呋喃它酮殘留物無標記阻抗型免疫傳感器及製備方法和應用的製作方法

2023-06-22 00:06:26

專利名稱：呋喃它酮殘留物無標記阻抗型免疫傳感器及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物殘留檢測領域；具體涉及呋喃它酮殘留物無標記阻抗型免疫傳感 器及其製備方法和應用。
背景技術：
硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥理動力學 特性，除了作為一種抗生素被應用於獸醫醫療中外，它還曾作為豬、禽與水產品促生長的添 加劑被廣泛應用。但在長時間的實驗室研究過程中發現，硝基呋喃類藥物及其代謝產物 均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，鑑於此，歐盟分別於1993年(歐盟法令2901/93) 與1995年(歐盟法令1442/95)立法禁止在動物源性食品生產加工過程中使用呋喃它酮 (.Fural tadone )、呋喃西林 OVi trofurazone)、呋喃咀啶、Ni trofuran to in)與呋喃唑酮 (Furazolidone)等四種藥物。其後，美國、加拿大、澳新與日本等國均全面禁止使用硝基呋 喃類藥物。2002年3月我國也將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥。研究證明，硝基呋喃類藥物 在動物體內若干小時就會迅速分解成硝基呋喃與各種代謝產物，這些代謝產物與組織內蛋 白質形成較為穩定的化合物，該化合物可以在組織中存留較長時間，所以分析此類藥物殘 留時應該對其代謝產物進行檢測分析，歐盟等國就是以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基 呋喃殘留的目的。四種硝基呋喃類藥物的代謝產物分別對應為呋喃它酮一3-氨基-5-嗎 啉基-2-氧唑酮(AMm ；呋喃西林一氨基脲iSEM、；呋喃咀啶一 1-氨基咀啶(AHD)；呋喃唑 酮一 3-氨基-2-氧唑酮(Jfl )。隨著我國加入世貿組織以來，歐美日等發達國家利用自身技術優勢對我國出口食 品及農副產品不斷設置新的技術壁壘措施，以達到限制我國食品與農副產品的出口，有關 這方面的貿易糾紛接踵而來，歐盟早在2000年初就開始了一項長達42個月的FoodBRAND 計劃(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求歐盟各認可實驗室對食品中硝基呋喃類殘留 檢測方法(包括ELISA與LC-MS-MS方法)進行攻關研究，以為其設置技術壁壘提供技術支 持。目前，歐盟規定不得在食品中檢測出硝基呋喃類藥物四種代謝產物殘留，鑑於此，歐盟 等國家已研製出液質聯用色譜儀檢測分析方法，同時也有酶聯免疫檢測試劑盒的製備和使 用，我國相關科研人員也研製成功上述檢測方法。但目前已有的針對上述殘留物的快速檢 測方法(ELISA與LC-MS-MS方法)由於均需對殘留物進行衍生化處理，檢測工作量大，需耗 費至少24小時，所需時間較長，達不到快速檢測的要求。本發明旨在通過免疫傳感器的製備，建立一種呋喃它酮殘留快速檢測方法。

發明內容
本發明的目的是為人們提供一種呋喃它酮殘留物無標記阻抗型免疫傳感器及其 製備方法和應用。本發明所說的呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器，是將納米金通過自組
4裝方法固定於金電極表面，用來固定呋喃它酮殘留物的單克隆抗體而構建得到。上述呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器具體是通過以下步驟製得
(1)金膠的製備製備金納米粒子溶液；
(2)金電極的預處理金電極先用0.3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然 後依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置於0. 5M H2S04溶液中， 在-0. 5到+1. 4V範圍內進行循環伏安掃描25圈，掃速為0. IV s-Ι ；然後將電極在氮氛下 乾燥；
(3)1，4_苯二硫醇修飾金電極將預處理好的金電極浸入含15mM的1，4_苯二硫醇的 無水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然後用無水乙醇衝洗表面，再在氮氛下乾燥；
(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4_苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放 在暗處置於室溫下5h後，取出後用二次水衝洗表面；
