促胰液素受體配體在治療囊性纖維化(cf)及慢性阻塞性肺病(copd)中的用途的製作方法
2023-05-17 21:55:31
專利名稱：促胰液素受體配體在治療囊性纖維化(cf)及慢性阻塞性肺病(copd)中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用或通過激活激素促胰液素或其它促胰液素受體配體而治療囊性纖維化(CF)及慢性阻塞性肺病(COPD)。
背景技術：
囊性纖維化囊性纖維化(CF)是一種非常常見的，致命的，常染色體隱性遺傳疾病，目前僅英國就有超過7000人被診斷患有這種疾病，而美國大約有30,000人。CF的發病率主要取決於人種。北歐的白種人患這種疾病的危險性最大，基於大約1/25的雜合載體率，他們患病的概率大約為1/2500。
CF是由於遍及身體的囊性纖維化跨膜調節劑(CFTR)氯離子通道基因的基因突變而產生的。CFTR中的這種突變可導致蛋白的錯誤摺疊和/或轉錄蛋白從內質網到上皮質膜遷移的缺乏及隨後氯離子(Cl-)通道功能的損耗。這可引起細胞和腔內的流體和電解質轉運及CF肺下呼吸道容積的不平衡，其分解粘液的構造，依次損害粘液纖毛清除並引發CF患者肺部不可避免且持續的細菌感染。不同突變可引起不同嚴重程度的CF症狀並相應導致患者存活率的改變。
幾十年來，改進的藥物和物理療法已經顯著提高了患者的存活時間，儘管平均預期壽命仍然比較短，目前大約為30歲。因此仍然需要繼續研究治療這種疾病的更好方法。
COPD的臨床特徵包括氣喘，咳嗽和喀痰，並伴有慢性氣道阻塞及肺過度膨脹，這是由慢性支氣管炎和肺氣腫(遠端肺空間擴張)引發的。在支氣管哮喘中較為顯著的慢性支氣管過度興奮也是在COPD中發現的。COPD中的氣道重塑可導致持續不可逆的氣道變窄及粘液的過度分泌。氣道變窄和高反應性的直接原因還未可知，雖然通常認為氣道平滑肌功能的異常可導致鬆弛性的降低或減小及收縮性的增加。
與緩釋口服茶鹼及吸入的β2激動劑(例如，異丙阿託品，沙丁醇胺，沙美特羅)聯合使用的支氣管擴張藥療法，及高劑量吸入的類固醇代表了目前在COPD治療中使用的療法，這是由於即便是阻塞的適度改善對於COPD患者也是有益的。β2激動劑可通過刺激與特異性G-蛋白GS偶聯的特異性受體而介導氣道的支氣管擴張，其依次使第二信使cAMP的細胞內水平增加。
最近，Cl-的移動已經被證實與上皮依賴性氣道鬆弛有關(Fortner等，2001)，阻斷Cl-離子分泌可導致激動劑誘導的鬆弛的顯著減少。此外，化合物如呋塞米，一種Cl-依賴性Na+/K+/2Cl-協同-轉運抑制劑已經在某些研究中被證實可減少氣喘時支氣管的高反應性(Pendino等，1998)。此外，粘液分泌過多和氣管支氣管粘液的非-連續性清除也可導致持續的氣流阻塞，其可與氣道的高反應性同時存在。粘液堵塞可導致小氣道(例如，三級支氣管)阻塞，從而使最大呼吸氣流減小，肺排空的推動緩慢。
促胰液素促胰液素是一種肽激素，它是從近端小腸(特別是十二直腸和空腸)中的S細胞分泌的，並對離胃的酸性內含物有反應。相當長時間以來，豬促胰液素的結構已經為人們所知，並已經將它從豬腸中分離出來，且已經發現它是由27個胺基酸殘基組成的肽構成的(Mutt等，1970)。此外，人們已經發現牛和豬促胰液素是相同的，並與犬促胰液素相似。
雖然牛和豬促胰液素與人促胰液素的表現在某些方面相同，但它們在結構上不同。這些動物促胰液素與人促胰液素在第15和16位不同。人，豬和牛促胰液素的序列對比在圖1中表示。
促胰液素的生理作用是刺激水(H2O)和碳酸氫鹽(HCO3-)從胰腺分泌，中和酸性食糜。它的作用是由7個跨膜結構域介導的，G蛋白偶聯受體(GPCR)，其是結構上與GPCRs超家族有關的高血糖素-促胰液素-血管活性腸肽的一員，(IUPHAR Receptor Compendium，1998)，該肽顯示出毫微摩爾的親和性。促胰液素受體的刺激可介導細胞內cAMP的增加，及蛋白激酶A(PKA)的激活。
促胰液素目前已經被FDA批准用於診斷胃泌素瘤及評估胰腺功能。促胰液素在小兒孤獨症中的應用表明它可改善與孤獨症，即一種交流，社會技能和發展嚴重受損的疾病有關的生理和行為症狀(見，例如WO98/52593，US-A-6,020,310或US-A-6,020,314)。2000年3月，RepligenCorporation(USA)宣布他們已經使用促胰液素對患有孤獨症的兒童開始進行II期臨床試驗，進行II期臨床試驗的地點包括Mayo Clinic，theUniversity of Rochester Medical Center和the Southwest Autism ResearchCenter及Phoenix Children’s Hospital。這些試驗的初步結果表明，促胰液素的輸注對於患有嚴重孤獨症兒童的離散組是有益的。
有人已經提出促胰液素還可預防吸入性肺炎症候群(例如，EP0150760；AU3806485)。
