中華金葉榆葉色性狀相關的srap分子標記方法及應用的製作方法
2023-05-18 01:20:01 3
中華金葉榆葉色性狀相關的srap分子標記方法及應用的製作方法
【專利摘要】中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法及應用，涉及一種SRAP分子標記方法及應用。本發明的目的在於提供一種中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法及應用。方法：一、中華金葉榆不同葉色葉片採集和葉色標定；二、分別提取每株中華金葉榆植株上金色葉片和森林綠色葉片的總RNA；三、RNA濃度檢測；四、cDNA-SRAP擴增差異片段；五、差異片段的回收、測序和分析。本發明具有操作簡單、結果準確、直觀實用等特點。本發明方法用於中華金葉榆葉色差異基因研究。
【專利說明】中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種SRAP分子標記方法及應用。
【背景技術】
[0002]在園林綠化中，彩葉樹種具有色彩鮮豔、觀賞期長、易於形成大色塊景觀的特點，其豐富的園林景觀層次，彌補了城市色彩單調、缺乏季相變化的缺憾。各國對於彩葉植物在園林上的應用倍加重視。近百年來，國外發達國家在彩葉植物品種的選育和栽培方面做了大量工作。在德國，應用於城市園林中的常色葉樹種共有64種，分屬於17種，35亞種或雜交種，且色彩斑斕，配置得當，營造出優美的園林景觀效果。國內在彩葉植物育種引種方面的工作開始較晚，尚處於起步階段。目前我國大部分彩葉樹種都引自國外，如金葉女貞、紅葉石楠等。我國北方地區以北京、大連引入和應用的彩葉植物種類較多。但在遼寧以北的地區，可應用的彩葉木本植物種類則迅速減少。中華金葉榆是由河北省林業科學研究院、石家莊市綠緣達園林工程有限公司培育的彩葉植物新品種。於2004年6月26日通過了河北省科技成果鑑定。成果總體水平為國際先進，2004年11月通過了河北省林木良種認定。中華金葉榆是喬灌皆宜的優良彩葉樹種，具有葉片金黃豔麗，樹冠豐滿，高度抗寒冷、乾旱等特點，是我國自主培育成功的彩葉植物新品種。中華金葉榆生長迅速，枝條密集，耐強度修剪，造型豐富，既可培育為喬木，作為園林風景樹，又可培育成灌木，廣泛應用於綠籬、色帶。中華金葉榆根系發達，耐貧瘠，水土保持能力強，除用於城市綠化外，還可大量應用於山體景觀綠化中，營造景觀生態林和水土保持林。中華金葉榆是我國鄉土樹種白榆的變種，對寒冷、乾旱氣候具有極強的適應性。在我國廣大的東北、西北地區生長良好，同時有較強的抗鹽鹼性，在沿海地區可廣泛應用。其生長區域北至黑龍江、內蒙古，東至長江以北的江淮平原，西至甘肅、青海、新疆，南至江蘇、湖北等省，在我國園林中應用範圍較廣。
[0003]在金葉榆應用過程中，我們發現其樹冠內部和下部葉色偏綠，背光面葉色鮮黃度差，車行道旁的金葉榆整個樹冠葉色不均勻，有些環境中其葉片呈現出不同程度的「返祖現象」，從而降低了其觀賞價值。產生這些現象的機理目前還不清楚，應採取如何措施、其品種的遺傳穩定性及其葉色對環境因素的響應機制等有待進一步的研究。
[0004]cDNA-SRAP是2001年Li和Quiros提出的一種基於PCR的新型分子標記相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)技術，研究還表明 SRAP 也能應用於cDNA差異表達分析。
[0005]cDNA-SRAP的關鍵技術在其引物的設計。研究表面外顯子處於GC含量較高的區域，內含子和其它調控序列處於AT含量較高的區域，根據該基因組基因分布特點，Li和Quiros開發出SRAP標記方法,該標記方法使用兩條基於GC含量聞的外顯子區域和AT含量高的內含子及調控區域的隨機引物對基因組進行擴增，從而產生基於序列變異和基於內含子長度變化的顯性和共顯性標記，值得一提的是，SRAP產生的共顯性標記的效率遠大於其它標記技術(例如AFLP)，而共顯性標記有助於分子標記輔助育種。另外一個顯著特點是cDNA-SRAP產生的差異片段大多和性狀有關，可以看成是潛在的功能基因。cDNA-SRAP是一種無需任何序列信息即可進行差異表達研究的新技術，該技術使用一條結合在外顯子區的固定引物和一條結合在內含子、調控區及間隔區對模板cDNA進行擴增，研究表明一般外顯子處於富含GC的區域染色體中，這樣用CCGG序列就有可能特異擴增出包含這些組分的序列。
[0006]cDNA-SRAP技術開發以來，目前已經在水稻、甘藍、甜瓜等植物上得到應用。Li等利用SRAP技術對花椰菜與花莖甘藍的雜交雙二倍體的mRNA進行反轉錄後進行擴增，用48對引物組合標記88個cDNA樣品，得到281個多態性條帶。盧泳全等應用SRAP技術對大米草的耐鹽性狀進行差異顯示研究，鑑定出一個與水稻的β -1,3-葡聚糖酶基因有30%相似性的差異片段。馬愛芬等選用培育7年的重組自交系群體(RILs)，利用cDNA-SRAP法進行了差異顯示研究，996對SRAP引物組合擴增出2100條帶，2次擴增重複率為65.2%，其中在黃黑籽材料之間重複穩定出現的差異片段有12條，發現2個片段分別與擬南芥的NAD+ADP核糖轉移酶及小肽轉移蛋白3具有很高的同源性。但還沒有cDNA-SRAP技術在篩選分析在葉色差異表達基因方面應用。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於提供一種中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法及應用。