(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩衝溶液 (PH7.0)中，於4° C下放置12 h;然後將其取出後再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液 中，置於37. 5oC水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最後將取出後的電極用二次水衝洗以 除去表面多餘的牛血清蛋白；即製得呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器。本發明還公開了使用上述呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器檢測呋喃 它酮殘留物的方法，具體是
(1)建立阻抗的相對變化率％ Δ Rct與AMOZ濃度的關係測定阻 抗型免疫傳感器的起始阻抗值R。t(BSA)，以及阻抗型免疫傳感器分別與 不同濃度的AMOZ標準溶液進行免疫反應後阻抗值R。t(AM.Ab)，按公式
= 腿;計算出阻抗的相對變化率％ Δ Rct ;阻抗的相對變化 jtSs(皿}
率％厶1^與41 )2濃度對數在1.0到1.0 ？ 106rig/mL範圍內呈線性關係，檢測限為1. 0 ng/mL ；其中所說的免疫反應條件是在pH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液中進行，37. 5° C溫育3h ； (2 )按照步驟(1)的方法和條件將阻抗型免疫傳感器與待測物溶液進行免疫反應，測定 阻抗值，計算得到抗體與AMOZ反應後引起阻抗的相對變化率％ Δ Rct ；
(3)根據步驟(1)確定的阻抗的相對變化率％ Δ R。t與AMOZ濃度的關係，確定出待測物 溶液中AMIOZ殘留物含量。本發明利用電化學阻抗技術，通過直接測定抗原-抗體發生免疫反應前後對阻抗 測試溶液鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀在傳感器表面發生氧化還原時電子傳遞阻抗的改變，製備 針對呋喃它酮代謝產物呋喃它酮-3-氨基-5-嗎啉基-2-氧唑酮(AMOZ)特異的快速檢測無 標記型免疫傳感器，尋求AMOZ濃度與免疫反應前後阻抗變化率之間的關係，實現對AMOZ的 快速檢測。與液質聯用色譜分析法相比，該方法對樣品的前處理要求較低，分析過程簡單， 檢測時間由原來的24小時縮短到3小時，而且檢測靈敏度也較高，為我國畜禽產品進出口 貿易中呋喃它酮殘留檢測提供一種高效、簡便的途徑。


圖1是抗體濃度對抗體固定後電極阻抗的影響。圖2是配製抗體溶液的磷酸鹽緩衝溶液pH對抗體固定後電極阻抗的影響。
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圖3是免疫反應時間對阻抗相對變化率的影響。圖4是免疫反應溶液的pH對阻抗相對變化率的影響。圖5是免疫反應溫度對阻抗相對變化率的影響。
具體實施例方式實施例一傳感器的製備 (1)金膠的製備
金膠的製備可按現有技術進行。所有製備納米金膠的玻璃器皿都需用1:3 (ν/ν) HNO3-HCl溶液浸泡一段時間，使用前用二次蒸餾水衝洗乾淨。本實施例中金納米粒子的制 備方法如下將100 mL 0. 01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，在劇烈攪拌的條件下加入2. 50 mL 1. 0%的檸檬酸鈉溶液，溶液顏色先由無色變成墨色再變成墨綠色，最後為酒紅色並呈透 明狀即可。經透射電子顯微鏡觀察，製備的金納米粒子粒徑約為25 nm。另外，根據納米金 膠溶液的紫外一可見吸收光譜曲線，在520 nm左右出現了納米金膠的吸收峰，這與文獻報 道結果相一致。所得金納米粒子溶液置於棕色瓶中在4° C下保存備用。(2)金電極的預處理
金電極首先分別用0. 3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然後依次用二 次水和無水乙醇超聲清洗。然再將拋光處理好的金電極置於0. 5MH2S04溶液中，在-0. 5到 +1.4V範圍內進行循環伏安掃描25圈，掃速為0. IV s—1。然後將電極在氮氛下乾燥。(3) 1,4-苯二硫醇修飾金電極
將預處理好的金電極浸入15 mM的1，4_苯二硫醇的無水乙醇溶液中，4oC下放置 10 min，然後用無水乙醇衝洗表面，然後在氮氛下乾燥。(4)單層納米金膠的自組裝
將自組裝了 1，4-苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放在暗處置於室溫下5h後，取出 後用二次水衝洗表面。(5)抗體的固定