已經報導過許多合成和/或天然存在的促胰液素肽類似物及片段(此處被稱作「促胰液素受體配體」)，它們對促胰液素受體顯示出廣泛的效能，功效和選擇性。這些包括，但不限制於單/多取代的促胰液素類似物，促胰液素片段，取代的促胰液素片段，還原肽鍵的類似物(Gardner等，1976；Gardner等，1979；Waelbroeck等，1981；Konig等，1984；Staun-Olsen等，1986；Robbertecht等，1988；Haffer等，1991)，和VIP/促胰液素家族天然存在及合成的類似物，片段和嵌合肽(包括VIP(血管活性腸肽)，腸抑胃肽(GIP)，PACAP(可激活垂體腺苷酸環化酶的多肽)，adrenomedullin，降鈣素，CGRP(α，β和皮膚降鈣素基因相關肽)，胰高血糖素，胰高血糖素樣多肽(GLP)，生長激素釋放因子，甲狀旁腺激素(PTH)及其相關蛋白(PTHrP)，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)和糊精。這些肽中的大多數(包括胰高血糖素，GLP，PACAP和VIP)與促胰液素共同具有有效的胺基酸同源物，特別是在氨基末端。所有這些肽可接受相似的二級結構特徵，包括兩親α-螺旋狀二級結構的一個或兩個區，且可以較保守的方式與它們的受體相互作用(Sexton，1999)。
促胰液素-相關受體肽，及其類似物和片段也是已知的，它們對促胰液素受體顯示出親和性。
發明內容
我們已經研究了促胰液素受體在CF和COPD患者組織中的表達水平。我們發現，無論是在正常個體還是患有這些疾病的患者中，促胰液素受體均是在肺遠端區，特別是在三級支氣管和實質中表達的，在肺近端區中只有很少的或沒有可測量的mRNA表達。先前沒有報導過促胰液素受體在這些組織中的表達。
此外，我們驚奇地發現在CF患者三級支氣管中，促胰液素受體mRNA的水平顯著升高。這種升高對CF是特異性的，且不與患有其它肺病的患者共有。這種升高對於三級支氣管組織是特異性的。
我們不希望受任何一種特定理論的束縛，我們相信促胰液素對細胞中離子移動的作用(見下面)可抵消與CF有關的CTFR缺乏的作用。此外，雖然本發明的實踐不依賴於任何一種特定的理論，但對三級支氣管組織中促胰液素受體mRNA水平升高的解釋是，這是對這些細胞中離子不平衡的反應。
此外，人們逐漸認識到，對於COPD患者而言，患者肺中離子流出的作用可能是治療幹預的一個重要目標。所述促胰液素受體與G-蛋白GS偶聯，並因此推測功能性促胰液素受體的激活可導致細胞內cAMP的積聚，及隨後的支氣管擴張，其中所述功能性促胰液素受體是在排列於人遠端支氣管的上皮細胞上鑑定的(還可見Ng等，1999)。此外，在其它粘液分泌過多的肺病，如囊性纖維化和COPD中，Cl-流出的顯著減少可改變水及離子的組成和隨後粘液的粘度及粘液的分泌，產生稠而無味的粘液，其可損害肺的粘液纖毛清除。因此在這種患者中，刺激離子移動對於其疾病的治療是有益的。
因此，本發明提供一種治療CF患者囊性纖維化的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子的流出。
本發明還提供一種治療COPD患者COPD的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子的流出。
就其中一方面而言，本發明是以發明人的意外發現為基礎的，即CF患者三級支氣管中促胰液素受體的mRNA水平升高，且本發明涉及促胰液素在囊性纖維化治療中的新用途。本發明的優選方面涉及通過給予患者促胰液素受體配體來治療CF。然而，本發明人已經預期除了直接給予促胰液素受體配體外，還可通過其它方式給予患者有效量的促胰液素。給予促胰液素的其中一個選擇性方法是使用可刺激肺細胞中內源性促胰液素，或促胰液素相關肽產生或釋放的正向調節的藥劑。
本發明還提供了可通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子流出的藥劑在製備治療囊性纖維化的藥物中的用途。
此外，本發明還提供了可通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子流出的藥劑在製備治療COPD的藥物中的用途。
優選所述藥劑是一種促胰液素受體配體，更特別是促胰液素，特別是人促胰液素。
圖1表示人，豬和犬促胰液素的序列對比。
圖2表示對照組和CF肺區中促胰液素受體mRNA的不同表達。
圖3表示對照組和CF肺區中GAPDH的mRNA表達。
圖4表示在來源於16個對照組供體和25個CF組織供體的對照組和CF肺區中，促胰液素受體mRNA的不同表達。
圖5表示在非-CF三級支氣管中，促胰液素刺激離子移動。
圖6表示在來源於非-CF供體的原始人三級支氣管上皮細胞的融合單層中，促胰液素刺激非-CTFR依賴性的離子移動。
圖7表示促胰液素刺激人CF三級支氣管中離子的移動。
圖8表示促胰液素對來源於非CF供體的原始人三級支氣管上皮細胞中氯離子流出的作用。
圖9表示CF患者的三級支氣管和肺實質中，NeuroD mRNA的水平。
具體實施例方式
通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子流出的藥劑促胰液素受體可通過很多機理而被激活。例如，已經廣泛報導過促胰液素的表達被限制在小腸和結腸內分泌細胞中的S-型腸內分泌細胞及產生發育胰腺的β細胞的胰島素中。腸內分泌細胞和胰島均來自原始的胚胎腸內胚層。此外，一級氣道是通過被稱作分支形態發生的過程形成的，由此，2個腹側的肺芽從排列在胚胎前腸內胚層底部的上皮抽芽。氣道的形成是由兩個肺芽的生長和反覆分枝而進行的。肺神經內分泌(PNE)細胞位於第一細胞之中，從而與原始肺上皮區別，且通常，其在胎兒和新生兒肺中的含量最豐富。已知這些細胞可表達許多肽，包括降鈣素，降鈣素基因相關肽，血清素和內皮縮血管肽，且可通過它們對這些肽或一般的內分泌物標記物如突觸小泡蛋白，嗜鉻粒蛋白及蛋白基因產物9.5的免疫反應性而被目測檢驗。在CF支氣管中，已經證實了內分泌細胞內降鈣素免疫反應性的增加(Wolf等，1986)。
