一種全層生物角膜及其構建方法和用途的製作方法

2023-05-18 07:01:01

專利名稱：一種全層生物角膜及其構建方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學和生物工程中的醫用材料領域，尤其涉及以異種角膜脫細胞 基質為載體在生物反應器中培養構建而成的全層生物角膜,這種生物角膜可用於 生理、藥理和病理學基礎研究，又可作為供體應用於角膜移植和屈光手術。
背景技術：
角膜疾病是一種發病率高、治療困難的頑固性致盲眼病，各種原因所致的角 膜損傷、潰瘍、瘢痕及水腫混濁是當今世界致盲的主要原因之一。目前治療角膜 混濁的主要方法是板層或穿透性角膜移植，但受到了角膜供體來源缺乏、角膜供
體老齡化、術後併發症以及術後免疫排斥反應等現狀的限制。高分子PMMA等材 料的臨床應用推動了人工角膜的發展，使其成為繼供體來源角膜移植後另一種治 療途徑，但異質性材料與生物組織之間的相容性問題尚未完全解決，由此引起排 異、滲漏感染等嚴重的併發症，其設計和植入方式還不夠成熟。
利用新興的生物工程和組織工程技術為體外構建出全層生物角膜以替代供體 角膜移植提供了新的思路和和方法。然而生物角膜的構建由於缺乏合適的載體和 近似生理的培養條件，使其研究停留在初步階段，雖然體外構建人工角膜模型已 初具正常組織結構和功能，但還不能用於移植。最早20世紀90年代Minami等以 膠原混合角膜基質細胞構建出基質層後再種角膜上皮和內皮細胞，得到初具角膜 三層細胞結構的雛形，近年來Griffith等用戊二醛交聯的膠原作為人工角膜的支 架，角膜成纖維細胞混合在膠原中培養，將上皮細胞培養在支架表層，內皮細胞 培養在膠原支架的底層，從而構建出與人角膜形態、結構和組織特性功能相似的 角膜等效物。而中國專利CN 1579342A也公開了"一種無細胞異種角膜基質及制 備方法和用途"，其提供了一種可用於人工角膜構建的無細胞異種角膜基質。
已有研究用於生物角膜構建的載體材料包括天然的細胞外基質、天然和合成 高分子材料的複合物、有機材料同無機材料的複合物。常見的有膠原，聚乳酸、 甲殼素、殼聚糖、納米材料等，但尚未仿生製備出與角膜相近似的纖維板層結構。 角膜構建常用的這些載體也因透明性、機械強度、降解速度等參數並非最佳，構建出的角膜都不夠理想。
要構建出全層生物角膜，其核心是建立角膜細胞與生物材料的三維空間複合 體，載體支架是細胞附著的基本框架和代謝場所，其形態和功能直接影響構成的 組織形態與功能。角膜特有的結構是維持角膜透明、屈光、通透性等正常生理功 能的重要因素，通過生物化學方法將細胞成分去除而保留正常組織的細胞外基質 成份及結構的脫細胞組織基質作為支架，具有良好的生物學特性，而且來源廣泛。 脫細胞角膜基質可保留正常角膜板層排列結構，並具有良好的韌性和適合細胞生 長的生理微環境，同時豬的角膜基質雖為異種的天然同質材料，但具有良好的生 物相容性，尤其是脫細胞處理後抗原性極低，是構建生物角膜的良好載體。
傳統的角膜構建方法都是在培養皿中靜態培養，不利於組織和細胞進行營養 交換和新陳代謝，而近年來生物反應器在體外細胞培養和組織重建研究領域中發 揮越來越重要的作用，通過模擬體內動態環境，為細胞生長提供不斷新鮮的營養 物質並帶走代謝產物，從而改善離體細胞的培養條件；同時細胞及組織在動態中 更有利於細胞外基質的分泌和細胞間的信號轉導；細胞在生物反應器中有一定程 度的三維空間自由，有利於細胞-細胞、細胞-基質之間按組織學特性相互接觸，且 不易形成壞死中心。生物反應器的上述特點使之成為組織工程化器官和組織體外 重建的理想裝置。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的可用於移植的全層生物角膜，該全層生物角膜 以動物角膜脫細胞基質為載體，在所述脫細胞基質上還有體外培養和擴增的動物 角膜基質細胞、上皮細胞及內皮細胞。
