銀杏葉提取物及注射用銀杏葉凍乾粉針的製備方法

2023-10-17 14:14:49

專利名稱：銀杏葉提取物及注射用銀杏葉凍乾粉針的製備方法
技術領域：
本發明涉及到銀杏葉提取物的製備工藝及注射用銀杏葉凍乾粉針的生產工藝，屬於醫藥技術領域。
背景技術：
銀杏是地球上最古老的植物之一，具有獨特的藥理作用和治療價值，銀杏葉提取物含有黃酮類、萜內酯類、多酚類、有機酸、聚異戊稀醇多種微量元素等，具有抗氧化作用、抗血小板激活因子作用、降血脂、血糖作用，改善心、腦血液循環，對中樞神經系統、消化系統、呼吸系統等都有作臨床作用。其中銀杏內酯和銀杏黃酮為銀杏葉提取物中主要的藥效成分。銀杏內酯為二萜類酯化合物，包括銀杏內酯A、B、C、J和M(GKA、GKB、GKC、GKJ、GKM) 等。臨床及藥理研究表明銀杏黃酮類化合物能擴張微血管，增加皮膚中血流量。銀杏內酯類化合物對血小板活化因子有特異的拮抗作用，能抑制由血小板活化因子引起的炎症和瘙癢症。銀杏葉提取物具有增強心功能、改善微循環、降低血液粘稠性、拮抗血小板活化因子，清除體內自由基及明顯的纖維蛋白原溶解，增強心臟對缺血的耐受能力等。隨著飲食結構的改變，膽固醇攝入過多以及工作、生活壓力加大，運動量減少等原因，心腦血管發病率呈上升的趨勢。目前市場上治療心腦血管疾病的代表藥物有地奧心血康、複方丹參滴丸、步長腦心通、天保寧銀杏葉、海王銀杏葉片等眾多產品。我國是銀杏生產大國，有著豐富的銀杏資源，但是銀杏葉提取物的應用程度不高，其主要原因是銀杏葉提取物質量標準中有效成分偏低，不能滿足臨床的療效要求。造成銀杏葉提取物有效成分含量偏低的原因與銀杏葉提取物的生產工藝有很大關係。已報導的銀杏葉提取物工藝技術有酶法、熱浸法、微波提取法、二氧化碳超臨界提取法、水或有機溶劑法等。現有技術存在的主要問題是生產成本高，對環境影響大，提取的有效成分含量不高、工藝路線不夠合理以及難以實現大規模的工業化生產。我國的銀杏葉深加工起步晚，精度不夠，基本處於銷售原料和粗製品的狀況，由於國內缺乏嚴格的質量管理，無統一檢驗方法，造成提取物質量不穩定，提取物萜內酯含量較低或含量不穩定，致使我國銀杏葉提取物和製劑的質量和效益受到很大影響。本發明的主要目的是克服現有技術的不足，將傳統中藥與現代工業技術有機結合。本發明的製備工藝中採用了先進的大孔樹脂吸附工藝，去除了沒有治療作用的其它水溶性成分，克服了後處理的困難，簡化了提取步驟。與傳統的純化方式相比，整個過程成本低、能耗少、無汙染、效率高，並且樹脂可以反覆使用，使其銀杏葉提取物中銀杏總黃酮及銀杏內酯比例從24 6提高至40 10，可以滿足臨床使用。目前，銀杏葉提取物可作為銀杏葉膠囊、片劑、膠丸、滴丸、口服液、水針等產品。傳統的口服製劑主要通過胃腸道吸收，起效慢，生物利用率低，對於心肌梗塞、腦血管痙攣等發病緊急的病症來說有一定的滯後性。本發明可以填補國內銀杏葉注射劑型的空白。與水針相比，可以有效避免藥品注射液在生產中因高熱而分解變質，藥效穩定；與口服固體製劑相比，不存在口服肝腸循環吸收的缺陷，使用方便，既可肌肉注射，又可靜脈滴注，注射後很快進入血液，參與代謝循環，到達病灶部位，發揮治療作用，起效快、療程短，滿足了臨床療效的要求，對心腦血管疾病的治療具有積極的作用。目前的我國銀杏葉的產品還多為初級產品，隨著銀杏藥物及保健品的深度開發及國際上對銀杏產品的進一步認識，做為其中間原料的銀杏葉提取物也將會迎來更為巨大的市場空間。

發明內容
本發明通過以下技術方案實現一、銀杏葉提取物製備工藝I.提取工藝I. I藥材粉碎將乾燥的銀杏葉粉碎到60 100目。I. 2提取運用單因素及正交試驗的設計方法指導試驗開展，以多功能提取罐為 載體，出膏率及含量為評價指標，最總確定提取次數(3次)、各次時間(1.5h、lh、lh)、提取溶劑濃度(70±5%乙醇)及用量(12倍、6倍、6倍)。2.純化工藝2. I多效減壓濃縮通過減壓濃縮設備，嚴格控制濃縮溫度(80 100±5°C )，2. 2大孔樹脂分離通過對濃縮液量及pH的控制，同時對洗脫溶劑種類、濃度及洗脫速度的考察，同時通過在線監控洗脫液中有效成份，明確收集目標段；確定濃縮液PH在
6.0 10. 5範圍內，洗脫溶劑種類為水、15 % 25 %乙醇及75 % 85 %乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段。3.精製工藝3. I多效減壓濃縮條件及要求同2. I。3. 2萃取採用正交試驗的方法確定萃取次數、萃取量、萃取時間；此處收集有機相為內酯精品(含量>35%);水相需再次精製後方可達到要求。3. 3大孔樹脂分離水相用20 40% NaOH調節pH = 8. 0 10. 5，上柱。此處洗脫液的選擇打破常規的洗脫溶劑方式，採用鹼洗的方式富集銀杏黃酮。洗脫液調PH(約5)後多效減壓濃縮。3. 4大孔樹脂再次分離考察方法同2. I ;洗脫溶劑種類為水、15% 25%乙醇及75% 85%乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段，蒸乾。即得銀杏總黃酮精品(黃酮含量60%)。4.總黃酮及內酯按比例混合後即得銀杏葉提取物(40 10)。提取工藝路線圖見說明書附圖(圖I):二、注射用銀杏葉凍乾粉針生產工藝取處方量的銀杏葉提取物，加5% 10%配液量的乙醇攪拌溶解，加配液量75% 80%的水，加0. lmol/L的氫氧化鈉溶液適量，加入處方量甘露醇，60 80°C加熱攪拌使溶解，按0.1% (g/V)量加入活性炭，煮沸，保溫攪拌10分鐘，趁熱濾過，加注射用水至全量，用0. 22 iim的微孔濾膜過濾，濾液檢測溶液的澄明度及pH值合格後，按2ml/支分裝，置於凍幹機內進行真空冷凍乾燥，加蓋丁基膠塞及鋁蓋，貼標籤，檢驗，即得。製劑工藝路線圖見說明書附圖(圖2):


