魚鰓組織石蠟切片的製備方法
2023-05-18 09:12:21 1
魚鰓組織石蠟切片的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種魚鰓組織石蠟切片的製作方法，包括固定、脫鈣、脫水、透明、石蠟滲透、包埋、切片、黏片和展片、脫蠟復水、染色、復染和封固等步驟。本發明較現有石蠟切片製作方法改進了脫水、透明、浸蠟的操作過程，提高了魚鰓組織石蠟製備固定和組織浸蠟的效果，提高了魚鰓組織石蠟切片製備時的切片問題，極大地提高了魚鰓組織切片的結構清晰度，解決了現有技術在魚鰓組織製作過程中存在的若干問題。利於免疫細胞化學染色的抗原定位，因而在魚鰓組織切片上進行原位雜交、免疫組織化學及免疫螢光等實驗可以顯示某些基因和蛋白的組織分布和細胞定位，為進一步從細胞、基因和蛋白水平上進行魚鰓研究提供了切實可行的條件。
【專利說明】魚鰓組織石蠟切片的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於顯微組織切片領域，具體涉及一種魚鰓組織石蠟切片的製備方法。
【背景技術】
[0002]石臘切片(paraffin section)是組織學常規製片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用於觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用於其他許多學科領域的研究中。教學中，光鏡下觀察切片標本多數是石蠟切片法製備的。活的細胞或組織多為無色透明，各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區別出；組織離開機體後很快就會死亡和產生組織腐敗，失去原有正常結構，因此，組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡，而能清晰辨認其形態結構。其基本過程包括:固定、脫水、透明、滲蠟、包埋、切片、展片、黏片、烤片、脫蠟復水、染色和封固等多個步驟。
[0003]硬骨魚類的魚觸具有五對觸弓，前四對具有2列細長的觸瓣,其基本通過觸間膜聯結，許多魚種的鰓弓前側列生著鰓耙。鰓瓣的兩側有許多半圓形的二級鰓瓣，其上面由上皮細胞構成單層的扁平上皮，並由柱狀細胞間隔著，平行分布許多毛細血管。由於魚鰓組織結構的特殊性，採用傳統的石蠟切片製作方法，很難得到理想的效果，不僅結構模糊，而且細胞核與細胞漿染色對比不明顯，層次不清，著色不良，導致組織標本的製作失敗。因此，如何對現有石蠟切片製備方法進行改進，解決魚鰓組織切片製備過程中存在的問題，是本領域亟待解決的問題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供了一種魚鰓組織切片的製備方法，該製備方法可以保證魚鰓組織和細胞結構完整，位置相對固定，並且簡單、高效，適用於魚鰓組織切片的快速大規模製備。
[0005]為實現上述目的，本項發明採用了如下技術方案。
[0006]本發明的魚鰓組織石蠟切片的製作方法，包括步驟如下:
(1)固定將魚觸組織剪成3mmX 3 mmX2 mm的小塊浸泡於Bouin’s溶液中進行固定，室溫條件下固定24 h，期間換Bouin』 s溶液2?3次；
(2)脫鈣將(I)處理的材料流水衝洗24h，然後浸入Perenyi 』 s脫鈣液中，室溫條件下保持5 d ；
(3)脫水將(2)處理後的材料依次浸入上行梯度乙醇脫水，步驟依次是:60%乙醇浸泡0.5 h，70%乙醇浸泡0.5 h，80%乙醇浸泡0.5 h,90%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡2 h,無水乙醇浸泡40 min,無水乙醇浸泡40 min ；