將納米金修飾電極浸入含0.2 mL 0.030 mg/mL抗AMOZ單克隆抗體的磷酸鹽緩衝溶 液(PH7.0)中，於4° C下放置12 h。電極取出後再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置 於37. 5°C水浴中1小時，以封閉非特異性位點。最後將取出的電極用二次水衝洗以除去表 面多餘的牛血清蛋白。將製備好的修飾有抗體的電極浸入磷酸緩衝溶液(PH=7. 0)中，置於 4°C保存備用。本實施例中使用的抗AMOZ單克隆抗體，是由雜交瘤細胞株AM0Z-D4E10分泌的，該 細胞株公開於中國專利申請第20061012 7111. 4號，揚州大學獸醫學院動物預防醫學重點 實驗室製備和保存，自申請日起向公眾提供20年；公眾也可從中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心獲得，該細胞株保藏號為CGMCC No: 1792。但本領域的技術人員可發 理解，本發明中不限於使用該細胞株分泌的單克隆抗體，其他抗AMOZ抗體也同樣能用來制 作本發明的傳感器。實施例二檢測方法的建立 (1)抗體固定條件的優化 ①抗體濃度的影響傳感器對AMOZ抗原的響應與AMOZ抗體的在電極表面的固定量有關，電極表面單 位面積固定的抗體量越多，則可結合抗原的位點就越多，越有利於與抗原分子的結合。在傳 感器的製備中，當改變AMOZ抗體用量時，所得傳感器的性能呈現明顯差異。由圖1可見， 當抗體濃度小於0. 025 mg/mL時，阻抗隨著抗體濃度的增加而增大；當抗體濃度大於0. 025 mg/mL，阻抗的響應基本不變。所以實驗過程中選擇將抗體濃度為0.030 mg/mL。②pH對抗體固定的影響
研究了配製抗體用的磷酸鹽溶液在pH在6. 0到8. 5範圍內對抗體固定的影響(圖2)。 結果表明當溶液PH為7. 0時阻抗達到最大，說明在此條件下抗體在納米金表面的固定量達 到最大。故固定用抗體溶液的PH選用7. 0的磷酸鹽緩衝液來控制。(2)抗體-抗原免疫反應條件優化 ①溫育時間的影響
在免疫反應中，溫育時間是衡量免疫反應檢測的一個重要因素。本實驗中，為了選擇 免疫反應最佳反應時間，將固定了抗體的電極在濃度為1. OX IO3ngAiL磷酸鹽緩衝溶液 (PH7.4)中溫育，檢測阻抗相對變化值。從圖3可以看出，溫育時間小於3小時，阻抗的相對 變化隨著溫育時間的延長而增加。當溫育時間達到3小時後，阻抗的相對變化基本不變，表 明抗原的吸附量達到最大。因此，選取3小時作為免疫反應的溫育時間。②抗體-抗原反應的pH值的影響
將固定了抗體的電極分別浸入到PH為6. 0，6. 5，7. 0，7. 4，8. 0和8. 5的濃度同為 1.0X103 ng/mLAMOZ的磷酸鹽緩衝溶液中溫育3h，測量其阻抗的相對變化。結果表明，pH 值從6. 0到7. 4，阻抗的相對變化值逐漸增大，pH值從7. 4到8. 5，阻抗的相對變化值逐漸 減小(圖4)。因此，選取pH7. 4的磷酸鹽緩衝液作為抗體-抗原反應的最佳緩衝液。③抗體-抗原反應的溫育溫度的影響
溫育溫度對電極表面發生的免疫反應有一定的影響。將修飾了抗體的電極浸入濃度為 1.0X IO3 ng/mL AMOZ的磷酸鹽緩衝溶液(pH7. 4)中溫育3h，當溫育溫度從20增加到50° C 時，阻抗的相對變化值在37. 5° C時達到最大值(圖5)。因此選取37. 5° C作為免疫反應 最佳溫育溫度。(3)幹擾試驗
為了探討該免疫傳感器的特異性，使用硝基呋喃類代謝的其他三種產物作為幹擾物 測定對象。在濃度為1.0 ng/mLAMOZ溶液中分別加入不同濃度的幹擾物質，將固定了抗體 的電極浸入其中進行反應，測定其阻抗值(結果見表1)。從表1可以看出，加入幹擾物質 後，阻抗只有輕微的變化，其RSD小於3%。由此可見，該免疫傳感器具有良好的的特異性。
實施例三AMOZ檢測
配製不同濃度的3-氨基-5-嗎啉基-2-氧唑酮(AMOZ)標準溶液，將含固定好抗體的 修飾電極在上述優化得到的最佳條件下與不同濃度的AMOZ標準溶液進行免疫反應。然後 將修飾電極、飽和甘汞電極和鉬電極三電極體系浸入含1.0 mM Fe(CN)63_M_&0. IM KNO3的 磷酸鹽緩衝溶液(PH7. 4)的阻抗測試溶液中，利用Autolab電化學工作站在開路電位和正 弦波電位振幅為10 mV的條件下，於10—1 Hz到IO6Hz頻率範圍測定其交流阻抗圖譜，再通 過等效電路擬合求得Fe (CN) 63-7 4在修飾電極表面發生氧化還原反應時電子傳遞的阻抗值， 並按公式(1)進行數據處理
權利要求