圖I:本發明中銀杏葉提取物提取工藝路線圖。圖2 :本發明中注射用銀杏葉凍乾粉針生產工藝路線圖。
具體實施例方式一、銀杏葉提取物I.提取工藝I. I藥材粉碎將乾燥的銀杏葉粉碎到60 100目。I. 2提取運用單因素及正交試驗的設計方法指導試驗開展，以多功能提取罐為載體，出膏率及含量為評價指標，最總確定提取次數(3次)、各次時間(1.5h、lh、lh)、提取溶劑濃度(70±5%乙醇)及用量(12倍、6倍、6倍)。
2.純化工藝2. I多效減壓濃縮通過減壓濃縮設備，嚴格控制濃縮溫度(80 100±5°C )，2. 2大孔樹脂分離通過對濃縮液量及pH的控制，同時對洗脫溶劑種類、濃度及洗脫速度的考察，同時通過在線監控洗脫液中有效成份，明確收集目標段；確定濃縮液PH在
6.0 10. 5範圍內，洗脫溶劑種類為水、15% 25%乙醇及75% 85%乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段。3.精製工藝3. I多效減壓濃縮條件及要求同2. I。3. 2萃取採用正交試驗的方法確定萃取次數、萃取量、萃取時間；此處收集有機相為內酯精品(含量>35%);水相需再次精製後方可達到要求。3. 3大孔樹脂分離水相用20 40% NaOH調節pH = 8. 0 10. 5，上柱。此處洗脫液的選擇打破常規的洗脫溶劑方式，採用鹼洗的方式富集銀杏黃酮。洗脫液調PH(約5)後多效減壓濃縮。3. 4大孔樹脂再次分離考察方法同2. I ;洗脫溶劑種類為水、15% 25%乙醇及75% 85%乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段，蒸乾。即得銀杏總黃酮精品(黃酮含量60%)。4.總黃酮及內酯按比例混合後即得銀杏葉提取物(40 10)。二、注射用銀杏葉凍乾粉針取銀杏葉提取10 20g，加乙醇80 150ml攪拌溶解，加水1500 2000ml，加0. lmol/L的氫氧化鈉溶液20ml，加入甘露醇19 190g，60 80°C加熱攪拌使溶解，加入0.1% (g/V)的活性炭，煮沸，保溫攪拌10分鐘，趁熱濾過，加注射用水至2000ml，用0.22 um的微孔濾膜過濾，濾液檢測溶液的澄明度及pH值合格後，按2ml/支分裝，置於凍幹機內冷凍乾燥，加蓋丁基膠塞及鋁蓋，貼標籤，檢驗，即得。動物試驗本發明藥物經動物試驗證明，療效安全可靠，對心腦血管作用明顯。具體動物試驗內容如下一、主要藥效學試驗研究資料I、注射用銀杏葉凍乾粉針對實驗性犬局灶性腦缺血的影響注射用銀杏葉凍乾粉針高、中劑量組能明顯減少犬大腦中動脈結紮後的腦組織缺血區重量(P < 0. 05);注射用銀杏葉凍乾粉針高、中劑量組均顯著優於口服銀杏葉提取物組(P < 0. 05);高、中劑量組能明顯升高犬大腦中動脈平均血流速度(P < 0. 05)。2、注射用銀杏葉凍乾粉針抗沙土鼠試驗性全腦缺血試驗(I)對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷後腦電圖(EEG)的影響研究結果表明在關閉沙土鼠雙側頸總動脈10分鐘(即腦缺血10分鐘)，EEG幅度立即產生明顯的持續低平的改變，注射用銀杏葉凍乾粉針和複方丹參注射液均不能拮抗上述變化。但再灌期60分鐘EEG電位幅度緩慢恢復接近給藥後水平，NS組僅達給藥後水平的41. 3%，說明其對再灌注損傷所致EEG的影響不大，反之注射用銀杏葉凍乾粉針隨劑量增加促進再灌注損傷EEG電位幅度的恢復，高劑量組10、30、60分鐘與NS組同時間點比較均有顯著差異。說明其不但作用顯著，而且促進再灌注損傷EEG改變恢復的速度也明顯先於對照組。注射用銀杏葉凍乾粉針高、中、低劑量和複方丹參注射液促進全腦細胞缺血再注損傷EEG電位幅度的恢復率分別為96. 4%,47. 4%,41. 3%和84. 7% (2)對沙土鼠全腦缺血及再灌注損傷後大腦皮層組織Ca2+、Na+和含水量的影響注射用銀杏葉凍乾粉針低劑量組能明顯降低沙土鼠全腦缺血再灌注大腦皮層Na+和水含量(P<0. 05)、高劑量組更顯著降低Na+和水含量(P< 0.01)，呈量效關係，並能使Ca2+量明顯下降，而複方丹參注射液組僅顯示水量下降，不能使Na+和Ca2+量下降，與注射用銀杏葉凍乾粉針高劑量組比較有統計學差異(P < 0. 05)，說明在減輕腦缺血再灌注所致腦水腫，拮抗Na+和Ca2+的升高方面注射用銀杏葉凍乾粉針優於複方丹參注射液。(3)對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷後大腦脂質過氧化物(LPO)的影響複方丹參注射液與高、低劑量的注射用銀杏葉凍乾粉針均能顯著降低缺血再灌注損傷後大腦皮層脂質過氧化物含量，有利於腦細胞功能的恢復。在降低MDA的水平上複方丹參注射液明顯優於注射用銀杏葉凍乾粉針。3、注射用銀杏葉凍乾粉針抗心肌缺血試驗(I)麻醉犬心肌缺血試驗(結紮冠狀動脈前降支法)①對心肌缺血酶學指標及左室梗塞範圍影響注射用銀杏葉凍乾粉針可使犬結紮冠狀動脈前降支缺血所致的左心室梗塞範圍顯著縮小，具有明顯的改善心肌缺血作用。注射用銀杏葉凍乾粉針各組療效均優於口服銀杏葉提取物組(P < 0.01)。注射用銀杏葉凍乾粉針各組對心肌酶無明顯影響。②對心臟功能及血流動力學的影響注射用銀杏葉凍乾粉針可明顯緩解結紮冠狀動脈前降支後由於心肌缺血所致ST段抬高，持續10分鐘，與陽性對照藥複方丹參注射液相似。注射用銀杏葉凍乾粉針對心率和平均股動脈壓等參數雖可見一些小幅度和散在的變化，但從總體上看注射用銀杏葉凍乾粉針和複方丹參注射液對心率、平均股動脈壓和心輸出量等血流動力學參數未見明顯影響。③對心肌缺血模型動物心臟收縮和舒張功能及耗氧指數的影響注射用銀杏葉凍乾粉針對結紮冠狀動脈前降支後心肌收縮功能的基本影響是能明顯改善缺血心肌的舒張性能，這對缺血心肌冠脈血流量的改善是有利的。對心肌耗指數無明顯影響。(2)離體豚鼠心臟灌流試驗(腦垂體後葉素所致心肌缺血模型)