我們已經發現，與非-CF肺相比，在CF三級支氣管部分中，嗜鉻粒蛋白A的免疫反應性增加，表明CF肺中的孤立內分泌細胞數增加。人們預期CF肺三級支氣管內，內分泌細胞表達的增加與所存在的內分泌肽，包括促胰液素的增加有關。同樣，直接或間接刺激內分泌細胞從而在肺內局部釋放促胰液素(和/或促胰液素釋放肽或對促胰液素受體顯示出親和性的肽)代表了一種選擇性的，用外源性促胰液素刺激促胰液素受體，或類似的並為CF提供治療有益之處的方法。
此外，促胰液素基因還可通過提供藥劑而正向調節，所述藥劑可通過啟動子或增強子的調節而提高基因轉錄的水平。促胰液素基因的增強子區含有被稱為E框的順式作用DNA共有序列(CAGCTG)，其結合屬於轉錄因子的鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的蛋白。已經證實了被稱為BETA2/NeuroD的bHLH蛋白可導致促胰液素基因轉錄的組織-特異性調節(Mutoh等，1997)。在剔除小鼠中，BETA2/NeuroD缺陷小鼠不能發育腸內分泌細胞或胰β細胞，從而證實了這種轉錄因子在源於腸內胚層的多種特異性細胞類型的正常發育中起著重要的作用。β2/NeuroD的表達已經被證實僅僅位於轉基因小鼠的內分泌細胞中(Rhindi等，1999)。
此外，內源性促胰液素產生的正向調節還可通過本領域已知的各種其它方法獲得(例如，見Jiang等，2001；Yang等，1998；Morse等，2001；Lewis等，1997；WestRodman，2001；AltonKitson，2000)，這些方法包括但不限制於基因療法(在病毒或非病毒載體中遞送DNA或RNA，其中所述載體編碼能夠直接或間接刺激促胰液素受體或其細胞信號途徑的肽)，基因尋靶(遞送藥劑，其中該藥劑針對編碼促胰液素或相關肽的基因啟動子區上的調節序列或轉錄因子結合位點，由此產生能夠直接或間接刺激促胰液素受體的促胰液素或相關肽)。
已知的可刺激促胰液素釋放的多種機理，包括下列藥劑如二丁醯環狀-3』，5』-腺苷一磷酸，福斯高林，4β-12-O-十四醯佛波醇-13-醋酸鹽，合成的絲氨酸蛋白酶抑制劑，卡莫司他，和鈣離子載體，A2318，其刺激Ca2+和環狀-3』，5』-腺苷一磷酸-依賴性促胰液素的釋放(Xue等，1993)；胰磷脂酶A2(PLA2)，其已經被證實本質上具有釋放促胰液素的活性，而不依賴於它的消化酶活性(Chang等，1999)；神經肽鈴蟾肽，胃泌素釋放肽，VIP和神經節肽已經顯示出可調節產生促胰液素的細胞中促胰液素的釋放(Chang等，1998)；和長鏈脂肪酸，如油酸鈉是從內分泌細胞釋放促胰液素的有效刺激劑。它們的刺激作用是由內源性蛋白激酶A加強的，並由通過L-型通道流入的Ca2+和蛋白激酶C及Ca2+/鈣調蛋白-依賴性蛋白激酶II的激活而介導(Chang等，2000)。
此外，受體活性修飾蛋白，或RAMP是新的單一跨膜結構域蛋白，其可調節促胰液素受體GPCR家族中至少兩個成員的表達和/或活性。迄今為止，存在3個RAMP同種型，1-3，它們的相互作用很可能導致受體到細胞表面的運輸，改變受體糖基化的程度，和/或提供與細胞表面受體有關的配體結合位點(Sexton，1999)。
RAMPS可間接改變肽對促胰液素GPCR家族特異性受體的選擇性。例如，有關PTH1受體的單點突變對此受體產生促胰液素反應性，而回復突變對促胰液素受體產生PTH反應性的研究(Turner等，1996)已經暗示了，這可能是由於與受體相互作用的特異性RAMP的改變(Sexton；1999)。
同樣，促胰液素受體的激動(agonism)可通過促胰液素受體家族的肽類似物或片段及特異性RAMP的同時或順序應用而介導。
其中的促胰液素受體被激活的呼吸組織特別包括選自三級支氣管和肺實質的肺遠端區內的組織。
促胰液素受體配體如上所述，優選的促胰液素受體配體是人促胰液素(hSN)。然而，也可使用其它哺乳動物的促胰液素，如緊密相關的牛，豬的促胰液素，或犬，齧齒動物，小雞和兔子的促胰液素(其顯示出與人促胰液素不同程度的同源性)，及其它天然存在或合成的促胰液素片段或類似物，如此處鑑定的那些。
各種其它的促胰液素受體配體在本領域中也是熟知的。這種配體多數是以天然促胰液素(例如，人或豬促胰液素)序列為基礎的，但包含1-7(通常為1-5，常常是1，2或3)個胺基酸取代或缺失，特別但不僅僅在N-末端區。
