微生物的培養方法及利用微生物製造物質的方法
2023-05-18 10:39:36 1
專利名稱：微生物的培養方法及利用微生物製造物質的方法
技術領域：
本發明涉及將長鏈脂肪酸作為微生物能夠適宜同化的碳源來利用，在工業上高效進行微生物的培養、利用微生物生產物質的方法。另外，還涉及使用所述碳源，在工業上高效地使微生物產生聚羥基烷酸酯(以下也稱PHA)的方法。
背景技術：
在對環境問題、糧食問題、健康以及安全的意識提高，天然或自然意識提高等背景下，微生物的培養、利用微生物製造物質(發酵生產、生物轉換等)的意義和重要性日益提
尚ο在微生物的培養、利用微生物製造物質中，需要有適宜被微生物同化的碳源(用於培養、發酵等的碳源)。作為該碳源的代表，可以列舉出糖類、油脂、短鏈脂肪酸等。近年，在環境問題等背景下，作為碳源，日益期望可再生碳源(尤其非石油來源的碳源)、更理想的是不與食物衝突的碳源(所謂不適於食用的碳源)。從該觀點上看，長鏈脂肪酸(例如來自植物的長鏈脂肪酸)應該是適宜碳源的候選之一。長鏈脂肪酸例如可以從椰子、棕櫚(包括棕櫚核)等中獲得。已知椰子、棕櫚等植物作為油脂中的組成脂肪酸，含有長鏈脂肪酸。作為這些來源於植物的代表性長鏈脂肪酸，可以列舉出碳數12的月桂酸、碳數14的肉豆蔻酸、碳數16的棕櫚酸等長鏈飽和脂肪酸和碳數 18的油酸等長鏈不飽和脂肪酸。這些長鏈脂肪酸被作為表面活性劑、肥皂、化妝品等的工業原料加以利用。但是， 並沒有在利用微生物的產業中被廣泛利用。尤其是，並沒有充分進行將其作為用於培養微生物及利用微生物製造物質的碳源來利用的研究。報告了將月桂酸或者油酸單獨作為碳源使用，培養嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，生產PHA的例子(參見非專利文獻1 )。但是，其主要討論了將油酸單獨作為碳源使用的情況，而沒有討論肉豆蔻酸和棕櫚酸。另外，報告了將月桂酸或者肉豆蔻酸單獨作為碳源使用，培養真氧產鹼桿菌 (Ralstonia eutropha)，生產PHA的例子(參見專利文獻1)，但是PHA的產量極低，在lg/L 以下。另外，沒有利用棕櫚酸。而且，報告了將月桂酸鈉等鹽單獨作為碳源使用，培養大腸埃希氏菌 (Escherichia coli，大腸桿菌)，生產PHA的例子(參見非專利文獻2)。但是沒有利用肉豆蔻酸和棕櫚酸。以上的研究僅停留在培養規模在幾毫升至幾升的小規模的實施上。如上所述，還沒有達到在工業上將各種長鏈脂肪酸作為用於微生物的培養、利用微生物製造物質的碳源來適宜利用的目標。現有技術文獻專利文獻
專利文獻1 美國專利申請公開第2002/0086377號說明書。
非專利文獻
非專利文獻 1 :Lee S.、et. al.、Biotechnol Bioeng.、67 :240-244 (2000)； 非專利文獻 2 =Regina V.、et. al.、FEMS MICROBIOLOGY LETTERS、111-117 (2000)。
發明內容
本發明的課題在於提供一種有效利用迄今為止未必被有效產業利用的長鏈脂肪酸的方法。具體來說，課題在於提供如下方法，即提供一種將所述長鏈脂肪酸作為微生物能適宜同化的碳源來利用，在工業上高效進行微生物的培養以及利用微生物製造物質的方法。另外。以提供一種利用所述碳源，在工業上高效製造PHA的方法。本發明的發明人通過將月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸分別單獨作為碳源使用，培養大腸桿菌，初步地研究了微生物對各脂肪酸的同化性。結果認為，肉豆蔻酸和棕櫚酸的同化性均極低，將它們作為碳源利用是極其困難的。另外，月桂酸也未必顯示出足夠的同化性。因此本發明的發明人進行了銳意研究，以將作為對微生物的同化性不充分的長鏈脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸，在微生物的培養、利用微生物製造物質中適宜利用。結果，發現含有多種長鏈脂肪酸的組成物或者長鏈脂肪酸和油脂的混合組成物， 能極為適宜地利用作為用於微生物的培養及利用微生物製造物質(例如，PHA製造)的碳源， 從而完成了本發明。S卩，本發明是一種微生物的培養方法，包括在包含下述組成物中任意一種的碳源的存在下培養微生物的工序
(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；
(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。優選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少一種以及油酸，
所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少一種、 油酸以及油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸和油酸， 所述混合組成物包含月桂酸、油酸和油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物包含棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包含棕櫚酸、油酸和油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少三種，