①對豚鼠離體心臟冠脈流量及垂體後葉素所致冠脈收縮的影響注射用銀杏葉凍乾粉針對離體豚鼠心臟的冠脈流量給藥後2分鐘冠脈流量的變化率均非常顯著的高於NS組，說明其對離體心臟的冠狀動脈有明顯的擴張作用。注射用銀杏葉凍乾粉針和複方丹參注射液均能對抗垂體後葉所致的冠脈流量減少，高劑量注射用銀杏葉凍乾粉針組的對抗作用顯著強於複方丹參注射液。②對離體豚鼠心臟心率、心肌收縮力的影響注射用銀杏葉凍乾粉針和複方丹參注射液對離體豚鼠心臟的心率和心肌收縮力兩項指標給藥前後自身比較均未見明顯差異，說明其對離體正常心臟的基本活動無直接的明顯的影響。(3)注射用銀杏葉凍乾粉針對垂體後葉素誘發的在體心肌缺血影響
注射用銀杏葉凍乾粉針各劑量組對由垂體後葉素所致的冠狀動脈痙攣而引起的急性心肌缺血有明顯的對抗作用，在注射用銀杏葉凍乾粉針高、低劑量組存在明顯的量效規律性。結果提示注射用銀杏葉凍乾粉針通過改善缺血心肌血氧的供應而促進心肌細胞對氧需求的平衡。4、注射用銀杏葉凍乾粉針改善微循環試驗注射用銀杏葉凍乾粉針各劑量組均能顯著促進滴加鹽酸腎上腺素後小鼠腸繫膜毛細血管網交點開放數(P < 0.01，P < 0.05和？ < 0. 05);高、中劑量組能明顯改善腎上腺素所致小鼠腸繫膜微循環血流速度減慢或停滯(P<0.05);高、中劑量組能明顯對抗腎上腺素所致小鼠腸繫膜微動脈血管收縮(P<0.05);注射用銀杏葉凍乾粉針能明顯對抗腎上腺素所致小鼠腸繫膜微靜脈血管收縮(P < 0. 05)。5、注射用銀杏葉凍乾粉針改善血瘀模型大鼠血液流變性試驗注射用銀杏葉凍乾粉針高劑量組能明顯降低血瘀模型大鼠高切全血粘度和血漿粘度(P < 0. 05)，中劑量組能明顯降低血漿粘度(P < 0. 05)。6、注射用銀杏葉凍乾粉針對抗小鼠尾血栓試驗注射用銀杏葉凍乾粉針高劑量對角叉菜所致小鼠尾血栓形成有顯著抑制作用(P 0. 05)，無明顯協同閾下劑量戊巴比妥鈉催眠的作用(P> 0.05)，無明顯協同閾劑量戊巴比妥鈉催眠的作用(P> 0.05)，對小鼠肌肉協調無明顯影響(P>0.05)。注射用銀杏葉凍乾粉針各組給藥後對犬體溫無明顯影響(P > 0. 05)。2、心血管系統(I)對血壓影響注射用銀杏葉凍乾粉針各組給藥後對犬舒張壓、收縮壓均無明顯影響(P>0. 05)。(2)對心電圖的影響注射用銀杏葉凍乾粉針各組在給藥後120min內，對犬心率及心電圖無明顯影響(P > 0. 05)。
(3)呼吸系統注射用銀杏葉凍乾粉針各組在給藥後120min內，對犬呼吸頻率和振幅無明顯影響(P > 0. 05)。結論注射用銀杏葉凍乾粉針一般藥理試驗研究顯示，該藥對動物的精神神經系統、心血管系統和呼吸系統無明顯作用。三、動物急性毒性試驗注射用銀杏葉凍乾粉針小鼠靜脈給藥的LD50為545. 65mg/kg，95%的置信區間為482. 58 616. 96mg/kg。相當成人日用劑量的409倍。腹腔給藥的LD50為1573. 70mg/kg,95%的置信區間為1405. 89 1761. 53mg/kg。相當成人日用劑量的1183倍。四、動物長期毒性試驗
I、大鼠三個月長期毒性試驗資料注射用銀杏葉凍乾粉針，由陝西博森生物製藥股份集團有限公司提供，批號100901。按新藥審批管理辦法的要求，根據該品種臨床主治及療程的特點，設計了本試驗方案注射用銀杏葉凍乾粉針按133. 3mg/kg、66. 67mg/kg和33. 33mg/kgg三個劑量,分別相當於其臨床靜脈劑量的100、50和25倍，連續對大鼠腹腔注射給藥90天及停藥14天，對動物的主要觀察和檢查結果為(I) 一般情況及體重注射用銀杏葉凍乾粉針與對照組比較I 90天，體重無顯著性變化(p > 0. 05)停藥14天體重無顯著性差異(p > 0. 05)。(2)血常規注射用銀杏葉凍乾粉針連續對大鼠注射給藥90天血象檢查，與對照組比較僅見注射用銀杏葉凍乾粉針各組PDW、MPV有顯著性下降(P 0. 05)。(3)肝功能注射用銀杏葉凍乾粉針給藥90天大鼠肝功能檢查，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。注射用銀杏葉凍乾粉針停藥14天大鼠肝功能檢查，與對照組比較無顯著差異(P
>0. 05)。(4)腎功能注射用銀杏葉凍乾粉針給藥90天大鼠腎功能檢查，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。注射用銀杏葉凍乾粉針停藥14天大鼠腎功能檢查，與對照組比較無顯著差異(P
>0. 05)。(5)其它生化指標註射用銀杏葉凍乾粉針給藥90天GLU、CH0L檢查，與對照組比較無顯著差異(P >0. 05)。注射用銀杏葉凍乾粉針停藥14天GLU、CH0L檢查，與對照組比較無顯著差異(P >