例如，Gespach等(1986)描述了4種合成的促胰液素類似物，包括與豬促胰液素相似，但N-末端被血管活性腸肽(VIP)的序列部分取代的，即Ala4-Val5-pSN，和Tyr1-Ala2-Glu3-pSN，Gln3-pSN，Phe1-Phe2-Trp3-Lys4-pSN。Konig等(1977)描述了Ala4-pSN。Gardener等(1976)描述了促胰液素片段SN5-27及其3個變體，(9Gln-SN5-27，15Asn-SN5-27和9Gln-15Asn-SN5-27)。15-Lys-SN也已經在現有技術中描述(Gardener等，1979)。Haffer等(1991)描述了八種促胰液素變體，而八個N-末端肽鍵中有一個具有還原肽鍵(用-CH2-HN-替換-CONH-鍵)。Robberecht等(1988)描述了促胰液素片段2-27，3-27，5-27和7-27及所觀察到的促胰液素受體的活性。Konig等(1986)把促胰液素N-末端的5個胺基酸換成人生長激素釋放因子N-末端的五肽序列，從而產生1-Tyr-2，4-二Ala-5-Ile-SN，其顯示出促胰液素活性。構造的其它活性變體是3-L-半胱氨酸-SN，6-D-Phe-SN，5-Allo-Thr-SN，和1-Cys-6-Cys-SN。
對促胰液素受體顯示親和性的促胰液素類似物的其它例子包括，[Ala4，Val5]和[D-Ala4，Val5]促胰液素，(D-Ala4)促胰液素；(D-Phe6)促胰液素；促胰液素5-27，促胰液素14-27[Val5]促胰液素，[D-Ala4，Val5]促胰液素(Waelbroeck等，1981)；取代片段如[Gln9，Asn15]促胰液素(5-27)(Staun-Olsen等，1986)；含酚基的豬促胰液素類似物，包括Nalpha-酪氨醯促胰液素，[Tyr1]促胰液素，和Nalpha-β-(4-羥苯基)丙醯促胰液素(Yanaihara等，1977)；促胰液素的羧基-末端二十三肽類似物(S5-27)(9-Gln-S5-27，15-Asn-S5-27)，和9-Gln-15-Asn-S5-27)(Gardner等，1976)。
血管活性腸肽(VIP)，PACAP，胰高血糖素，胰高血糖素樣多肽及其天然存在和合成的類似物及其片段，可顯示出與促胰液素顯著的同源性。這些的例子包括但不限制於，(D-Ala4)VIP；(D-Phe4)VIP；(D-Phe2)VIP，VIP的脂肪醯基衍生物，包括十四烷基，十六烷基，和十八醯基-[Nle17]VIP(Gourlet等，1998)，VIP 2-28；VIP 1-14；VIP 2-14；VIP14-28；VIP 15-28；VIP 20-28；VIP 21-28，N-末端的VIP1-6或VIP1-9已經與C-末端的VIP20-28或VIP21-28共價連接的兩個序列(Couvineau等，1984)；VIP7-27，VIP11-28，VIP1-22-NH2，VIP16-28(Staun-Olsen等，1986)，VIP[10-28]和VIP[16-28]。促胰液素和VIP的類似物，其被稱作vasectrins，已經由Beyerman等於1981年描述。PACAP(1-27；1-38)及類似物的例子包括PACAP(1-23，VIP-24-28)，PACAP(1-24，Cys-25)，PACAP(1-23)，PACAP(3-27)，PACAP(1-19)，PACAP(3-19)，PACAP(1-12)，和PACAP(18-38)(Schmidt等，1993)，胰高血糖素，和GLP-1，它們相關的類似物及片段包括GLP-1(7-37)GLP-1-(1-37)醯胺，-(6-37)醯胺，-(8-37)醯胺，-(7-36)醯胺(Suzuki等，1989)，N-末端1位發生改變的那些，包括N-甲基化-(N-me-GLP-1)，α-甲基化(α-me-GLP-1)，脫醯胺化的-(脫氨-GLP-1)和咪唑-乳-酸取代的GLP-1(imi-GLP-1)。(Gallwitz等，2000)。
在引入此處作為參考的上述文獻中描述的促胰液素受體配體可全部用於本發明中，然而本領域的那些技術人員應認識到上述引證的參考文獻不是窮舉的，也可使用其它促胰液素受體配體。
候選配體的適合性可通過實驗測定。例如，Charlton等(1983)報導了腦室內(intracerebroventricularly)注射的促胰液素可顯著增加大鼠的澄清，減少新的目標近似值，但對定型行為沒有顯著的作用。這種試驗可使用促胰液素受體配體在大鼠中進行，從而測定它對本發明的適合性(即，可選擇通過促胰液素受體的激動顯示相似作用的那些配體)。
促胰液素可從市場上購得(例如，Peninsula Laboratories Inc，USA)，或它及上述配體可參很考容易得到的公開文獻獲得。
本發明的組合物此處所報導的新發現產生了新的組合物，它含有促胰液素受體配體和至少一種具有抗CF或COPD活性的其它化合物。
就CF而言，這種化合物包括粘液溶解劑，如乙醯半胱氨酸，脫氧核糖核酸酶I(dornase)或厄多司坦，及其它抗CF劑，如萘多羅米或布洛芬。
就COPD而言，這種化合物包括支氣管擴張藥如茶鹼，異丙阿託品，β2激動劑，如沙丁胺醇或沙美特羅，或抗炎劑如類固醇。
促胰液素受體配體在這種組合物中的量為，例如，佔活性成分總重量(即，不包括載體或稀釋劑)的1％-99％，例如10％-90％。
在相關方面，本發明提供促胰液素受體配體與第二種具有抗CF或COPD活性的化合物的組合，它們可同時或順序使用，分別用於治療CF或COPD。「同時」是指同時給予兩種化合物，雖然這在同一組合物中不是必須地。「順序」是指在一段時期內給予兩種化合物，這樣當給予兩種化合物中的第二種時，兩種化合物中的第一種在患者體中仍然是活性的。優選「順序」是指在同一24小時內，優選在同一12小時內，如在同一6，3，1，半小時或一刻鐘內。