[0008]本發明中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法，按以下步驟進行:
[0009]一、中華金葉榆不同葉色葉片採集和葉色標定:
[0010]選擇10株樹齡相同且健康的中華金葉榆植株，分別標號為I~10，葉色標定採用國際色彩標準色板比對，選取相同色值的健康幼嫩葉片，從每株上採集#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片，立即密封低溫保存；
[0011]二、分別提取每株中華金葉榆植株上#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片的總RNA ；
[0012]三、RNA濃度檢測:
[0013]採用微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度，用無RNase的ddH20平衡樣本間的RNA使其濃度相同，均為50ng/l.! 1，取等量的I~10株的#FFD700金色葉片的RNA構建金色葉片RNA混合池，取等量的I~10株的#228B22森林綠色葉片的RNA構建綠色葉片RNA混合池；
[0014]四、cDNA-SRAP擴增差異片段:
[0015]a、第一鏈cDNA的合成:採用M-MLV逆轉錄酶，分別將金色葉片RNA混合池和綠色葉片RNA混合池中的RNA反轉錄成cDNA，產物用無菌ddH20稀釋5倍，於一 20°C保存備用；
[0016]b、cDNA的SRAP擴增、PCR產物電泳及檢測:
[0017]用25個上遊引物和25個下遊引物進行隨機組合，對2個cDNA混合池進行PCR擴增； [0018]PCR 反應體系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2ISnmoir1I μ L，上遊引物 Snmoir1I μ L，下遊引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一鏈 cDNA 稀釋產物I μ L，加水至12yL;
[0019]PCR 擴增條件為:94°C 預變性 5min，94°C lmin-35 °C lmin-72 °C lmin5 個循環，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 個循環，72°C延伸 lOmin，4°C終止反應。
[0020]從隨機組合的100對引物的PCR反應結果選擇差異條帶進行克隆；
[0021]五、差異片段的回收、測序和分析。
[0022]利用上述SRAP分子標記方法進行中華金葉榆葉色差異基因研究。
[0023]本發明的有益效果:
[0024](I)本發明利用國際色彩標準色板比對金葉榆葉色，能有有效避免誤差，實現色彩的標準化，為篩選出來的葉色相關基因更有說服力。
[0025](2)採用本發明採用一套植物材料的不同顏色葉片構建成同一色系的混合池，該混合池除了葉色顏色性狀不同，其餘性狀完全相同，能夠有效的排出其他性狀差異幹擾，保證結果的準確性。
[0026](3)本發明具有操作簡單、結果準確、直觀實用等特點，可以促進cDNA-SRAP技術在葉色相關性狀分析上準確、快速、簡便地應用，同時應用該篩選方法，對分析葉色相關基因，發現新基因具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為實施例2中華金葉榆兩種葉色的擴增結果【具體實施方式】 [0028]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0029]實施例1:中華金葉榆葉色性狀相關SRAP分子標記引物篩選
[0030]本實施例所用的中華金葉榆為商業途徑購買得到。
[0031]一、中華金葉榆不同葉色葉片採集和葉色標定:
[0032]選擇10株樹齡相同且健康的中華金葉榆植株，分別標號為I~10，葉色標定採用國際色彩標準色板比對，選取相同色值的健康幼嫩葉片，從每株上採集#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片，立即密封低溫保存；
[0033]二、分別提取每株中華金葉榆植株上#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片的總RNA，總RNA的提取方法採用改良Trizol法，具體方法如下:
[0034]A、取0.2g中華金葉榆葉片，去掉葉柄和中脈，在液氮中研磨，加入1ml Trizol後勻漿；
[0035]B、勻眾後室溫靜置5min,於12000轉/min、4°C離心5min ；
[0036]C、將上清液轉移至1.5ml離心管中，加入氯仿，氯仿的體積為上清液體積的1/5，震蕩混勻，室溫靜置15min ；
[0037]D、於12000轉/min、4°C離心15min，將上清轉移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置IOmin ；
[0038]E、於12000轉/min、4°C離心10min，向沉澱中加入1ml的體積濃度75%的乙醇溶液洗漆沉澱，於12000轉/min、4°C離心5min ；
[0039]F、棄上清，保留沉澱，乾燥，溶解於30~50 μ I的DEPC處理水中；
[0040]三、RNA濃度檢測:
[0041]採用微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度，用無RNase的ddH20平衡樣本間的RNA使其濃度相同，均為50ng/l.! 1，取等量的I~10株的#FFD700金色葉片的RNA構建金色葉片RNA混合池，取等量的I~10株的#228B22森林綠色葉片的RNA構建綠色葉片RNA混合池；
[0042]四、cDNA-SRAP擴增差異片段:
[0043]1、第一鏈cDNA的合成:採用M-MLV逆轉錄酶(按照M-MLV逆轉錄酶說明書進行操作)，分別將金色葉片RNA混合池和綠色葉片RNA混合池中的RNA反轉錄成cDNA，產物用無菌ddH20稀釋5倍，於一 20°C保存備用；
[0044]2、cDNA的SRAP擴增、PCR產物電泳及檢測:
[0045]用表1中的25個上遊引物和25個下遊引物進行隨機組合，對2個cDNA混合池進行PCR擴增。
[0046]PCR 反應體系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2ISnmoir1I μ L，上遊引物 Snmoir1I μ L，下遊引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一鏈 cDNA 稀釋產物I μ L，加水至12yL;
[0047]PCR 擴增條件為:94°C 預變性 5min，94°C lmin-35 °C lmin-72 °C lmin5 個循環，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 個循環，72°C延伸 lOmin，4°C終止反應。
[0048]從隨機組合的100對引物的PCR反應結果選擇差異條帶進行克隆。
[0049]表1
[0050]
【權利要求】
1.中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法，其特徵在於該方法按以下步驟進行: 一、中華金葉榆不同葉色葉片採集和葉色標定: 選擇10株樹齡相同且健康的中華金葉榆植株，分別標號為1~10，葉色標定採用國際色彩標準色板比對，選取相同色值的健康幼嫩葉片，從每株上採集#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片，立即密封低溫保存； 二、分別提取每株中華金葉榆植株上#FFD700金色葉片和#228B22森林綠色葉片的總RNA ； 三、RNA濃度檢測: 採用微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度，用無RNase的ddH20平衡樣本間的RNA使其濃度相同，均為50ng/y 1，取等量的I~10株的#FFD700金色葉片的RNA構建金色葉片RNA混合池，取等量的1~10株的#228B22森林綠色葉片的RNA構建綠色葉片RNA混合池； 四、cDNA-SRAP擴增差異片段: a、第一鏈cDNA的合成:採用M-MLV逆轉錄酶，分別將金色葉片RNA混合池和綠色葉片RNA混合池中的RNA反轉錄成cDNA，產物用無菌ddH20稀釋5倍，於一 20°C保存備用； b、cDNA的SRAP擴增、PCR產物電泳及檢測: 用25個上遊引物和25個下遊引物進行隨機組合，對2個cDNA混合池進行PCR擴增；PCR 反應體系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2Mnmoir1I μ L,上遊引物 Snmoir1I μ L，下遊引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一鏈 cDNA 稀釋產物1 μ L,加水至12 μ L ; PCR 擴增條件為:94 V 預變性 5min，94 V lmin-35 V lmin-72 V lmin5 個循環，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 個循環，72°C延伸 lOmin，4°C終止反應。 從隨機組合的100對引物的PCR反應結果選擇差異條帶進行克隆； 五、差異片段的回收、測序和分析； 步驟四所述25個上遊引物和25個下遊引物序列如下:
2.根據權利要求1所述的中華金葉榆葉色性狀相關的SRAP分子標記方法，其特徵在於步驟二中總RNA的提取方法採用改良Trizol法，具體方法如下:A、取0.2g中華金葉榆葉片,去掉葉柄和中脈,在液氮中研磨,加入1ml Trizol後勻眾； B、勻漿後室溫靜置5min，於12000轉/min、4°C離心5min； C、將上清液轉移至1.5ml離心管中，加入氯仿，氯仿的體積為上清液體積的1/5，震蕩混勻，室溫靜置15min ； D、於12000轉/min、4°C離心15min,將上清轉移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置IOmin ；E、於12000轉/min、4°C離心10min，向沉澱中加入1ml的體積濃度75%的乙醇溶液洗漆沉澱，於12000轉/min、4°C離心5min ； F、棄上清，保留沉澱，乾燥，溶解於30~50 μ I的DEPC處理水中。
3.利用權利要求1所述SRAP分子標記方法進行中華金葉榆葉色差異基因研究。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993098SQ201410261198
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】王云云, 張興, 高宇, 孫力, 肖宇, 關向軍 申請人:黑龍江省科學院大慶分院