0.05)。(6)系統屍解及臟器指數注射用銀杏葉凍乾粉針高、中、低三個劑量連續對大鼠注射給藥90天注射用銀杏葉凍乾粉針各給藥組與對照組比較，各臟器指數無顯著差異(P>0.05)。注射用銀杏葉凍乾粉針高、中、低三個劑量連續對大鼠注射停藥14天注射用銀杏葉凍乾粉針各給藥組與對照組比較，各臟器指數無顯著差異(P > 0. 05)。(7)病理組織學檢查給藥90天檢查對照組和注射用銀杏葉凍乾粉針高劑量組分別各有I例動物肝臟有輕微局灶性炎細胞浸潤。其餘各組各項指標均未發現明顯的病理形態學損害。停藥14天檢查，未見明顯異常。結論注射用銀杏葉凍乾粉針在人用劑量100倍，使用周期5倍的情況下，未發生毒性反應及延遲性毒性反應，提供大鼠無毒性反應的劑量為133. 3mg/kg/日。
2、Beagle犬三個月長期毒性試驗注射用銀杏葉凍乾粉針(批號100901)，由陝西博森生物製藥股份集團有限對照組，C組為低劑量試驗組。主要療效評價NIHSS量表療效NIHSS評分治療前後變化值，經協方差分析，分組間差別有統計學意義(FAS P =0. 0147，PPS P = 0. 0057)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 0929,PPS P = 0. 0659)；A處理與B處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-I. 34(-2. 42，-0. 26)，PPS結果為-I. 52(-2. 62，-0. 42)，組間差別均有統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-0. 70(-1. 78，
0.38)，PPS結果為-0. 78(-1. 87，0. 31)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為0. 64 (-0. 43，
1.72)，PPS結果為0. 74(-0. 35，I. 82)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-4. 76(-5. 40，-4.12)，PPS 結果為-4. 87 (-5. 53，-4. 20)，差別均有統計學意義。B 處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-3. 42(-4. 07，-2. 77)，PPS結果為-3. 35(-4. 01，-2. 69)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-4. 06(-4. 71,-3. 41)，PPS結果為-4. 09(-4. 74,-3. 44)，差別均有統計學意義。NIHSS評分治療後改善率，經協方差分析，分組間差別有統計學意義(FAS P =0.0194，PPS :P = 0. 0118)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 1910,PPS P = 0. 1487)；A處理與B處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為10.51(1.72，
19.29)，PPS結果為11. 33 (2. 40，20. 26)，組間差別均有統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為4. 45 (-4. 32，
13.22)，PPS結果為4. 76 (-4. 12，13. 64)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-6. 06(-14. 81，
2.70)，PPS結果為-6. 57 (-15. 36，2. 22)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為47.94(42.70，53. 18)，PPS結果為48. 50(43. 13，53. 88)，差別均有統計學意義。B處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為37. 43(32. 15，42. 72)，公司研製提供進行該藥的Beagle犬長期毒性試驗。按新藥審批管理的要求，根據該品種臨床主治及療程的特點，設計了本試驗方案注射用銀杏葉凍乾粉針按80、40和20mg/kg三個劑量，分別相當於其臨床靜脈給藥劑量的60、30、15倍,連續對Beagle犬注射給藥90天及停藥14天,結果如下(I)生長發育及一般情況觀察給藥期間和停藥觀察，動物的精神行為活動、皮毛、呼吸、循環、食慾，大小便等均未見明顯異常。給藥及停藥期間，對犬體重增長和發育無明顯影響。(2)尿常規檢查未見異常。(3)對血象的影響未見異常。(4)對肝功能的影響給藥45天檢查可見注射用銀杏葉凍乾粉針低劑量組ALT降低(P 0.05)。停藥14天檢查各組各臟器檢查均未見異常。結論注射用銀杏葉凍乾粉針大劑量80、40和20mg/kg長期靜脈給藥，對Beagle犬無明顯異常反應，亦無明顯延遲性毒性反應。提供犬無毒性反應的劑量為80mg/kg/日，相當於臨床人用量的60倍。五、特殊安全性試驗研究注射用銀杏葉凍乾粉針的溶血性試驗、家兔熱原檢查試驗、家兔肌肉刺激試驗、黏膜刺激試驗、家兔血管刺激試驗、小鼠異常毒性試驗、降壓物質檢測試驗、豚鼠皮膚過敏試驗、豚鼠全身過敏試驗檢查均合格。臨床試驗本發明經新藥I、II期臨床試驗結果表明對治療心、腦血管疾病療效顯著。II期臨床試驗分腦血管和心血管兩個適應症進行研究，結果如下一、治療腦血管方面分A、B、C三個組進行研究，A組為高劑量試驗組，B組為舒血寧注射液PPS結果為37. 17(31.83,42. 51)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為43. 49(38. 22，48. 76)，PPS結果為43. 74(38. 47，49. 02)，差別均有統計學意義。次要療效指標中醫徵候療效中醫徵候積分治療前後變化值，經協方差分析，分組間差別有統計學意義(FAS P = O. 0300，PPS P = 0. 0364)，中心間組間差別趨勢不一致(FAS P = 0. 0095，PPS P =