所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少三種以及油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸所構成的組中選擇的至少兩種以及油酸，
所述混合組成物包括從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少兩種、 油酸以及油脂。
優選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包含月桂酸、棕櫚酸、油酸和油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸， 所述混合組成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和油脂。優選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長鏈脂肪酸中的長鏈飽和脂肪酸的含有率為20重量％以上。優選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計含有率為5重量％以上。優選的是，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物的上升熔點為培養溫度+10°C 以下。優選的是，所述混合組成物中的脂肪酸的含有率為45重量％以上。優選的是，所述微生物為細菌。優選的是，所述微生物為屬於貪銅菌(Cupriavidus)屬或者埃希氏菌 (Esherichia)屬的微生物。優選的是，所述微生物為屬於貪銅菌(Cupriavidus)屬的微生物。優選的是，所述微生物為鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)0優選的是，所述微生物為嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因為
編碼序列編號1所表示的胺基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對於所述胺基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。優選的是，所述微生物是屬於埃希氏菌屬的微生物。優選的是，所述微生物是大腸埃希氏菌。優選的是，所述微生物是酵母。而且，本發明還涉及一種微生物代謝產物的製造方法，該製造方法包括 在包含所述組成物中任意一種的碳源的存在下，培養微生物的工序、以及
回收所培養的所述微生物產生的代謝產物的工序。優選的是，所述微生物代謝產物為聚羥基烷酸酯。優選的是，所述聚羥基烷酸酯為3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體。通過本發明，使得能夠有效利用迄今未必被有效產業利用的長鏈脂肪酸、尤其是長鏈飽和脂肪酸。具體地說，通過將所述長鏈脂肪酸、尤其是所述長鏈飽和脂肪酸作為微生物能適宜同化的碳源來利用，而使得能夠在工業上高效進行微生物的培養及利用微生物製造物質。另外，能夠使用所述碳源，在工業上高效地製造PHA。
具體實施例方式以下將詳細說明本發明。在微生物的培養以及利用微生物製造物質中，一般葡萄糖和蔗糖等糖類作為碳源被廣泛利用。由於這些糖類在水中的溶解度高，因此在通常的培養條件下，其溶解於微生物所生長的培養液等液體中作為碳源的利用效率較高。另一方面，一般，微生物對在水中溶解度低的碳源利用率(同化性)較低。本發明的發明人確認了，在微生物對水中溶解度極低的長鏈脂肪酸、尤其是長鏈飽和脂肪酸(其中尤其是肉豆蔻酸和棕櫚酸)的同化性非常低。此外，在研究了月桂酸、肉豆蔻酸或者棕櫚酸和油脂的混合物的同化性之後，確認了隨著混合物中脂肪酸的含量的提高，同化性降低。但是，利用本發明，能夠將這些脂肪酸作為碳源極有效地利用。本發明中的碳源包括下列組成物中的任意一種
(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；
(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂，所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的脂肪酸-油脂混合組成物。本發明中，通過將同化性低的各種脂肪酸、油酸組合作為碳源使用，能夠改善同化性，而且，在使得能夠有效利用這些脂肪酸這一點上極有意義。能在所述脂肪酸-油脂混合組成物(2)中使用的油脂並不特別限定，但是優選的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸或者油酸作為構成成分的油脂。具體來說，例如可以列舉出來源於棕櫚的油脂、來源於椰子的油脂、來源於玉米的油脂、來源於大豆的油脂、來源於油菜籽的油脂、來源於油橄欖的油脂、來源於麻風樹的油脂等。從提高同化性同時有效利用脂肪酸的觀點上來說，所述脂肪酸-油脂混合組成物 (2)中的脂肪酸的含有率為10重量％以上。優選的是20重量％以上，更優選的是30重量％ 以上，進一步優選的是40重量％以上，尤其優選的是45總量％以上，最優選的是50重量％ 以上。所述含有率的上限並不限定，只要低於100重量％即可。這裡，脂肪酸的含有率是指， 脂肪酸(這裡的「脂肪酸」的概念是不包含構成所述油脂的脂肪酸)相對於脂肪酸和油脂的合計量的重量比。