配製和給藥根據本發明對患者進行的治療可通過給予患者藥物組合物形式的促胰液素受體配體而進行，其中所述藥物組合物可具有或沒有其它活性成分存在(下面提到的組合物被理解為包括兩種類型，雖然僅專門提到促胰液素受體配體)。該組合物還可與非-毒性的，藥學上可接受的載體組合。就此而論，本發明還包括一種治療CF的方法，包括給予所要治療的患者治療有效量的本發明促胰液素受體配體，或本發明的組合物。
在臨床實踐中，由於激素作為一種肽對生物活性環境較敏感，因此本發明的組合物可非腸道給藥。然而也可口服或直腸給藥，例如使用緩釋類型的組合物可使活性成分達到最初的目標位點，即三級支氣管。
促胰液素受體配體還可被配製成適於吸入(例如，通過氣溶膠)，吹入(通過口腔或鼻)，或非腸道(通過除腸之外的途徑引入)給藥的形式。
通過吸入遞送蛋白或肽可使用促胰液素受體配體的液體或固體製劑而完成。因此，本發明預期含有促胰液素受體配體的製劑可用於各種裝置中，該裝置被設計用於遞送藥物組合物及治療製劑到呼吸道。在本發明的其中一個方面中，促胰液素受體的配體是以氣溶膠或吸入形式給藥的。與分散劑聯合使用的促胰液素受體配體可作為乾燥粉末以氣溶膠製劑的形式給藥，或以具有稀釋劑的溶液或混懸液形式給藥。
適宜的分散劑在本領域中是熟知的，其包括但不限制於表面活性劑等。本領域通常所用的表面活性劑可用於減少表面產生的蛋白聚集，而表面產生的蛋白聚集是由形成液體氣溶膠的溶液的霧化引起的。這種表面活性劑的例子包括聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，及聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯。所用表面活性劑的量通常大約佔製劑重量的0.001％-4％。在特定的方面，所述表面活性劑是聚氧化乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯或脫水山梨糖醇三油酸酯。
所述液體氣溶膠製劑在生理可接受的稀釋劑中含有促胰液素受體配體和分散劑。本發明乾燥粉末狀的氣溶膠製劑包括微細分裂固體形式的促胰液素受體配體和分散劑，及選擇性的膨脹劑，如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇等，從而促進粉末分散。無論是液體還是乾燥粉末狀的氣溶膠製劑，所述製劑必須被霧化。也就是說，必須將它破碎成液體或固體顆粒，從而確保霧化劑量能夠按照所希望的，確實到達支氣管和/或肺泡。通常，質量中值動態直徑為5微米(μm)或更小，從而確保藥物顆粒到達肺支氣管或肺泡(Wearley等，1991)。
關於遞送裝置的結構，本領域已知的任何形式的霧化作用，包括，但不限制於液體製劑的噴霧，霧化或泵送霧化，及乾燥粉末製劑的霧化，均可用於本發明的實踐中。人們預期了一種獨特設計的，用於給予固體製劑的遞送裝置。通常，液體或乾燥粉末製劑的霧化作用需要推進劑。所述推進劑可以是本領域通常所用的任何一種推進劑。有效推進劑的例子包括氯氟烴，氫氟烴，氫氯氟烴和烴，包括三氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷及其組合。
在本發明的優選方面，用於霧化的裝置是一種計量給藥吸入器。給藥時，計量給藥吸入器可提供具體劑量，並可根據給藥提供可變劑量。這種計量給藥吸入器可使用液體或乾燥粉末形式的氣溶膠製劑。
氣溶膠遞送系統，如加壓的計量給藥吸入器和乾燥粉末吸入器在Newman，Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.和Davia，D.編輯，第197-22頁中公開，並可與本發明結合使用。
還可使用其它製藥方法控制本發明拮抗劑作用的持續時間。所述拮抗劑還可利用界面聚合凝聚技術而被包裹在所製備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸鹽)微膠囊)中，包裹在膠態藥物遞送系統(例如，脂質體，白蛋白，微球體，微乳，毫微顆粒和毫微膠囊)中，或包裹在粗乳狀液中。這種技術在Remington’sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.，ed(1980)中公開。
對於鼻內給藥而言，所述促胰液素受體配體還可被配製成通過適宜的計量或單位裝置給藥的溶液，或選擇性地被配製成使用適當遞送裝置，與適宜載體混合的粉末。選擇性地，促胰液素受體配體還可以類似方式透鼻遞送。例如，用於透鼻給藥的促胰液素製劑已經在JP60123426中描述。
用於非腸道給藥的製劑包括無菌的含水或非水溶液，混懸液或乳液。非水溶劑或懸浮介質的例子是丙二醇，植物油，如橄欖油，及可注射的有機酯，如油酸乙酯。這些組合物還可含有助劑，如防腐劑，溼潤劑，乳化劑和分散劑。它們可以是滅菌的，例如，通過留存細菌的過濾器過濾滅菌，通過在組合物中摻入滅菌劑滅菌，通過加熱輻照滅菌。它們還可被製備成無菌固體組合物的形式，其可在使用前被立即溶解在無菌的可注射介質中。且作為更慣常使用的靜脈內和肌肉內途徑，所述組合物還可通過關節內注射而給藥。