0.0042)；A處理與B處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-I. 33 (-2. 57，-0. 10)，PPS結果為-I. 36 (-2. 64，-0. 08)，組間差別均有統計學意義。
A處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-I. 04(-2. 28，
0.20)，PPS結果為-I. 00(-2. 27，0. 28)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為0.29 (-0.94，
1.53)，PPS結果為0. 36(-0. 90，I. 62)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-6. 84(-7. 58，-6.10)，PPS 結果為-6. 82 (-7. 59，-6. 05)，差別均有統計學意義。B 處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-5. 51(-6. 25，-4. 76)，PPS結果為-5. 46(-6. 22，-4. 70)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-5. 80 (-6. 54，-5. 06)，PPS結果為-5. 82 (-6. 57,-5. 07)，差別均有統計學意義。中醫徵候積分治療後改善率，經協方差分析，分組間差別無統計學意義(FAS P = 0. 0785，PPS P = 0. 1303)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 0688，PPS P = 0. 0299)；A處理與B處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為7. 72 (-0.80，16. 24)，PPS結果為7. 16 (-1. 49，15. 81)，組間差別均無統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為6. 25 (-2. 27,
14.78)，PPS結果為5. 37 (-3. 26，13. 99)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-1.47(-9.97,
7.04)，PPS結果為-I. 79 (-10. 31，6. 73)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為52.92(47.83，58.01)，PPS結果為52. 14(46.93,57. 36)，差別均有統計學意義。B處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為45. 20(40. 10，50. 31)，PPS結果為44. 98(39. 84，50. 12)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為 46. 67 (41. 56，51. 78)，PPS 結果為 46. 77 (41. 67，51. 88)，差別均有統計學意義。組間第8天中醫徵候療效比較有效率FAS (PPS) :A 處理 30. 56% (32. 35 %)、B 處理 31. 94 % (31.43%)、C 處理 36. 11 % (35. 21 % ),無效率 FAS(PPS) A 處理 69. 44 % (67. 65 % ), B 處理 68. 06 %(68. 57% ) ,C 處理 63. 89% (64. 79% ),經單向有序CMH-X 2檢驗，FAS結果為P = 0. 9457，PPS結果為P = 0.9318，組間差別均無統計學意義。組間第14天中醫徵候療效比較臨床痊癒率FAS (PPS) A 處理 I. 39% (0. 00% )、B 處理 0. 00% (0. 00% )、C 處理
