時變化的結果。確認到：隨著約120kda的條帶增加，乳糖分解加劇。因此，基於上述的結果可以說：在sds-page中約120kda的主帶為20％以上的乳糖酶溶液與在sds-page中具有分子量約80kda、約50kda及約30kda的主帶的乳糖酶溶液相比耐熱性較高。當前第1頁12當前第1頁12