本發明組合物中活性成分的百分比可發生改變，只要它們組成一定的比例，從而獲得所期望的，適宜劑量對胰腺的刺激作用。很明顯，各種單位劑量形式大約可同時給藥。通常，所述組合物應當含有大約0.1％-80％重量的活性成分。
所用劑量取決於所期望的刺激效果，給藥途徑和治療持續時間。對於人類患者而言，典型劑量為10-8-10-3mg/天，優選10-6-10-4mg/天。所述促胰液素受體配體可每天給藥或，根據醫師的要求減少，例如，每周給藥，或直到獲得所期望的治療效果。
下列實施例舉例說明本發明。
實施例1RNA的表達輪廓檢測促胰液素受體信使RNA的表達輪廓(蛋白登記號P47872；核苷酸登記號U28281)。總RNA是使用TriZolTM，一種市售的酚和胍異硫氰酸鹽溶液，按照製造商(Life Technologies)所述的方法，從5個對照組供體和5個CF供體的三級/四級支氣管和肺實質中分離出來的。只要利用凝膠電泳檢測完整的18s和28s核糖體RNA，且如果所形成的基因組DNA少於總核酸樣品的10％，那麼就可使用RNA樣品。總RNA樣品被退火成引物探針序列和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH；登記號P04406)引物，且其是使用MuLV逆轉錄酶逆轉錄的。定量序列檢測是在所得的cDNA上進行的。
申請人已經研究過使用ABI稜柱狀7700序列檢測系統(PerkinElmer)定量分析mRNA表達的方案。所述系統的詳細描述在WO00/05409中提出。簡言之，在PCR過程中，所述系統使用螢光探針產生序列特異性螢光信號。所述探針是具有螢光報導分子和猝滅劑染料的寡核苷酸。當探針完整時，報導因子螢光的強度可被猝滅劑抑制。在PCR過程中，當探針形成複製複合體的一部分時，所述猝滅劑是從導致螢光增強的報導分子染料中分離出來的，然後通過ABI 7700序列檢測器檢測。ABI7700的熱循環儀中具有一個構件(built)，和一個經由雙向纖維光纜對準96樣品孔中各孔的雷射器。每隔幾秒鐘即收集一次介於520nm-660nm間的，通過光纜發射到檢測器的螢光。系統軟體可分析各組分染料對實驗光譜的影響，並將信號校準成內標準染料。然後繪製這些校準過的『報導分子』的峰值(Rn)對熱循環數的圖，從而得到放大圖-使PCR產品產生的程度形象化。
靶序列(Cn)的起始拷貝數是通過測定分段PCR循環數(Ct)而確定的，其中首先檢測PCR產品-該點的螢光信號超過臨界基準。因此，Ct值越低，Cn越大。各樣品靶mRNA量的量化是通過將實驗Ct值與靶序列的標準曲線進行比較而確定的，其中所述靶序列的標準曲線是在各實驗的過程中繪製的。
引物探針組是為檢測促胰液素受體的mRNA而特別設計的。脫機同源性檢索顯示出與在基因銀行登記的基因序列不明顯匹配。促胰液素受體的正向和反向引物及探針序列如下正向GACCAGCATCATCTGAGAGGCT (SEQ ID NO1)反向CCTTCGCAGGACCTCTCTTG (SEQ ID NO2)探針TCTCTGTCCGTGGGTGACCCTGCT (SEQ ID NO3)GAPDH引物探針組如下正向GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC (SEQ ID NO4)反向CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT (SEQ ID NO5)
探針TTTGGTCGTATTGGGCGCCT (SEQ ID NO6)反應條件是使用基因組DNA作為模板，然後通過探針濃度梯度實驗得到引物探針濃度表格而優化的。選擇能夠產生最有效的基因產物擴增的引物濃度，即，產生較低的臨界循環和相對較高的螢光積聚的那些。然後利用這些最佳引物濃度選擇最佳的探針濃度。
促胰液素受體與呼吸疾病的關聯是通過在三級支氣管和實質中繪製促胰液素受體mRNA表達的輪廓而加以證實的，其中所述三級支氣管和實質來源於5個完全同意的供體，所述供體在病理學和組織學上被診斷為具有下列呼吸疾病不吸菸者對照組，吸菸者，氣喘，囊性纖維化，肺炎，肺氣腫，慢性阻塞性肺病(COPD)。CF肺組織是在經受心臟和肺移植的5名患者完全同意的情況下獲得的。
圖2表示對照組和CF肺區中，促胰液素受體的不同mRNA表達，其表明CF三級支氣管中促胰液素受體的表達增加。數據是由5個對照組和5個囊性纖維組織供體的各肺區中，QRT-PCR臨界循環的平均值±s.e.m.表示的。*p＝0.0246表示源於不成對T-試驗的統計學顯著性。作為對照，圖3表示對照組和CF肺區中GAPDH的mRNA表達。數據是由5個對照組和5個囊性纖維組織供體的各肺區中，QRT-PCR臨界循環的平均值±s.e.m.表示的。在兩組之中和之間，沒有觀察到統計學差異。
促胰液素受體表達的減少是通過將5名COPD供體的肺實質與5名對照組供體進行比較而加以證實的(p＝0.0465)。然而沒有其他供體組顯示出促胰液素受體mRNA表達的差異。
然而在所有情況下，促胰液素受體在肺遠端區組織中的任何水平的表達均是新奇的，且為本發明提供了基礎。