本發明的另一個目的是提供這種全層生物角膜的構建方法，該方法通過以 下技術方案實現
(l)作為載體的脫細胞基質的製備取新鮮動物角膜，機械法去除上皮層、 撕除後彈力層後，浸於含l%TritonX-100， 4匸振蕩72小時脫細胞，再用PBS 緩衝液反覆振洗，組織採取切除前板層和後板層，保留中間三分之一厚基質層， 靜置-80'C凍存過夜後，轉入真空乾燥處理24小時，所述脫細胞基質應用前分別 在PBS緩衝液和無血清的DMEM培養基中復水，4。C保存備用；(2) 基質、上皮和內皮細胞的培養和擴增無菌取另一動物角膜，顯微鏡
下剝離所述角膜上皮層、基質層，沿Descemet膜撕下內皮層，取角膜緣上皮 lmmxlmm組織塊，貼壁法培養於含10%胎牛血清的DMEM: F12=l: 1的培養 基中；基質層用3%11型膠原酶，消化法製成細胞懸液種植於培養皿；胰酶消化 後彈力層上角膜內皮細胞，種植培養基中；各細胞靜置37i:， 5。/。C02飽和溼度 培養箱培養，隔日換液，細胞生長大於80%融合時，胰酶消化、離心，製成細 胞懸液，按1 : 2或1 :3分配接種於新的培養皿傳代培養，待細胞生長接近融 合後重複上述步驟依次傳代消化、傳代培養；
(3) 生物反應器內培養三維角膜基質層將角膜基質細胞轉染綠色螢光蛋 白基因，對細胞進行螢光標記，然後製成濃度為2xl(^個/ml的細胞懸液於離心 管中，將製備的脫細胞基質載體置入，抽真空使載體浸於細胞懸液中，2小時後 取出細胞載體複合物置於24孔板，再次制角膜基質細胞懸液，以lmlOT針筒 注入載體中央部位，為0.1ml/載體，靜置培養4小時後轉入生物反應器；
(4) 角膜內皮和上皮細胞種植於基質及生物反應器內培養首先將生物反 應器內培養一周的基質層取出置24孔板，內皮面向上，將角膜內皮細胞制細胞 懸液，滴加於內皮面上，靜置培養大於4小時後轉入反應器內旋轉，20轉/分， 再次培養一周時取出，上皮面向上於培養皿，將角膜上皮細胞懸液滴加表面， 同樣靜置培養4小時後轉入生物反應器培養，繼續培養一周後終止。
本發明的再一目的是全層生物角膜在角膜移植、角膜屈光手術中作為醫用 材料的應用。
本發明的主要特點在於通過生物化學方法製備的異種角膜脫細胞基質在形 態、結構以及生物相容性是作為體外構建生物角膜的良好載體，通過分別種植角 膜基質細胞、內皮細胞和上皮細胞，在生物反應器中模擬體內環境動態培養，可 在體外構建出近似正常組織結構和特性的全層生物角膜，這種生物角膜可用於模 擬生理性角膜進行生理、病理和藥理學的基礎研究，同時也可作為供體直接用於 治療性角膜移植。


圖1顯示了製備的豬角膜脫細胞基質載體支架結構；圖2顯示了異種脫細胞基質載體植入兔角膜基質板層後宿主角膜； 圖3顯示了脫細胞基質載體植片於宿主角膜基質層間融合良好；
圖4顯示了構建的三維基質層內GFP標記的角膜基質細胞鑲嵌於基質支架內
部；
圖5顯示了構建的全層生物角膜組織大體形態；
圖6顯示了全層角膜具復層扁平上皮層，基質板層和單層內皮細胞； 圖7顯示了掃描電鏡下生物角膜表面上皮細胞呈疊層生長，排列緊密； 圖8顯示了掃描電鏡下生物角膜內皮細胞呈單層的多角形細胞鑲嵌排列； 圖9顯示了透射電鏡下角膜基質細胞貼附於載體膠原纖維上，並分泌細胞外 基質；
圖10顯示了生物角膜上皮層細胞特異性角蛋白CK3表達陽性； 圖11顯示了生物角膜內角膜基質細胞波形蛋白vimentin表達陽性； 圖12顯示了生物角膜內皮細胞水通過道蛋白AQP1表達陽性。
具體實施例方式
下面將通過實施例對本發明作進一步說明。 實施例1豬角膜脫細胞基質的製備及其生物相容性