根據本發明的較佳的一實施方式，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物 (2)包含油酸，並且包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少一種。作為長鏈不飽和脂肪酸的油酸，不僅其自身對微生物的同化性高，而且具有提高作為長鏈飽和脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸的同化性的效果。因此，通過將油酸和所述長鏈飽和脂肪酸並用，不僅能有效利用長鏈飽和脂肪酸，而且能協同達到高同化性。從有效利用長鏈飽和脂肪酸的觀點上來看，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2 )中，相對於長鏈脂肪酸(長鏈飽和脂肪酸和長鏈不飽和脂肪酸的合計)，長鏈不飽和脂肪酸的含有率優選的是20重量％以上，更優選的是30重量％以上，進一步優選的是40 重量％以上，特別優選的是50重量％以上。這裡，長鏈不飽和脂肪酸相對於長鏈脂肪酸的含有率是指，長鏈飽和脂肪酸相對於所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)中使用的長鏈飽和脂肪酸和長鏈不飽和脂肪酸的合計量的重量比。另外，在計算所述含有率時， 未考慮構成所述油脂的長鏈飽和脂肪酸和長鏈不飽和脂肪酸。這裡，長鏈飽和脂肪酸是指月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸，長鏈不飽和脂肪酸是指油酸。更佳的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包括油酸、而且包含月桂酸或者棕櫚酸。根據本發明的適宜的其他實施方式，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物 (2)包括從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少三種脂肪酸。更適宜的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包括油酸，並且包括從由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少兩種。進一步適宜的是，所述脂肪酸組成物(1) 或者所述混合組成物(2)包括月桂酸、棕櫚酸和油酸，尤其適宜的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、 棕櫚酸以及油酸。特別是從有效利用同化性低的肉豆蔻酸和棕櫚酸的觀點上看，優選的是所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)包含肉豆蔻酸和/或棕櫚酸。在這種情況下，優選的是，所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)中包含的長鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計含有率為5重量％以上。更優選的是10重量％以上，進一步優選的是15重量％以上。所述合計含有率的上限並不特別限定，為了進一步提高同化性，70重量％以下優選，65重量％以下更優選，60重量％以下更為優選，55重量％以下尤其優選。根據本發明的適宜的另一種的實施方式，本發明的脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點為微生物的培養溫度+10°C以下。更優選的是微生物的培養溫度+9°C 以下，進一步優選的是微生物的培養溫度+8°C以下，尤其優選的是微生物的培養溫度+7°C 以下。用於工業上的大多數微生物一般生長最適溫度是37°C以下。因此，大多數情況下，優選的是，本發明的脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點為47°C以下。更優選的是46°C以下，進一步優選的是45°C以下，尤其優選的是44°C以下。但是，本發明中使用的組成物的上升熔點並不限於上述溫度。可以根據微生物的培養溫度適當地設定上升熔點， 選擇滿足該上升熔點的組成物。上升熔點的下限不特別規定。本發明的發明人明確了長鏈飽和脂肪酸的上升熔點為，月桂酸約43°C，肉豆蔻酸約52°C，棕櫚酸約62°C，作為長鏈不飽和脂肪酸的油酸的上升熔點為約12°C。根據本發明，通過含有多種上述脂肪酸，能夠根據微生物的生長溫度適宜地調節組成物的上升熔點，提高對微生物的同化性。即使在上升熔點高的肉豆蔻酸和棕櫚酸的情況下，也能適宜地發揮本發明的效果。令人驚訝的是，在培養溫度方面，即使是固體狀態的組成物也能作為碳源有效利用。本發明中，脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的上升熔點可以通過以下的方法進行測定
(1)將兩端開口的毛細管(內徑1mm、外徑2mm以下，長5(T80mm)的一端浸入到完全溶解的試樣中，直到試樣充滿約IOmm的高度，迅速用冰片等固化毛細管內部的試樣；
(2)將包含固化的試樣的毛細管在10°C以下放置24h或者冰上放置Ih後供試驗用；
(3)將毛細管設置在上升熔點測定器(ELEXSCIENTIFIC公司生產的EX-871A)上；