0.00% (0. 00% )，顯效率FAS (PPS) :A 處理 27. 78% (27. 94 %)、B 處理 11. 11 % (11. 43%)、C 處理 18.06% (18. 31 % )，有效率 FAS(PPS) :A 處理 50. 00 % (51. 47 % )、B 處理 69. 44 %(68. 57% )、C 處理 61. 11% (60. 56% )，無效率 FAS (PPS) :A 處理 20. 83% (20. 59% )、B 處S 19. 44% (20.00% )、C 處理 20. 83% (21. 13% )，經單向有序 CMH-x 2 檢驗，FAS 結果為P = O. 0880，PPS結果為P = O. 1085，組間差別均無統計學意義。ADL量表療效ADL評分治療前後變化值，經協方差分析，分組間差別無統計學意義(FAS P =0.2385，PPS P = 0. 2034)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 0958，PPS P = 0. 1060)；A處理與B處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為4. 08(-1.59,9. 76)，PPS結果為4. 37 (-1. 39，10. 12)，組間差別均無統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為2. 06 (-3. 62，
7.73)，PPS結果為2. 08(-3. 67，7. 82)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-2. 02 (-7. 71，
3.66)，PPS結果為-2. 29 (-8. 00，3. 42)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為21. 41 (18. 01, 24.80)，PPS結果為21.55(18. 07，25. 03)，差別均有統計學意義。B處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為17. 33(13. 93,20. 72)，PPS結果為17. 18(13. 76，
20.61)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為 19. 35 (15. 95，22. 75)，PPS 結果為 19. 47 (16. 07，22. 87)，差別均有統計學意義。組間第8天Barthel指數變化比較降2 級率 FAS (PPS) :A 處理 4. 17% (4. 41 % ), B 處理 0. 00% (0. 00 % ), C 處理
0.00% (0. 00% )，降I 級率 FAS(PPS) :A 處理 29. 17% (29. 41 % )、B 處理 13.89% (14. 29% )、C處理 34. 72% (35. 21% )，不變率 FAS (PPS) :A 處理 66. 67% (66. 18% )、B 處理 86. 11%(85. 71% )、C 處理 65. 28% (64. 79% )，經單向有序 CMH-x 2 檢驗，FAS 結果為 P = 0.0056，PPS結果為P = O. 0083，組間差別均有統計學意義。組間第14天Barthel指數變化比較降3 級率 FAS (PPS) :A 處理 4. 17% (4. 41 % ), B 處理 2. 78% (2. 86 % ), C 處理
1.39% (I. 41% )，降2 級率 FAS(PPS) :A 處理 16. 67% (16. 18% )、B 處理 15. 28% (14.29%)、C 處理 12. 50 % (12. 68 % )，降 I 級率 FAS (PPS) A 處理 34. 72 % (35. 29 % ), B 處理 31. 94 %(32. 86% ), C 處理 47. 22 % (46. 48 % ),不變率 FAS (PPS) A 處理 43. 06 % (42. 65% ), B處理 50. 00 % (50. 00% ), C 處理 38. 89 % (39. 44 % )，升 I 級率 FAS (PPS) A 處理 I. 39 %(1.47% )、B 處理 0.00% (0.00% )、C 處理 0.00% (0. 00% ),經單向有序CMH-X 2檢驗，FAS結果為P = 0. 7220，PPS結果為P = 0.6758，組間差別均無統計學意義。二、治療心血管方面分A、B、C三個組進行研究，A組為低劑量試驗組，B組為舒血寧注射液對照組，C組為高劑量試驗組。主要療效評價組間心絞痛療效比較顯效率FAS (PPS) :A 處理 38. 03% (39. 71 %)、B 處理 34. 72 % (36. 76 %)、C 處理 33. 33 % (34. 29 % )，有效率 FAS (PPS) A 處理 47. 89 % (48. 53 % )、B 處理 55. 56 %(55. 88%)、C 處理 48. 61% (48. 57% )，無效率 FAS (PPS) :A 處理 14. 08% (11.76%)、B 處理 9. 72% (7. 35% )、C 處理 18. 06% (17. 14% )，經單向有序CMH-X 2檢驗，FAS結果為P = 0. 7575，PPS結果為P = 0.5655，組間差別均無統計學意義。
組間心電圖療效比較顯效率FAS (PPS) 4處理9.86% (10. 29% )、B 處理 11. 11 % (10.29%)、C處理
9.72% (10. 00% )，有效率FAS (PPS) :A 處理 47. 89% (50. 00 %)、B 處理 55. 56 % (58. 82 %)、C 處理 54. 17 % (54. 29 % )，無效率 FAS (PPS) A 處理 40. 85 % (38. 24 % )、B 處理 33. 33 %(30. 88% )、C 處理 36. 11% (35. 71% )，加重率 FAS (PPS) :A 處理 I. 41% (I. 47% )、B 處理0. 00% (0.00% )、C 處理 0.00% (0. 00% ),經單向有序CMH-X 2檢驗，FAS結果為P = 0. 5990，PPS結果為P = 0.6997，組間差別均無統計學意義。組間中醫證候療效比較
