利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法與流程

2023-05-18 00:23:21 3

本發明涉及利用生物敏感標誌物檢測水體汙染，更具體地說，本發明涉及一種利用魚的過氧化氫酶(CAT)活性檢測水體汙染程度的方法。

背景技術：

隨著城鎮化和工農業的迅猛發展，水體汙染日益加劇。水域中的水體汙染物也各有不同，有的為單一汙染物，也有多種汙染物混合汙染。對於未知水域中，不管是單一汙染物的汙染，還是多種汙染物的汙染，怎樣獲悉水體是否被汙染，甚至知道其汙染程度，並能直觀判斷該水域的汙染對生物的危害已達到何種程度。對於水體中受到重金屬或菲一種或兩種汙染時，用化學方法可以定性、定量檢測到汙染，但是無法檢測其危害性和危害程度以及汙染程度的準確性。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，並提供至少後面將說明的優點。

本發明還有一個目的就是提供一種利用魚的過氧化氫酶活性檢測水體汙染程度的方法，本方法利用魚的CAT作為敏感生物標記物，可敏感地監測鎘等重金屬汙染的汙染程度和危害程度，還可以敏感檢測菲(Phe)等多環芳烴汙染的汙染程度和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。

為了實現根據本發明的這些目的和其他優點，提供了一種利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法。本檢測方法為獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物。其中，CAT是過氧化氫酶的簡寫。

優選的是，所述魚的CAT活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關。

優選的是，所述魚的CAT活性與水體中菲的濃度呈負相關。

優選的是，所述魚的CAT活性與水體中多氯聯苯的濃度呈負相關。

優選的是，建立魚的CAT活性與汙染物濃度關係的標準曲線，然後將待檢測水域中的同種同大小的魚的CAT活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中水體汙染物濃度。

優選的是，所述標準曲線為魚的CAT活性與重金屬鎘濃度關係的曲線，或者魚的CAT活性與菲濃度關係的曲線，或者魚的CAT活性與多氯聯苯濃度關係的曲線。

優選的是，所述魚的CAT活性測定包括如下步驟：

步驟一、待測樣本處理：製備全魚勻漿，然後離心分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，並分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然後代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一和試劑二，然後在所述測定管中加入待測樣本，混勻反應50-70秒；

步驟四、在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑三和試劑四，然後在所述對照管中加入待測樣本，混勻，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於0.5cm光徑，405nm波長處分別測所述對照管和測定管的OD，分別記為對照OD值，測定OD值，其中取樣量為加入對照管或測定管的待測樣本的量，然後代入如下公式計算得魚的過氧化氫酶活性：

優選的是，所述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65％的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，且所述離心分層用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min。

優選的是，所述步驟二中等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本均為0.05ml，蛋白標準品的濃度為0.563g/L，分別加入考馬斯亮藍顯色劑的量均為3ml，靜置10min；所述步驟三中在對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑一1ml和試劑二0.1ml，然後在所述測定管中加入濃度為1％的待測樣本0.05ml，反應溫度為37℃；所述步驟四中在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑三1ml和試劑四0.1ml，然後在所述對照管中加入濃度為1％的待測樣本0.05ml。

優選的是，所述魚為海水青鱂或淡水青鱂。

本發明至少包括以下有益效果：本發明以水域中魚的CAT作為敏感生物標記物，通過對比CAT活性就可以檢測出水體是否受到汙染，不但檢測準確和敏感，而且直觀反映該水域的汙染對生物的危害程度。特別是魚的CAT活性與水體中重金屬鎘、菲或多氯聯苯的一種或一種以上的濃度均呈負相關，所以檢測到魚的CAT活性越低，其的水域受汙染的程度越大，並且明示受到重金屬鎘、菲或多氯聯苯的一種或一種以上的汙染。通過建立魚的CAT活性與重金屬鎘濃度的標準曲線，魚的CAT活性與菲濃度關係的曲線，或者魚的CAT活性與多氯聯苯濃度關係的曲線，可以將待檢測水域中與建立標準曲線同種同大小的魚的CAT活性比對，獲得水域中重金屬鎘濃度、菲或多氯聯苯濃度或綜合汙染濃度值，並且能反映出目前的汙染程度對生物是否在安全範圍或受到危害。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書能夠據以實施。