圖4表示利用源於25名CF供體和16名不吸菸對照供體的組織隨後進行的表達研究的結果。數據是由25名CF供體和16名不吸菸供體的各肺區中，QRT-PCR臨界循環的平均值±s.e.m.表示的。**p＝0.009表示得自方差雙向分析的統計學顯著性。所得結果與圖2所得的那些相似，即，與對照組相比，CF三級支氣管中促胰液素受體的表達顯著增加，兩組在實質中的表達水平相似。
實施例1所提供的數據為本發明提供了基礎。即，Cl-從呼吸道細胞到氣道腔流出的減少代表了CF的病因學問題。然而，離子移動和Cl-通道的這種損耗還可減少碳酸氫鹽(HCO3-)自細胞的分泌，並提高鈉離子(Na+)通過上皮，阿米洛利-敏感性Na+通道，到細胞中的重吸收。
健康肺的洗滌物主要由H2O(大約95％)，和維持分泌蛋白，如可溶且惰性的粘液和消化酶的苯巴比妥HCO3-組成。然而，由於細胞內較高的Na+和Cl-濃度，CF氣道的上皮顯示出異常高的表面液體吸收速率，因此患者氣道內的水分含量非常低。這些可導致粘液顯著增稠，及隨後由CF肺的粘液纖毛清除的損害。
HCO3-穿過肺上皮細胞頂膜的移動主要是通過生電Cl-/HCO3-交換器進行的，水通過簡單的滲透擴散或通過促進性轉運機理而穿過親水質膜，其中所述促進性轉運機理是由水通道蛋白(AQP)水通道蛋白家族的成員介導的。目前認為HCO3-和Cl-主要涉及H2O的滲透性移動。
基於促胰液素及其受體對十二指腸和胰腺中的離子調節的生理作用，申請人在本發現的基礎上提出促胰液素受體mRNA及功能性表達的增加可代表人體發展的，病理學應答，從而補償CFTR的缺損。由於促胰液素肽的合成是在十二指腸中進行的，因此肺內的促胰液素受體不與促胰液素肽接觸。不受任何一種特定理論的束縛，我們提出通過藥理學幹預促胰液素受體激動可治療與CF有關的生物化學呼吸問題的全部或一部分(a)通過Cl-通道的cAMP-依賴性激活而刺激Cl-從三級支氣管呼吸細胞的流出。促胰液素受體的刺激或毛喉素-介導的cAMP的增加已經顯示出可通過大鼠胰腺導管細胞的頂膜，刺激大約4pS較小的，單路Cl-選擇性電導(Gray等，1988)。雖然促胰液素已經被證實可刺激CFTR和Cl-穿過非CF人上皮細胞(例如，膽囊)頂膜的流出，所報導的此Cl-電導為6-12pS。因此，Cl-代表了一種選擇性的cAMP-依賴性Cl-電導。
(b)刺激cAMP增加，激活蛋白激酶，引發磷酸化作用，及隨後呼吸細胞中上皮Na+通道或Na+-K+-ATP酶的調節，由此減少Na+重吸收並刺激肺液移動。這種機理已經在伴有cAMP偶聯的β-腎上腺素能受體刺激的大鼠肺泡上皮細胞中被證實(Minakata等，1998)。
(c)隨後腔內Cl-水平的增加可起促胰液素激活的Cl-/HCO3-交換器底物的作用，從而使HCO3-生電移動到氣道腔中。促胰液素已經被廣泛證實可刺激Cl-/HCO3-交換器的活性，所述Cl-/HCO3-交換器與頂端上皮(例如，膽管上皮細胞，Alvaro等，1993；1997)上的cAMP-依賴性Cl-通道(CFTR)功能性連接。這種由促胰液素介導的離子移動已經被證實可刺激生電Na+/HCO3-的協同轉運，從而校正細胞內的pH(Ishiguro等，1993)。
(d)此外，已知HCO3-水平的增加可維持粘液中，可溶且惰性的分泌蛋白(Lee等，1999)。
(e)誘導AQPs到質膜中的易位和插入，使水移動到氣道腔中。在大鼠cholangiocytes中，促胰液素已經被證實可通過誘導AQP-1水通道的易位而引起滲透H2O滲透性方面，60％的濃度依賴性增加(Marinelli等，1997)。由於通過先前所述機理校正了支氣管細胞和氣道腔中的Na+，Cl-，HCO3-和pH，因此該過程還可在H2O穿過質膜的滲透擴散的幫助下進行。
為支持這些方案，我們研究了促胰液素對三級支氣管組織樣品的作用。
實施例2促胰液素受體在三級支氣管中的功能活性促胰液素受體的功能活性是在三級支氣管和源於正常組織三級支氣管的上皮細胞中檢測的。
簡言之，解剖源於非CF供體的人三級支氣管的非分支區，縱向切，並將其固定在改進過的烏辛小室的兩個隔室之間，從而測量穿過支氣管壁的短路電流。在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔(氣道)和基底膜，將組織電壓調至0，從而使短路電流的改變應答所要測量的促胰液素。開始先將10μM濃度的阿米洛利加入到腔膜中(圖5，點a)(如現有技術中的那些所述)，從而部分阻斷主要的鈉離子流並露出基本離子流。達到穩定基線時，將3μM人促胰液素(由Sigma，目錄號S714)加入到腔膜中(圖5，點b)。
人們發現促胰液素可按照與陰離子(Cl-和/或HCO3-)移動相同的方式刺激離子移動(圖5)。像促胰液素，將10μM ATP或UTP加入到肺上皮的頂膜中被證實可刺激相似值的類似離子移動。這些ATP和UTP介導的作用在文獻中被廣泛報導，其通過P2Y2 purinoceptor刺激Ca2+激活的Cl-流。所有所述的激動劑，均以高濃度產生相似值的應答。
促胰液素受體的功能性作用是在人三級支氣管的上皮細胞中探測的。簡言之，三級支氣管上皮是通過整夜的蛋白酶消化分離的，然後進行培養直到在Snapwell(Costar)可滲透載體上融合。將所述載體固定在改進過的烏辛小室中，並在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔和基底膜。將細胞電壓調至0，從而使短路電流的改變應答所要測量的促胰液素。如前所述，先將10μM阿米洛利加入到腔膜中(圖6，點a)，然後將100nM促胰液素加入到腔膜中(圖6，點b)。與在三級支氣管中觀察到的結果一致，促胰液素按照與陰離子(Cl-和/或HCO3-)相同的移動方式刺激離子移動。此外，加入500μM格列本脲後，CFTR的識別抑制劑不能抑制促胰液素介導的離子移動，暗示在CF三級支氣管的上皮細胞中可觀察到類似的離子移動。