取新鮮豬角膜，機械法去除上皮層、撕除後彈力層後，浸於含l%TritonX-100， 4。C振蕩72小時脫細胞，再用PBS緩衝液反覆振洗，組織採取切除前板層和後板 層，保留中間三分之一厚基質層,靜置-80。C凍存過夜後，轉入真空乾燥處理24小 時。脫細胞基質在應用前分別在PBS緩衝液和無血清的DMEM培養基中復水，4'C 保存備用。製備的豬角膜脫細胞基質維持角膜原有的基本形態和韌性，呈水腫的 半透明狀，掃描電鏡下基質縱切面板層膠原纖維排列較整齊，波浪狀，較緻密， 纖維間可見大小不等的孔隙(見圖1)。
將製備的豬角膜脫細胞基質植片植入紐西蘭大白兔角膜基質囊袋中:將白兔 以速眠新2mg/kg肌注全身麻醉，配以2%利多卡因lml球後注射麻醉；以直徑為 7mm的環鑽在角膜表面作標記，於角膜上方11點到1點鐘位置標記處切開角膜 深度約達1/3 1/2角膜厚度，然後在此板層平面作層間分離，鈍性分離基質板層 間邊界達標記處，形成一囊袋狀，用生理鹽水衝洗植床；將脫細胞基質製成0.3mm厚、直徑為5mm的移植片，從切口處移入兔角膜囊袋中，虹膜恢復器將植片展平， 10-0尼龍線間斷縫合切口 。術後結膜下注射慶4萬單位大黴素和2.5mg地塞米松， 塗四環素可的松眼藥膏。
移植後一周內動物角膜移植區有水腫，4周後角膜透明度逐漸恢復，觀察到 術後6個月角膜保持透明，未發生明顯的排斥反應，亦無新生血管長入(見圖2)。 通過取材角膜組織學觀察，脫細胞基質植入受體後一直於基質板層間，與宿主角 膜基質融合較好，植入第8周時即可見宿主角膜基質細胞於植入物上下兩端長入 脫細胞基質纖維內(見圖3)，之後植入組織與宿主角膜板層逐漸融合難以觀察出 邊分界線。
實施例2兔角膜上皮、基質和內皮細胞的分離和培養
無菌取兔角膜，顯微鏡下剝離兔角膜上皮、基質層，沿Descemet膜撕下內皮 層。組織塊種植法培養原代角膜上皮細胞去除淺層上皮細胞後將角膜緣切成 lmmx2mm組織塊，上皮面朝下貼於培養皿底，孵箱中乾燥半小時後加少量含10% 胎牛血清的DMEM/F12 (1: 1)培養基剛剛浸沒組織塊為好，過夜後添加培養液。 原代基質細胞獲取採用聯合消化和組織塊法基質層組織塊剪碎，置離心管中， 加入3%11型膠原酶熱消化，於37。C振搖40min左右。當顯微鏡下觀察到組織塊松 散、形成網狀膠原絲，其間漂浮著圓圓透亮的細胞時即終止消化，加5倍體積的 無血清培養基稀釋，混勻振蕩器後於離心機中1500r/min離心5分鐘，棄上清液， 再加入PBS緩衝液洗滌，再次離心5分鐘，棄上清液，然後加入10%FBS的 DMEM/F12 (1:1)培養基，吹打混勻重懸，將細胞懸液和殘留未消化的組織塊 都接種於培養皿，先加少許培養基讓細胞和組織塊貼壁，次日添加培養基。通過 消化後彈力層上的內皮細胞獲取原代角膜內皮細胞的培養將撕下的後彈力層置 於無菌培養皿中，內皮面向上展平後加入含血清培養基，先置培養箱中孵育1天 後棄去培養液，加入PBS緩衝液洗滌一次，然後加入0.25W胰酶-0.02。/。EDTA混 合消化液，37'C消化15min左右。顯微鏡下觀察到透明的後彈力層上六邊形細胞 鑲嵌排列，邊界清晰，逐漸細胞皺縮，細胞間隙變大，當搖晃培養皿，大部分細 胞從後彈力層上脫落時，加含胎牛血清培養基終止消化，反覆吹打後於離心機 1500r/min離心5分鐘，棄上清液，再加入PBS緩衝液洗滌，再次離心5分鐘，棄上清液，加入含15%胎牛血清的培養基製成2><104個/1111細胞懸液種植 直徑為35mm培養皿中。各細胞靜置37'C, 5%<:02飽和溼度培養箱培養，隔日換 液。細胞生長大於80%融合時，胰酶消化、離心，製成細胞懸液，按l :2或1 : 3分配接種於新的培養皿傳代培養，待細胞生長接近融合後重複上述步驟依次傳 代。