實施例1

本方案利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物，通過檢測魚的CAT活性，然後比對同類同大小的魚的CAT活性與某汙染物濃度關係的標準曲線，就可以檢測出水體是否受到某汙染物的汙染，不但檢測準確，且敏感度高，而且能直觀反映該水域的某汙染物的汙染程度及其對生物的危害程度。

實施例2

本方案利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物，根據魚的CAT活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關，通過測定魚的CAT活性，然後比對同類同大小的魚的CAT活性與鎘濃度關係的標準曲線，如果檢測樣本魚的CAT活性比正常情況下的同類同大小的魚的CAT活性低，則判斷水域受到鎘的汙染；CAT活性越低，則判斷水域的鎘汙染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。

實施例3

本方案利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物，根據魚的CAT活性與水體中菲(Phe)等多環芳烴的濃度呈負相關，通過測定魚的CAT活性，然後比對同類同大小的魚的CAT活性與菲關係的標準曲線，如果檢測樣本魚的CAT活性比正常情況下的同類同大小的魚的CAT活性低，則判斷水域受到菲的汙染；魚的CAT活性越低，則判斷水域的菲汙染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。

實施例4

本方案利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物，根據魚的CAT活性與水體中多氯聯苯的濃度呈負相關，通過測定魚的CAT活性，然後比對與建立標準曲線的魚同類同大小的魚的CAT活性與多氯聯苯濃度關係的標準曲線，如果檢測樣本魚的CAT活性比正常情況下的同類同大小的魚的CAT活性低，則判斷水域受到多氯聯苯的汙染；魚的CAT活性越低，則判斷水域的多氯聯苯汙染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。

實施例5

本方案利用魚的CAT活性檢測水體汙染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，並採用所述魚的CAT作為敏感生物標記物。首先通過實驗建立魚的CAT活性與某汙染物濃度的標準曲線，然後將待檢測水域中的同種同大小的魚的CAT活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中某汙染物的濃度。

通過實驗建立魚的CAT活性與重金屬鎘濃度關係的標準曲線如下：

本實驗的檢測樣本以海水青鱂為例，分十組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數據，將每組9個數據數理統計後得到每組魚的CAT活性大小。各組鎘濃度分別為0，80，160，240，320，400，480，560，640，720μg/L，養殖條件是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天投餵飼料三次，總投餵量為投餵時魚體溼重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，並跟蹤檢測水體和魚體鎘的變化，7天後隨機採集魚樣品，分別稱魚溼體重，存於-80℃冰箱中(因忙未能即測)用於分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定並經數理統計的的各組CAT活性分別是：21.64、19.18、18.13、17.02、14.45、12.13、10.02、7.71、6.21、5.13U/mgprot。海水青鱂的CAT活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關，然後根據實驗結果繪製標準曲線。

通過實驗建立魚的CAT活性與菲(Phe)濃度關係的標準曲線如下：

本實驗的檢測樣本以海水青鱂為例，分五組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數據，將每組9個數據數理統計後得到每組魚的CAT活性大小。各組菲濃度分別為0、250、500、750、1000μg/L，養殖條件是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天三次投餵飼料，總投餵量為投餵時魚體溼重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，並跟蹤檢測水體和魚體菲的變化，7天後隨機採集魚樣品，分別稱魚溼體重，存於-80℃冰箱中(便於長期有效保存)用於分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定並經數理統計的各組CAT活性分別是：12.710、10.393、8.714、7.106、5.213U/mgprot。海水青鱂的CAT活性與水體中菲(Phe)的濃度呈負相關，然後根據實驗結果繪製標準曲線。

通過實驗建立魚的CAT與多氯聯苯(PCB)濃度關係的標準曲線如下：

本實驗的檢測樣本以海水青鱂為例，分六組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數據，將每組9個數據數理統計後得到每組魚的CAT活性大小。各組多氯聯苯濃度分別為0、50、100、150、200、250μg/L，養殖條件是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天三次投餵飼料，總投餵量為投餵時魚體溼重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，並跟蹤檢測水體和魚體多氯聯苯的變化，7天後隨機採集魚樣品，分別稱魚溼體重，存於-80℃冰箱中(便於有效保存)用於分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定並經數理統計的各組CAT活性分別是：1.150、0.859、0.759、0.668、0.587、0.579U/mgprot。海水青鱂的CAT與水體中多氯聯苯(PCB)的濃度呈負相關，然後根據實驗結果繪製標準曲線。