(4)透明將(3)處理好材料依次浸入二甲苯浸泡15min、二甲苯浸泡15 min ；
(5)石蠟滲透將經(4)處理好材料浸入二甲苯與石蠟按體積比1:1的溶液中浸泡30min,然後轉移到56°C的石臘中滲透4 h ； (6)包埋將牛皮紙折成小紙盒，先將加溫溶解的石蠟倒入紙盒中，然後迅速將經(5)處理好材料切面朝下、鰓瓣與切面平行擺放在紙盒中，冷卻成型；
(7)切片將(6)包埋好的石蠟塊經過分割、修整與固著，然後經切片機將石蠟塊切成連續的蠟帶，蠟帶形狀為長方形，上下兩個長邊平行，切片厚度為5飛μ m ;
(8)展片和黏片將(7)切好的蠟帶分割呈適宜的片段，放在5(T55°C的蒸餾水面，觀察到切片充分擴展時，迅速用塗有黏片液的載玻片將切片撈取，將切片控制在載玻片的最佳觀察位置，將玻片放在40°C的恆溫箱烤片12 h，烤乾後的切片貼上標籤或記號，放到玻片收藏盒內；
(9)脫蠟復水將(8)處理後切片脫蠟，依次浸泡在二甲苯兩次，每次均為5min，然後進行下行梯度乙醇復水，依次浸泡在無水乙醇5 min、無水乙醇5 min、95%乙醇3 min>70%乙醇5 min,然後用清水衝洗5 min、蒸懼水衝洗I min ；
(10)染色將經過(8)處理的切片放入蘇木精中染色15min，用自來水衝洗Is後，放入體積百分比為1%的鹽酸乙醇溶液中分化退色Is ；
(11)復染將(9)處理的切片放入自來水流水中漂洗10min、蒸餾水衝洗Is後，經過伊紅乙醇溶液復染I min，然後蒸餾水漂洗1-5 s ;最後經過75%乙醇蕩洗1_5 s、95%乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、二甲苯衝洗3 min、二甲苯衝洗3 min ；
(12)封固在經(10)處理的切片上滴2-3滴的加拿大樹脂後，迅速將蓋玻片小心蓋上，不能產生氣泡，若有氣泡要擠壓出來，然後將封片在室溫下自然乾燥即可。
[0007]所述的Bouin’s固定液是由下列試劑按體積比配製而成:飽和苦味酸15份，福馬林5份，冰醋酸I份。
[0008]所述的Perenyi 』 s脫鈣液是由下列試劑按體積份配製而成:10%硝酸4份，0.5%鉻酸3份，無水乙醇3份。
[0009]所述的石蠟是指熔點為56?58°C的鱗片狀切片石蠟。
[0010]本發明方法中，魚鰓組織經過蘇木精-伊紅染色，最後用加拿大樹膠封片，所製備的組織切片在顯微鏡下觀察，然後記錄、拍照。對魚鰓組織和細胞的形態結構進行觀察，以形成清晰、明了的魚鰓組織切片圖。
[0011]與現有技術相比，本發明的優點在於:
(I)極大地提高了魚鰓組織石蠟製備固定的效果本發明採用Bouin』 s固定液室溫固定，增強了對組織的滲透能力，使細胞各個組分得到充分的沉澱和凝固，避免由於材料長時間浸泡而發生的腫脹、變硬等破壞，從而能完整地保存細胞生存時的形態結構，獲得較好的染色和觀察效果。
[0012](2)極大地提高了魚鰓組織石蠟切片製備時的切片問題本發明採用Perenyi』 s液作為脫鈣液，魚鰓由於含有骨質結構，如果不進行脫鈣處理，切片時會比較硬，不好切片，用本發明製備的切片，不僅切片效果良好，而且細胞核和細胞漿細微結構著色均好。
[0013](3)極大地提高了組織浸蠟的效果本發明在浸透過程中加入了二甲苯與石蠟混合劑的過程，加速了石蠟滲透進入組織的時間，可以使石蠟充分滲透組織，包埋效果良好。
[0014]本發明較傳統石蠟切片製作方法，改進了常規的脫水、透明、浸蠟的操作過程，極大地提高了魚鰓組織切片的結構清晰度，解決了魚鰓組織在製作過程中存在的問題，利於免疫細胞化學染色的抗原定位，因而在魚觸組織切片上進行原位雜交、免疫組織化學及免疫螢光等實驗可以顯示某些基因和蛋白的組織分布和細胞定位，為進一步從細胞、基因和蛋白水平上進行魚鰓相關研究提供了切實可行的條件。
