一種促進微藻油脂積累的培養基的製作方法
2023-05-18 12:19:16 1
一種促進微藻油脂積累的培養基的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進微藻油脂積累的培養基，在微藻的培養基中添加丁基羥基茴香醚，丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為60nM-60μM。所述丁基羥基茴香醚先溶解到二甲基亞碸中製成儲液，再加入到微藻的培養基中。本發明的培養基適用於大規模發酵培養，對微藻生長無不利影響而油脂積累的效果明顯。
【專利說明】一種促進微藻油脂積累的培養基
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體的說就是一種促進微藻油脂積累的培養基。
【背景技術】
[0002]DHA即二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是人腦發育、成長的重要物質之一，是大腦和視網膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20%，在眼睛視網膜中所佔比例最大，約佔50%。因此，它對胎兒和嬰幼兒的大腦和視網膜的發育，以及成年人腦功能的維修等方面有著重要的作用。此外，DHA對冠心病、中風、高血壓等心血管系統的疾病、神經失常、老年痴呆症和抑鬱症等神經系統的疾病也有積極的影響。DHA作為一種必需脂肪酸，其增強記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學研究發現，體內DHA含量高的人的心理承受力較強，智力發育指數也高。DHA還可用於癌症治療，抑制發炎等。據荷蘭帝斯曼公司的估計，DHA的全球市場價值約為25-26.2億美元，並且以每年15%以上的速度增長。
[0003]截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來源。但這一主要來源存在諸多缺點，比如海洋汙染造成的對魚油安全性的擔憂，魚油質量會隨著魚的種類、捕撈季節和地點的不同而不同，含EPA、易受環境汙染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來源的DHA作為一種食品添加劑的應用。尤其是考慮到DHA的主要消費者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔憂；此外，世界漁業資源的逐年萎縮對DHA的可持續性供應的影響也值得考慮。
[0004]而利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)發酵生產DHA,與傳統魚油來源相比，具有一系列優點，如發酵周期短，培養方式簡單，微生物生長快，易於大規模培養；多不飽和脂肪酸含量高，產品質量穩定， 氧化穩定性較好，不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易於分離純化；同時克服了傳統的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產地、生產周期等諸多限制因素的影響。因此微生物發酵生產DHA可替代魚油來源的DHA，具有廣泛的應用前
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[0005]隱甲藻是一種原始的真核單細胞微藻，營異養生活，在甲藻門中處於較低等的地位。隱甲藻的細胞周期可粗劃分為細胞生長階段和穩定時期，其中穩定期是隱甲藻積累DHA的主要階段。目前工程培養隱甲藻細胞過程中，油脂產量較低，限制了該藻資源開發。怎樣在不影響細胞自身生長速率的前提下，在單位產量內獲得更多的油脂是開發隱甲藻生物資源的工作重點內容之一。如已有專利通過控制鈉離子和鉀離子水平在低氯培養基中生長海洋微生物增加高度不飽和的脂肪酸產量。目前，在不影響隱甲藻自身生長的前提下，在培養基中添加各類刺激隱甲藻油脂積累的物質是改善發酵培養的重要方向。
[0006]丁基羥基茴香醚(BHA)是一種很好的抗氧劑，作為食品抗氧劑，能阻礙油脂食品的氧化作用，延緩食品開始敗壞的時間。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是，提供一種提高微藻油脂產量的促進油脂積累的培養基。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是:一種促進微藻油脂積累的培養基，在微藻的培養基中添加丁基羥基茴香醚，丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為60ηΜ_60 μ Μ。
[0009]所述丁基羥基茴香醚先溶解到二甲基亞碸中製成儲液，再加入到微藻的培養基中。
[0010]所述丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為30ηΜ-4 μ Μ。
[0011]所述微藻是隱甲藻屬。
[0012]所述微藻是寇氏隱甲藻菌種。
[0013]所述丁基羥基茴香醚溶解到二甲基亞碸中製成的儲液，每升儲液中丁基羥基茴香醚為大於ΙΟΟηΜ。
[0014]所述培養基的組成為:葡萄糖l-60g/L，酵母浸粉0.l-20g/L,海鹽5_60g/L，丁基羥基茴香醚60ηΜ-60 μ Μ，二甲基亞碸的體積份數0.001%_10%。
[0015]所述培養基的組成為:葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海鹽25g/L，丁基羥基茴香醚60 μ Μ, 二甲基亞碸的體積份數0.4%。
[0016]本發明的有益效果是:可有效提高微藻細胞油脂積累量，使細胞乾重增加，能在提高生產效率的同時增加油脂產量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為添加BHA前40Χ寇氏隱甲藻顯微圖片。
[0018]圖2為添加BHA後40Χ寇氏隱甲藻顯微圖片。
[0019]圖3為添加不同濃度的BHA後寇氏隱甲藻生長曲線。