顯效率FAS (PPS) :A 處理 29. 58% (30. 88% )、B 處理 36. 11% (38. 24% )、C 處理 36. 11 % (37. 14% ),有效率 FAS(PPS) A 處理 59. 15 % (58. 82 % ), B 處理 51. 39 %(51. 47% )、C 處理 54. 17% (54. 29% )，無效率 FAS (PPS) :A 處理 11. 27% (10. 29% )、B 處a 12. 50% (10. 29% )、C 處理 9. 72% (8. 57% ),經單向有序CMH-X 2檢驗，FAS結果為P = 0. 5495，PPS結果為P = 0.5537，組間差別均無統計學意義。組間硝酸甘油停減率比較停藥率FAS(PPS) :A 處理 45. 16% (46. 67 %)、B 處理 63. 33 % (65. 52 %)、C 處理 51. 85% (51. 85 % )，減量率 FAS (PPS) :A 處理 32. 26 % (30. 00 % )、B 處理 20. 00 %(20.69% )、C 處理 25. 93% (25. 93% )，不變率 FAS (PPS) :A 處理 22. 58% (23.33%)、B 處
S16. 67% (13.79% )、C 處理 22. 22% (22. 22% )，經單向有序 CMH-x 2 檢驗，FAS 結果為P = O. 5391，PPS結果為P = O. 3924，組間差別均無統計學意義。次要療效指標心絞痛評分心絞痛評分治療前後變化值，經協方差分析，分組間差別無統計學意義(FAS P =
0.3687，PPS P = 0. 2931)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 7990，PPS P = 0. 8266)；A處理與B處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-0.01(-1. 17，
1.16)，PPS結果為0. 06 (-1. 13，I. 26)，組間差別均無統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-0.61(-1. 77，0. 56)，PPS結果為-0. 65(-1. 83，0. 54)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-0.60(-1. 76，0. 56)，PPS結果為-0. 71 (-1. 89，0. 47)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為-5. 51(-6. 21，-4.81), PPS 結果為-5. 58(-6. 29，-4. 88)，差別均有統計學意義。B 處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-5. 50(-6. 19，-4.81)，PPS結果為-5. 65(-6. 36，-4. 94)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-4. 90(-5. 60,-4. 21)，PPS結果為-4. 94(-5. 64,-4. 23)，差別均有統計學意義。中醫證候評分
中醫證候評分治療前後變化值，經協方差分析，分組間差別無統計學意義(FAS P = O. 9987，PPS P = 0. 9534)，中心間組間差別趨勢一致(FAS P = 0. 6769，PPS P =0. 8927)；A處理與B處理間校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果為0. 02(-0. 94，0. 97)，PPS結果為0. 11(-0. 86，I. 08)，組間差別均無統計學意義。A處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為0.02 (-0.94，0. 97)，PPS結果為0. 11(-0. 86，I. 07)，組間差別均無統計學意義。B處理與C處理間校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-0.00(-0. 95，0. 95)，PPS結果為-0. 01 (-0. 97，0. 96)，組間差別均無統計學意義。A處理治療前後校正的差數均數(95 %可信區間)FAS結果 為-6.38(-6.95, -5.81), PPS 結果為-6. 42 (-7. 00，-5. 85)，差別均有統計學意義。B 處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-6. 40(-6. 96，-5. 83)，PPS結果為-6. 54(-7. 12，-5. 96)，差別均有統計學意義。C處理治療前後校正的差數均數(95%可信區間)FAS結果為-6. 40(-6. 96,-5. 83)，PPS結果為-6. 53(-7. 10,-5. 96)，差別均有統計學意義。運動試驗心電圖運動級別、運動時間等組間差別均無統計學意義。