培養的各角膜細胞體外生長增殖良好，上皮細胞呈多角形，細胞間相互銜接 鑲嵌，呈馬賽克狀；角膜基質細胞為梭形的細胞排列緊密，譜呈旋渦狀、放射編 織狀圖案；內皮細胞為六角形或多角形，細胞間鑲嵌緊密，呈鋪路石狀鋪於培養 皿底。各細胞傳代後生長增殖旺盛，可傳至10代以上，細胞形態和增殖率仍與原 代基本相似，足夠數量作為種子細胞種植載體，構建全層生物角膜。
實施例3生物反應器內培養三維角膜基質層
首先將角膜基質細胞轉染綠色螢光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)， 對細胞進行螢光標記。角膜基質細胞貼壁生長近70% 80%融合時，吸棄培養液， 將新鮮培養液和GFP重組腺病毒液以2: l的比例加入培養皿，置37"C， 5%C02 飽和溼度培養箱中過夜，次日棄去混合液，用PBS緩衝液洗滌兩次，去除殘留病 毒顆粒，然後再次加入新鮮含血清培養基，繼續培養24小時，螢光顯微鏡下觀察 細胞高表達綠色螢光後，可用於種植角膜脫細胞基質載體。
將GFP標記的角膜基質細胞消化、離心後製成濃度為2xl06/ml的細胞懸液， 以lmlOT針筒注入載體中央部位，約O.lml/載體，靜置培養4小時後轉入生物反 應器，生物反應器內角膜組織在旋轉輪帶動下，在培養液中輕微浮動。培養一周 後，取出細胞-支架複合組織，於雷射共集焦顯微鏡下觀察基質細胞與載體的三維 結構，通過GFP標記角膜基質細胞發出的綠色螢光，可見基質細胞鑲嵌在載體支 架內，較均勻的生長，分布於不同板層間，形成三維立體結構的基質層(見圖4)。
實施例4角膜內皮和上皮細胞種植於基質及生物反應器內培養
首先將生物反應器內培養一周的基質層取出置培養皿中，內皮面向上，然後 將培養的角膜內皮細胞制細胞懸液，滴加於內皮面上，靜置培養大於4小時後轉 入反應器內懸浮動態培養。再次培養一周時取出，此時將複合物上皮面朝上於培養皿中，將培養的角膜上皮細胞懸液滴加其表面，同樣靜置培養4小時後轉入生
物反應器懸浮動態培養，繼續培養一周後終止。
終止培養後，取出重建角膜組織，肉眼觀察其大體形態透明度和厚度情況。
部分組織用中性福馬林固定24小時，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片HE染色， 光學顯微鏡下觀察重建角膜組織結構。掃描電鏡觀察上皮和內皮面細胞在脫細胞 基質載體上生長形態結構，透射電鏡觀察基質細胞在載體板層間生長及活力情況。 對重建角膜組織各層細胞分泌蛋白進行免疫組化檢測，上皮層檢測角膜上皮特異 性角蛋白CK3;對基質層細胞進行波形蛋白vimentin檢測；對內皮層檢測與角膜 內皮細胞泵功能密切相關的水通道蛋白AQP1 。
生物反應器內構建的全層生物角膜薄而透明，為圓盤狀，有一定的曲率和彎 度，直徑8-10mm，厚度400-600pm，與正常哺乳動物角膜組織形態基本相同(見 圖5)。通過組織切片HE染色對其結構進行觀察，發現以角膜脫細胞基質載體構 建出的角膜組織初具角膜的全層結構，上皮層為復層扁平細胞層，基質層為膠原 纖維板層及其間鑲嵌生長的梭形基質細胞，內皮面為一單層連續的扁平細胞層， 組織學上更近似正常角膜組織結構(見圖6)。對生物反應器內培養的生物角膜各 層細胞進行超微結構的觀察可見，在脫細胞基質載體的上皮表面，細胞呈多層重 疊生長，排列整齊，細胞為扁平形，體態飽滿，相互緊密連接，並在形態上向梭 形變異，有的細胞表面有微絨毛(見圖7);在載體內皮面生長的細胞為單層的多 角形細胞鑲嵌排列，呈現典型的內皮細胞鑲嵌樣外觀，細胞形態較飽滿，細胞間 相互連接緊密(見圖8);角膜基質細胞貼附於載體膠原纖維上，細胞內多內質網 等細胞器，並可見吞噬顆粒，細胞旁有細胞分泌的細胞外基質成分(見圖9)。對 全層生物角膜各層細胞分泌蛋白進行檢測，角膜上皮層細胞表達角膜上皮特異性 角蛋白CK3 (見圖10);基質層細胞，胞漿中有棕色顆粒，即表達波形蛋白(見 圖11);對內皮層檢測與泵功能相關的水通道蛋白AQP1，免疫組化結果呈強陽性， 角膜內皮細胞高表達水通道蛋白(見圖12)。