一種呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器，其特徵在於是通過以下方法製備得到(1)金膠的製備製備金納米粒子溶液；(2)金電極的預處理金電極先分別用0.3，0.05μm的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然後依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置於0.5M H2SO4溶液中，在 0.5到+1.4V範圍內進行循環伏安掃描25圈，掃速為0.1V s 1；然後將電極在氮氛下乾燥；(3)1，4 苯二硫醇修飾金電極將預處理好的金電極浸入15 mM的1，4 苯二硫醇的無水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然後用無水乙醇衝洗表面，然後在氮氛下乾燥；(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4 苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放在暗處置於室溫下5h後，取出後用二次水衝洗表面；(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩衝溶液(pH7.0)中，於4°C下放置12 h；電極取出後再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置於37.5oC水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最後再將電極取出後用二次水衝洗以除去表面多餘的牛血清蛋白；即製得呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器。
2.一種製備呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器的方法，其特徵在於，包括以 下步驟(1)金膠的製備製備金納米粒子溶液；(2)金電極的預處理金電極先分別用0.3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光， 然後依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置於0. 5M H2S04溶液 中，在-0. 5到+1. 4V範圍內進行循環伏安掃描25圈，掃速為0. IV s-Ι ；然後將電極在氮氛 下乾燥；(3)1，4-苯二硫醇修飾金電極將預處理好的金電極浸入15mM的1，4_苯二硫醇的無 水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然後用無水乙醇衝洗表面，然後在氮氛下乾燥；(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4_苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放 在暗處置於室溫下5h後，取出後用二次水衝洗表面；(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩衝溶液 (PH7.0)中，於4° C下放置12 h;電極取出後再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置於 37. 5°C水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最後再將電極取出後用二次水衝洗以除去表 面多餘的牛血清蛋白；即製得呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器。
3.用權利要求1所述阻抗型免疫傳感器檢測呋喃它酮殘留物的方法，包括以下步驟(1)建立阻抗的相對變化率％ Δ Rct與AMOZ濃度的關係測定阻抗型免疫傳感器的起始阻抗值R。t(BSA)，以及阻抗型免疫傳感器分別與 不同濃度的AMOZ標準溶液進行免疫反應後阻抗值R。t(AM.Ab)，按公式
全文摘要
本發明涉及呋喃它酮殘留物無標記的阻抗型免疫傳感器，及其製備方法和應用，所說的該傳感器通過金膠製備、金電極的預處理、1，4-苯二硫醇修飾金電極、單層納米金膠的自組裝和抗體的固定5個步驟而製得。其特徵在於是將納米金通過自組裝方法固定於金電極表面，用來固定呋喃它酮殘留物的單克隆抗體而構建得到。使用時，先建立阻抗的相對變化率%△Rct與AMOZ濃度的關係，再根據待測樣品的阻抗相對變化率%△Rct就可確定其AMOZ濃度。採用本發明的傳感器和檢測方法具有快速簡便的特點，解決當前呋喃它酮殘留檢測操作費時的缺陷。
文檔編號G01N27/30GK101957375SQ201010295008
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者餘兵, 吳麗萍, 李東明, 楊功俊, 王倩倩, 秦愛建, 蔡寶亮, 邵紅霞, 金文杰, 錢琨 申請人:揚州大學