權利要求
1.一種治療心腦血管疾病的高質量的銀杏葉提取物及注射用銀杏葉凍乾粉針，其特徵在於將傳統中藥與現代工業技術有機結合，在製備工藝中採用大孔樹脂吸附分離、高效液相指紋圖譜質量控制等先進工藝，具有生產周期短，無汙染等特點，為保證產品質量，在生產中採用高效液相色譜法定量測定產品有效成分含量，薄層色譜法和指紋圖譜定性鑑別處方藥物。此製備工藝克服了後處理的困難，簡化了提取步驟，從而保證了銀杏葉提取物的質量。
注射用銀杏葉凍乾粉針，復溶後可迅速溶解並恢復藥液原有的特性，注射後迅速進入血液，參與代謝循環，到達病灶部位，發揮治療作用，起效快、療程短。
2.銀杏葉提取物及注射用銀杏葉凍乾粉針，其特徵在於所述的工藝包括以下步驟 2. I銀杏葉提取物製備工藝2. I. I提取工藝 2. I. I. I藥材粉碎將乾燥的銀杏葉粉碎到60 100目。
2. I. I. 2提取運用單因素及正交試驗的設計方法指導試驗開展，以多功能提取罐為載體，出膏率及含量為評價指標，最總確定提取次數(3次)、各次時間(1.5h、lh、lh)、提取溶劑濃度(70 ±5%乙醇)及用量(12倍、6倍、6倍)。
2.I. 2純化工藝 2.I. 2. I多效減壓濃縮通過減壓濃縮設備，嚴格控制濃縮溫度(80 100±5°C )。
2.I. 2. 2大孔樹脂分離通過對濃縮液量及pH的控制，同時對洗脫溶劑種類、濃度及洗脫速度的考察，同時通過在線監控洗脫液中有效成份，明確收集目標段；確定濃縮液PH在6.O 10. 5範圍內，洗脫溶劑種類為水、15% 25 %乙醇及75% 85 %乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段。
2.I. 3精製工藝 2.I. 3. I多效減壓濃縮條件及要求同2. 1.2. I0 2.I. 3. 2萃取採用正交試驗的方法確定萃取次數、萃取量、萃取時間；此處收集有機相為內酯精品(含量> 35% );水相需再次精製後方可達到要求。
2.I. 3. 3大孔樹脂分離水相用20 40% NaOH調節pH = 8. O 10. 5，上柱。此處洗脫液的選擇打破常規的洗脫溶劑方式，採用鹼洗的方式富集銀杏黃酮。洗脫液調PH(約5)後多效減壓濃縮。
2.I. 3. 4大孔樹脂再次分離考察方法同2. I. 2. 2 ;洗脫溶劑種類為水、15% 25%乙醇及75% 85%乙醇，洗脫速度為5 10BV/h，收集段為70% 80%乙醇段，蒸乾。即得銀杏總黃酮精品(黃酮含量60%)。
2.I. 4總黃酮及內酯按比例混合後即得銀杏葉提取物(40 10)。
2.2注射用銀杏葉凍乾粉針生產工藝取銀杏葉提取10 20g，加乙醇80 150ml攪拌溶解，加水1500 2000ml，加O. lmol/L的氫氧化鈉溶液20ml，加入甘露醇19 190g，60 80°C加熱攪拌使溶解，加入0.1% (g/V)的活性炭，煮沸，保溫攪拌10分鐘，趁熱濾過，加注射用水至2000ml，用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾，濾液檢測溶液的澄明度及pH值合格後，按2ml/支分裝，置於凍幹機內冷凍乾燥，加蓋丁基膠塞及鋁蓋，貼標籤，檢驗，即得。
3.根據權利要求2中所述的製備工藝，其特徵在於2.I中銀杏葉提取物內酯類化合物的含量> 35%，黃酮類類化合物的含量> 60%。
4.根據權利要求2中所述的製備工藝，其特徵在於2.I中減壓濃縮，嚴格控制濃縮溫度(80±5°C)，將提取液濃縮至需要的量，此方式可最大程度的保留提取液中的藥物活性。
5.根據權利要求2中所述的製備工藝，其特徵在於2.I中採用了先進的大孔樹脂吸附工藝，省去了醇沉工藝中的多道工序，達到除雜的目的，並且最大限度的保持了有效成分的量；保證銀杏葉的有效成分保持不變，其中的萜類、留類、皂甙反應較醇沉工藝更為明顯。配合動態洗脫方式及運用鹼洗的洗脫溶劑，使其銀杏葉提取物中銀杏總黃酮及銀杏內酯比例從24 6提高至40 10，可以滿足臨床使用，實現大規模工藝生產。也為大孔樹脂吸附技術應用於中藥現代化提取工藝的可行性、推廣性、普及性做了有益的嘗試。
6.根據權利要求2中注射用銀杏葉凍乾粉針的生產工藝，其特徵在於2.2中將銀杏葉提取物製成注射用銀杏葉凍乾粉針，可以有效避免藥品注射液在生產中因高熱而分解變質，無口服肝腸循環吸收的缺陷，注射後很快進入血液，參與代謝循環，到達病灶部位，發揮治療作用，起效快、療程短，滿足了臨床療效的要求，對心腦血管疾病的治療具有積極的作用。
全文摘要
本發明涉及一種銀杏葉提取物及注射用銀杏葉凍乾粉針的製備方法。此方法將傳統中藥與現代工業技術有機結合，在製備工藝中採用大孔樹脂吸附分離、高效液相指紋圖譜質量控制等先進工藝，具有生產周期短，無汙染等特點。此發明去除了沒有治療作用的其它水溶性成分，克服了後處理的困難，簡化了提取步驟，使其銀杏葉提取物中銀杏總黃酮及銀杏內酯從24∶6提高至40∶10，從而保證了銀杏葉提取物的質量。注射用銀杏葉凍乾粉針劑，填補了國內銀杏葉注射劑型的空白。有效地避免了注射液在生產中因高熱而分解變質，復溶後可迅速溶解並恢復藥液原有的特性，注射後迅速進入血液，參與代謝循環，到達病灶部位，發揮治療作用，起效快、療程短，對心腦血管疾病的治療具有積極的作用。
文檔編號A61P39/06GK102772451SQ201110120738
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月11日 優先權日2011年5月11日
發明者楊繼安 申請人:陝西博森生物製藥股份集團有限公司