實施例3CF支氣管中離子移動的刺激使用人CF三級支氣管，和1μM促胰液素重複上述實驗。所得結果在圖7中表示。在點(a)，加入阿米洛利可阻斷基礎鈉流。在點(b)，加入1μM促胰液素可刺激陰離子的離子移動，從而證實非-CF支氣管中的實驗觀察結果。
實施例4利用促胰液素刺激三級支氣管中氯離子的流出三級支氣管上皮細胞中的離子移動是利用Cl-特異性螢光探針MQAE(正-(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉 溴化物；Molecular Probes)表徵的。簡言之，按照前面所述分離原始的人三級支氣管上皮細胞，並在96孔平板中培養。達到融合時，用4mM MAQE整夜裝載細胞。在通過加入Cl-游離緩衝液而使Cl-被動流出之前，在含HEPES緩衝液的氯化物中清洗該細胞。加入毫微摩爾濃度的促胰液素可刺激Cl-流出，這一點是通過MQAE螢光的改變而測定的。促胰液素介導的螢光改變是通過加入非選擇性Cl-通道阻斷劑NPPB(5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸；100μM)而消除的。所得結果在圖8中表示，它表示兩種不同濃度促胰液素的作用(空心菱形12.5nM；實心圓圈100nM)。100nM促胰液素介導的Cl-流出是由非選擇性Cl-阻斷劑NPPB(空心圓圈)抑制的。未刺激過的Cl-流出是通過實心正方形加以證實的。
實施例5CF三級支氣管中嗜鉻粒蛋白A的免疫反應性將恆冷箱切片(5-7μM)從固定的低聚甲醛上切下來，用石蠟包埋5個CF和3個非-CF第四支氣管的切片，並用小鼠單克隆嗜鉻粒蛋白A抗體(Vector Laboratories Ltd；cat.No.NCL-CHROM)染色，然後用IgG第二抗體染色。使用Vector Universal Elite ABC試劑盒檢測抗體的結合。在沒有原始陰性對照且似乎沒有非特異性結合的情況下，培養相鄰的切片。與較少或沒有染色的正常組織和對照組相比，在用嗜鉻粒蛋白A抗體染色的CF組織中，觀察到很多孤立的內分泌細胞。這表明S-型腸內分泌細胞的存在是促胰液素表達調節劑的靶。因此，刺激促胰液素在這種細胞中產生的藥劑可用於治療CF。
實施例6促胰液素產生的內源性調節檢測了17個正常供體和25個CF肺供體的三級支氣管和肺實質中NeuroD的mRNA表達。引物探針組是為檢測NeuroD(登記號BAA76603)而特殊設計的。脫機同源性檢索顯示與在基因銀行登記的基因序列不顯著匹配。轉錄因子BETA2/NeuroD的正向和反向引物及探針序列如下正向引物 GAACGCGCCGCTAGACA(SEQ ID NO7)反向引物 GTCTCGATTTTGGACAGCTTCTG(SEQ ID NO8)探針 AGCAAGGCACCACCTTGCGCA(SEQ ID NO9)數據(圖9)是由QRT-PCR臨界循環的平均值±s.em.表示的，臨界循環越高，基因拷貝數/100ng tRNA越低。
在CF實質中可觀察到NeuroD mRNA表達的顯著減少，這與在對照組和CF供體三級支氣管中較低的存在水平相似。功能性地，CF實質中NeuroD的這種減少可能與內源性促胰液素合成及調節的減少有關。因此，NeuroD功能性表達的提高可導致肺內促胰液素內源性水平的提高，其因此成為利用促胰液素受體的激動來治療囊性纖維化的間接機理。
總之，促胰液素受體的刺激可用於校正CF的離子和H2O問題，減少粘液層的厚度，並改善肺的粘液纖毛清除。
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權利要求
1.卡莫司他在製備治療囊性纖維化(CF)或COPD的藥物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中所述治療是CF。
3.根據權利要求1的用途，其中所述治療是COPD。
4.根據權利要求1-3的任意一項的用途，其中所述藥物是通過吸入給藥。
5.根據權利要求4的用途，其中所述吸入給藥是噴霧。
6.包含卡莫司他以及至少一種其它的具有抗CF活性的化合物的組合物。
7.包含卡莫司他以及至少一種其它的具有抗COPD活性的化合物的組合物。
全文摘要
本發明是以促胰液素受體在人遠端肺所存在的組織中表達的發現為基礎的。在CF患者中，受體水平要比正常組織高。利用促胰液素對組織進行治療可刺激陰離子在組織中的移動。本發明提供了通過給予患者有效量的藥劑來治療所述患者囊性纖維化或COPD的方法，其中所述藥劑可通過激活促胰液素受體而引發呼吸組織中陰離子的流出。
文檔編號A61K9/12GK1923187SQ200610059858
公開日2007年3月7日 申請日期2001年7月4日 優先權日2000年7月4日
發明者R·J·達維斯, K·J·佩奇 申請人:諾瓦蒂斯國際藥品有限公司