[0015]下面結合實施例對本發明魚鰓組織石蠟切片的製備方法做進一步的說明。
[0016]實施例1
實驗目的:通過製備魚鰓組織石蠟切片，觀察不同濃度氟化物暴露90 d後鯉魚鰓組織的病理學變化。具體步驟如下:
(I)製備或選購使用試劑
A製備Bouin’s固定液由下列試劑按體積比配製而成:飽和苦味酸15份、福馬林5份、冰醋酸I份。
[0017]B製備Perenyi 』 s脫I丐液由下列試劑按體積份配製而成:10%硝酸4份、0.5%鉻酸3份、無水乙醇3份。
[0018]C選購熔點為56?58°C的鱗片狀切片石蠟。
[0019](2)取樣將不同濃度氟化物暴露90 d後的鯉魚冰浴麻醉，然後剪取左側第二片觸，體積為3 mmX3mmX2mm,每個組取2個樣品，然後放入裝有Bouin』 s固定液的2ml EP管中。
[0020](3)固定確保趣魚觸組織材料完全浸沒在Bouin’s固定液後，將其在室溫下固定24 h，期間換液2?3次。
[0021](4)脫鈣組織材料固定後，將固定好的材料流水衝洗24 h後，放入Perenyi’s脫鈣液中，室溫條件下脫鈣處理5 d。
[0022](5)脫水脫鈣結束後，將材料放入上行梯度乙醇脫水，依次分別是:60%乙醇浸泡
0.5 h、70%乙醇浸泡0.5 h、80%乙醇浸泡0.5 h、90%乙醇浸泡I h、95%乙醇浸泡I h、95%乙醇浸泡2 h、無水乙醇浸泡40 min、無水乙醇浸泡40 min。
[0023](6)透明將脫水結束的材料通過兩次分別為15 min的二甲苯浸泡進行透明。
[0024](7)石蠟滲透首先把透明後的材料浸入二甲苯與石蠟按體積比為1:1的溶液中浸泡30 min,然後轉移到56°C的石臘中滲透4 h。
[0025](8)包埋用牛皮紙折成小紙盒，先將加溫溶解的石蠟倒入紙盒中，然後迅速將石蠟滲透好材料切面朝下、鰓瓣與切面平行擺放在紙盒中，冷卻成型。
[0026](9)切片將包埋好、冷卻後的石蠟塊經過分割、修整與固著，用切片機將石蠟塊切成連續的蠟帶，蠟帶形狀為長方形，上下兩個長邊平行，切片厚度為5飛μ m。
[0027](10)展片和黏片將切好的蠟帶分割呈適宜的片段，放在5(T55°C的蒸餾水面上，當切片充分擴展時，迅速用塗有黏片液的載玻片將切片撈取，將切片安放在載玻片的最佳觀察位置，然後將載玻片放在40°C的恆溫箱烤片12 h，烤乾後的切片貼上標籤或記號，放到玻片收藏盒內。
[0028](11)脫蠟將烤乾的切片依次浸泡在二甲苯兩次，每次均為5 min進行脫蠟處理。
[0029](12)復水將脫蠟後的切片採用下行梯度乙醇進行復水，依次浸泡在無水乙醇5min、無水乙醇5 min、95%乙醇3 min、70%乙醇5 min,然後用清水衝洗5 min、蒸懼水衝洗I min。
[0030](13)染色將復水後的切片放入蘇木精中染色15 min，再用自來水衝洗Is後，放入體積百分比為1%的鹽酸乙醇溶液中分化退色Is。[0031](14)復染將經初步染色的切片放入自來水流水中漂洗10 min、蒸餾水衝洗Is後，再用伊紅乙醇溶液復染I min，然後用蒸餾水漂洗1-5 s ;最後經過75%乙醇蕩洗1_5 S、95%乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、二甲苯衝洗3 min、二甲苯衝洗3 min，完成復染。
[0032](15)封固將復染好的切片上滴2-3滴的加拿大樹脂，迅速將蓋玻片小心蓋上，不能產生氣泡，若有氣泡要擠壓出來，然後將封片在室溫下自然乾燥即為鯉魚鰓組織石蠟製備玻片。