測定待測水域中的海水青鱂的CAT活性的具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：製備全魚勻漿，然後離心分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，並分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然後代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一和試劑二，然後在所述測定管中加入待測樣本，混勻反應50秒；

步驟四、在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑三和試劑四，然後在所述對照管中加入待測樣本，混勻，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於0.5cm光徑，405nm波長處分別測所述對照管和測定管OD，分別記為對照OD值，測定OD值，其中取樣量為加入對照管或測定管的待測樣本的量，然後代入如下公式計算得魚的CAT活性：

然後將計算得海水青鱂的CAT活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受到汙染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度的大小或多氯聯苯濃度大小或綜合汙染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。

實施例6

利用實驗可以建立任何水體任何魚種的魚的CAT活性與重金屬鎘濃度的標準曲線，或者建立不同種類的魚的CAT活性與菲濃度關係的標準曲線，然後取待測水域中的魚做樣本，只要做樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。

測定待測水域中的魚的CAT活性具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當的魚製備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然後用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，並分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的OD，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然後代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一和試劑二，然後在所述測定管中加入待測樣本，混勻反應70秒；

步驟四、在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑三和試劑四，然後在所述對照管中加入待測樣本，混勻，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於0.5cm光徑，405nm波長處分別測所述對照管和測定管OD，分別記為對照OD值，測定OD值，其中取樣量為加入對照管或測定管的待測樣本的量，然後代入如下公式計算得魚的CAT活性，並且定義每毫克組織蛋白每秒鐘分解1umol的H2O2的量為一個活力單位，

將計算得魚的CAT活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受汙染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度或多氯聯苯(PCB)濃度的大小或綜合汙染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。

利用實驗建立20日齡的淡水青鱂的CAT活性與重金屬鎘濃度關係的標準曲線,CAT活性與菲濃度的標準曲線，以及CAT活性與多氯聯苯濃度的標準曲線，然後取待測水域中的魚做樣本，只要取得樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。

取得待測水域中20日齡的淡水青鱂做樣本，然後測定待測水域中的該魚的CAT活性具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當的魚製備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然後用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將雙蒸水、濃度為0.563g/L的蛋白標準品和待測樣本各0.05ml加入1、2、3號管中，並分別向各管加入考馬斯亮藍顯色劑3ml，分別混勻，靜置10min，預熱到35℃，預熱待用分光光度計並用雙蒸水調零後，於1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然後代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、在對照管和測定管中各加入南京生物工程研究所生產的試劑盒的試劑一1ml和試劑二0.1ml，然後在所述測定管中加入濃度為1％的待測樣本0.05ml，37℃混勻反應60秒；

步驟四、在所述對照管和測定管中各加入南京生物工程研究所生產的試劑盒的試劑三1ml和試劑四0.1ml，然後在所述對照管中加入濃度為1％的待測樣本0.05ml，用分光光度計並用雙蒸水調零後，於0.5cm光徑，405nm波長處分別測所述對照管和測定管OD，分別記為對照OD值，測定OD值，其中取樣量為加入對照管或測定管的待測樣本的量，所用試劑盒為南京生物工程研究所生產的試劑盒，試劑盒中的各個試劑是固定配置好的，然後代入如下公式計算得魚的CAT活性，並且定義每毫克組織蛋白每秒鐘分解1umol的H2O2的量為一個活力單元，計算的魚的CAT活性為18.5U/mgprot，

將計算得魚的CAT活性大小，然後和CAT活性與重金屬鎘濃度關係的標準曲線，CAT活性與菲濃度關係的標準曲線，以及CAT活性與多氯聯苯濃度關係的標準曲線分別比對，得到待測水域的鎘汙染濃度為125μg/L，菲濃度為0μg/L，多氯聯苯濃度為0μg/L，這樣既可以知道水體已受到汙染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度、菲或多氯聯苯濃度的大小，更能知道水體對生物體危害程度。

儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列應用範例，它完全適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地另行修改他用，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的實施例。