無需進一步詳細闡述，相信閱讀了本發明上述公開的內容後，本領域技術人 員可最大限度地應用本發明，可作各種改動或修改，因此，前面的實施方案應理 解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
權利要求
1、一種全層生物角膜，以動物角膜脫細胞基質為載體，其特徵在於，在所述脫細胞基質上還有體外培養和擴增的動物角膜基質細胞、上皮細胞及內皮細胞。
2、 如權利要求1所述的全層生物角膜的製備方法，其特徵在於通過以下技術方案實現(1) 作為載體的脫細胞基質的製備:取新鮮動物角膜，機械法去除上皮層、撕除後彈力層後，浸於含l%TritonX-100， 4"C振蕩72小時脫細胞，再用PBS 緩衝液反覆振洗，組織採取切除前板層和後板層，保留中間三分之一厚基質層, 靜置-80'C凍存過夜後，轉入真空乾燥處理24小時，所述脫細胞基質應用前分別 在PBS緩衝液和無血清的DMEM培養基中復水，4t:保存備用；(2) 基質、上皮和內皮細胞的培養和擴增無菌取另一動物角膜，顯微鏡 下剝離所述角膜上皮層、基質層，沿Descemet膜撕下內皮層，取角膜緣上皮 lmmxlmm組織塊，貼壁法培養於含10%胎牛血清且DMEM: F12=l: 1的培養 基中；基質層用3%11型膠原酶，消化法製成細胞懸液種植於培養皿；胰酶消化 後彈力層上角膜內皮細胞，種植培養基中；各細胞靜置37"， 5。/。C02飽和溼度 培養箱培養，隔日換液，細胞生長大於80%融合時，胰酶消化、離心，製成細 胞懸液，按1 : 2或1 : 3分配接種於新的培養皿傳代培養，待細胞生長接近融 合後重複上述步驟依次傳代消化、傳代培養；(3) 生物反應器內培養三維角膜基質層將角膜基質細胞轉染綠色螢光蛋 白基因，對細胞進行螢光標記，然後製成濃度為2xlS個/ml的細胞懸液於離心 管中，將製備的脫細胞基質載體置入，抽真空使載體浸於細胞懸液中，2小時後 取出細胞載體複合物置於24孔板，再次制角膜基質細胞懸液，以lmlOT針筒 注入載體中央部位，為0.1ml/載體，靜置培養4小時後轉入生物反應器；(4) 角膜內皮和上皮細胞種植於基質及生物反應器內培養首先將生物反 應器內培養一周的基質層取出置24孔板，內皮面向上，將角膜內皮細胞制細胞 懸液，滴加於內皮面上，靜置培養大於4小時後轉入反應器內旋轉，20轉/分， 再次培養一周時取出，上皮面向上於培養皿，將角膜上皮細胞懸液滴加表面， 同樣靜置培養4小時後轉入生物反應器培養，繼續培養一周後終止。
3、 如權利要求l所述的全層生物角膜，其在角膜移植、角膜屈光手術中作為醫用材料的應用。
4、如權利要求2所述的全層生物角膜製備方法製備的全層生物角膜，其在 角膜移植、角膜屈光手術中作為醫用材料的應用。
全文摘要
本發明的目的是提供一種新的可用於移植的全層生物角膜，該全層生物角膜以動物角膜脫細胞基質為載體，在所述脫細胞基質上還有體外培養和擴增的動物角膜基質細胞、上皮細胞及內皮細胞。本發明的主要特點在於通過生物化學方法製備的異種角膜脫細胞基質在形態、結構以及生物相容性是作為體外構建生物角膜的良好載體，通過分別種植角膜基質細胞、內皮細胞和上皮細胞，在生物反應器中模擬體內環境動態培養，可在體外構建出近似正常組織結構和特性的全層生物角膜，這種生物角膜可用於模擬生理性角膜進行生理、病理和藥理學的基礎研究，同時也可作為供體直接用於治療性角膜移植。
文檔編號C12N5/071GK101433478SQ20071017040
公開日2009年5月20日 申請日期2007年11月14日 優先權日2007年11月14日
發明者瑤 傅, 範先群 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院