[0033]用該鯉魚鰓組織玻片即可在顯微鏡下觀察及顯微攝影鯉魚鰓組織的病理學變化。
【權利要求】
1.魚鰓組織石蠟切片的製作方法，包括步驟如下: (1)固定將魚觸組織剪成3mmX3 mmX2 mm的小塊浸泡於Bouin』 s溶液中進行固定，室溫條件下固定24 h，期間換Bouin』 s溶液2~3次； (2)脫鈣將(I)處理的材料流水衝洗24h，然後浸入Perenyi 』 s脫鈣液中，室溫條件下保持5 d ； (3)脫水將(2)處理後的材料依次浸入上行梯度乙醇脫水，步驟依次是:60%乙醇浸泡0.5 h，70%乙醇浸泡0.5 h，80%乙醇浸泡0.5 h,90%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡2 h,無水乙醇浸泡40 min,無水乙醇浸泡40 min ； (4)透明將(3)處理好材料依次浸入二甲苯浸泡15min、二甲苯浸泡15 min ; (5)石蠟滲透將經(4)處理好材料浸入二甲苯與石蠟按體積比1:1的溶液中浸泡30min,然後轉移到56°C的石臘中滲透4 h ； (6)包埋將牛皮紙折成小紙盒，先將加溫溶解的石蠟倒入紙盒中，然後迅速將經(5)處理好材料切面朝下、鰓瓣與切面平行擺放在紙盒中，冷卻成型； (7)切片將(6)包埋好的石蠟塊經過分割、修整與固著，然後經切片機將石蠟塊切成連續的蠟帶，蠟帶形狀為長方形，上下兩個長邊平行，切片厚度為5飛μ m ; (8)展片和黏片將(7)切好的蠟帶分割呈適宜的片段，放在5(T55°C的蒸餾水面，觀察到切片充分擴展時，迅速用塗有黏片液的載玻片將切片撈取，將切片控制在載玻片的最佳觀察位置，將玻片放在40°C的恆溫箱烤片12 h，烤乾後的切片貼上標籤或記號，放到玻片收藏盒內； (9)脫蠟復水將(8)處理後切片脫蠟，依次浸泡在二甲苯兩次，每次均為5min，然後進行下行梯度乙醇復水，依次浸泡在無水乙醇5 min、無水乙醇5 min、95%乙醇3 min>70%乙醇5 min,然後用清水衝洗5 min、蒸懼水衝洗I min ； (10)染色將經過(8)處理的切片放入蘇木精中染色15min，用自來水衝洗Is後，放入體積百分比為1%的鹽酸乙醇溶液中分化退色Is ； (11)復染將(9)處理的切片放入自來水流水中漂洗10min、蒸餾水衝洗Is後，經過伊紅乙醇溶液復染I min，然後蒸餾水漂洗1-5 s ;最後經過75%乙醇蕩洗1_5 s、95%乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、無水乙醇衝洗I min、二甲苯衝洗3 min、二甲苯衝洗3 min ； (12)封固在經(10)處理的切片上滴2-3滴的加拿大樹脂後，迅速將蓋玻片小心蓋上，不能產生氣泡，若有氣泡要擠壓出來，然後將封片在室溫下自然乾燥即可。
2.根據權利要求1所述的魚鰓組織石蠟切片的製作方法，其特徵在於，所述的Bouin’s固定液是由下列試劑按體積比配製而成:飽和苦味酸15份，福馬林5份，冰醋酸1份。
3.根據權利要求1所述的魚鰓組織石蠟切片的製作方法，其特徵在於，所述的Perenyi^ s脫鈣液是由下列試劑按體積份配製而成:10%硝酸4份，0.5%鉻酸3份，無水乙醇3份。
4.根據權利要求1所述的魚鰓組織石蠟切片的製作方法，其特徵在於，所述的石蠟是指熔點為56~58°C的鱗片狀切片石蠟。
【文檔編號】G01N1/28GK103940648SQ201410133076
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】曹謹玲, 陳劍傑, 羅永巨, 王俊東, 李宏全, 宋晶 申請人:山西農業大學