[0020]圖4為添加不同濃度BHA培養後，使用油脂抽提的方法測定的寇氏隱甲藻油脂含量。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明:
[0022]本發明的促進微藻油脂積累的培養基，在微藻的培養基中添加丁基羥基茴香醚，丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為60ηΜ-60 μ M0
[0023]所述丁基羥基茴香醚先溶解到二甲基亞碸中製成儲液，再加入到微藻的培養基中。
[0024]所述丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為30ηΜ_4 μ Μ。
[0025]所述微藻是隱甲藻屬。
[0026]所述微藻是寇氏隱甲藻菌種。
[0027]所述丁基羥基茴香醚溶解到二甲基亞碸中製成的儲液，每升儲液中丁基羥基茴香醚為大於ΙΟΟηΜ。
[0028]所述培養基的組成為:葡萄糖l-60g/L，酵母浸粉0.l-20g/L,海鹽5_60g/L，丁基羥基茴香醚60ηΜ-60 μ Μ，二甲基亞碸的體積份數0.001%_10%。[0029]優選，所述培養基的組成為:葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海鹽25g/L，丁基羥基茴香醚60 μ Μ, 二甲基亞碸的體積份數0.4%。
[0030]實施例1
[0031]將0.054克丁基羥基茴香醚(BHA)加入30mL二甲基亞碸充分溶解，經過過濾除菌，配成IOmM的儲液，即得到油脂積累促進劑。按照報導的培養基方案(葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海鹽25g/L)配製基礎培養液，加入油脂積累促進劑，得到不同濃度的促進微藻油脂積累的培養基。分別接種處於旺盛對數生長期的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)株系(藻株來自美國菌種保藏中心ATCC30772)。將上述藻株分別接種後搖勻，每株均分數瓶，進行搖瓶實驗。在250mL搖瓶中裝入IOOmL培養基，每株準備相同數量的培養基，按0.4%(V/V)加入相同體積但濃度不同的促進劑，形成不同濃度梯度，設計只加相同體積的溶劑以及不做任何處理的菌株作為對照試驗，每個處理3個重複。然後利用天津市歐諾儀器儀表有限公司HNY-202B搖床進行單因子實驗，培養溫度為25°C，隨機排放各瓶在搖床內的位置，減少處理誤差。培養期間每12h取樣，用酶標儀測量藻液在490nm下的吸光度，表徵細胞生長情況。每個處理有2個以上重複，以平均值土SD表示。並在末期鏡檢觀察細胞大小有無明顯變化。
[0032]在細胞生長到72h時，收集一定量細胞，根據文獻敘述的尼羅紅染色方法改進後進行尼羅紅染色，利用螢光分光光度計進行螢光信號檢測；同時取適量細胞進行鏡檢，觀察細胞大小和狀態變化；另取少量細胞進行乾重測量。在實驗過程中，不同濃度的油脂積累促進劑對不同株系的作用存在一定差異，但在一定濃度下都明顯促進細胞油脂積累，而對細胞大小沒有產生明顯影響。根據均勻實驗的結果，選擇出對藻株積累都有明顯作用的BHA用量，其中BHA的濃度範圍為40 μ M, 30 μ M, 4 μ Μ, 400ηΜ, 40ηΜ,其最適濃度為30ηΜ_4 μ Μ。
[0033]最後通過論證，添加`的油脂積累促進劑是否經過滅菌處理，對增加油脂積累的效果沒有差異，且具有廣譜性。與空白對照組相比，添加不同濃度促進劑的細胞生長速率沒有明顯變化，細胞大小均勻，也沒有發生破裂，聚團等，生長狀態正常(圖1-3)，但油脂量與空白對照組相比有大幅度提高，一般比沒有使用油脂積累促進劑的對照提高10%-25%，促油脂積累效果明顯(表1)。
[0034]表1添加不同濃度BHA後，使用尼龍紅染色的方法測定的寇氏隱甲藻油脂的提高
[0035]
【權利要求】
1.一種促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，在微藻的培養基中添加丁基羥基茴香醚，丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為60ηΜ-60 μ Mo
2.根據權利要求1所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述丁基羥基茴香醚先溶解到二甲基亞碸中製成儲液，再加入到微藻的培養基中。
3.根據權利要求1或2所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述丁基羥基茴香醚在培養基中濃度為30ηΜ-4 μ M0
4.根據權利要求1或2所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述微藻是隱甲藻屬。
5.根據權利要求4所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述微藻是寇氏隱甲藻菌種。
6.根據權利要求2所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述丁基羥基茴香醚溶解到二甲基亞碸中製成的儲液，每升儲液中丁基羥基茴香醚為大於ΙΟΟηΜ。
7.根據權利要求2所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述培養基的組成為:葡萄糖l_60g/L，酵母浸粉0.l-20g/L,海鹽5-60g/L，丁基羥基茴香醚60ηΜ_60 μ Μ,二甲基亞碸的體積份數0.001%-10%ο
8.根據權利要求7所述的促進微藻油脂積累的培養基，其特徵在於，所述培養基的組成為:葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海鹽25g/L，丁基羥基茴香醚60 μ M，二甲基亞碸的體積份數0.4%。`
【文檔編號】C12R1/89GK103710402SQ201410025774
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月21日 優先權日:2014年1月21日
【發明者】張衛文, 王江新, 陳磊 申請人:天津宇科生物科技有限公司