(4)將毛細管浸在裝滿了比預想熔點低約20°C的溫度的水中，使溫度計的下端置於水面下30mm的深度；
(5)在以適當的方法攪拌容器中的水的同時，進行加熱，使得最開始以2VMn的速度使水溫升高；
(6)達到預想熔點10°C下之後，加熱使水溫以0.5°C /min的加熱速度升高；
(7)試樣在毛細管中開始上升的溫度為上升熔點。本發明的脂肪酸組成物(1)和混合組成物(2)的具體組成根據使用的微生物的種類、微生物產生的物質的種類、培養的各種條件(培養基成分、PH、培養溫度等)等而不同，不一定能夠統一規定。但是，能夠示出幾組適宜的組成。適宜的組成之一是，月桂酸含有率30^70重量％、肉豆蔻酸含有率5 30重量％，棕櫚酸含有率5 30重量％，油酸含有率10 30 重量％。適宜的組成之一是，月桂酸含有率1(Γ40重量％，肉豆蔻酸(TlO重量％、棕櫚酸含有率2(Γ40重量％、油酸3(Γ50重量％。適宜的組成之一是，月桂酸含有率15 45重量％、棕櫚酸含有率15 45重量％、油酸含有率2(Γ50重量％。以上的含有率的數值是表示相對於組成物中包含的脂肪酸(這裡的「脂肪酸」的概念是不包含構成所述油脂的脂肪酸)的合計量的比例。混合組成物(2)是除去油脂後的含有率。但是，上述組成終究是適宜的組成的例子，本發明並不限於上述組成。另外，上述組成物也可以根據需要而增加油脂。本發明的包含脂肪酸組成物(1)或者混合組成物(2)的碳源，也可以還含有其他的脂肪酸、糖類、蛋白質、胺基酸等。作為通過本發明培養微生物使微生物產生的代謝物，例如可以列舉出乙醇、丁醇、 丙醇等醇類、乳酸、醋酸、胺基酸、核酸等酸類、脂質類、油脂類或聚羥基烷酸酯(PHA)等。PHA 是很多微生物種的細胞中作為能量貯藏物質而產生、貯藏的熱塑性聚酯，具有生物降解性。 現在由於環保意識的提高，非石油來源的塑料受到關注。尤其是，微生物菌體內生成、貯藏的PHA由於能進入自然界的碳循環，因此預計對生態系統的不良影響較小，期望其實用化。 因此，PHA是使用本發明生產的物質的很好的示例之一。作為PHA的種類，只要是微生物產生的PHA即可，並不特別限定。優選的是從碳數 ri6的3-羥基烷酸中選擇的一種單體聚合形成的PHA、從碳數Γ16的3-羥基烷酸中選擇的兩種以上的單體共聚形成的共聚PHA。例如，可以列舉出由碳數4的3-羥基烷酸形成的聚羥基丁酸酯(PHB)、碳數4和6的3-羥基烷酸構成的聚羥基丁酸己酸(PHBH)、碳數4和5 的3-羥基烷酸所構成的聚羥基丁酸戊酸酯(PHBV)、碳數Γ14的3-羥基烷酸所構成的聚羥基烷酸酯(PHA)。作為本發明的微生物的培養以及利用微生物製造有用物質中使用的微生物，並不特別限定，可以適宜地使用從天然分離的微生物、基因操作過的微生物等。具體來說， 優選使用青枯菌(Ralstonia)屬、貪銅菌(Cupriavidus)屬，沃特氏菌(Wautersia)屬、 氣單胞菌(Aeromonas)屬、埃希氏菌(Escherichia)屬、產鹼桿菌(Alcaligenes)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、芽胞桿菌(Bacillus)屬、固氮菌(Azotobacter)屬、諾卡氏菌 (Nocardia)屬、鞘脂單胞菌(Sphingomonas)屬、叢毛單胞菌(Comamonas)屬等的細菌類，酵母(Saccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、假絲酵母(Candida)屬等的酵母類。當然，也可以使用對所述微生物進行人工突變處理得到的變異株及通過基因工程的方法變異處理的菌株。作為製造PHA中使用的微生物，例如可以列舉出鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)等貪銅菌屬、廣泛產鹼桿菌(Alcaligenes latas)等產鹼桿菌屬、惡臭假單胞 lif (Pseudomonas putida)、iMftfx^-MM (Pseudomonas f luorescens)> 參錄月農單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、食樹月旨假單胞菌(Pseudomonas resinovorans)、食油假單胞 |if (Pseudomonas oleovorans) ^jix-^-lfi |1 Μ> lEL^v^lfilf lif (Bacillus megaterium)等芽胞桿菌屬、固氮菌屬、諾卡氏菌屬、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonaso hydrophila)等氣單胞菌屬、青枯菌(Ralstonia)屬、沃特氏菌(Wautersia) 屬、叢毛單胞菌(Comamonas)屬等(Microbiological Reviews,450-472 項，1990 年)。也可以通過使用基因工程的方法導入PHA合成酶基因等，人為實施使之生產PHA的改良的生物細胞。也可以利用例如埃希氏菌(Esherichia)屬等革蘭氏陰性細菌、芽胞桿菌(Bacillus) 屬等的革蘭氏陽性細菌、酵母(Saccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、假絲酵母 (Candida)屬等的酵母類，植物等的高等生物細胞，但是從能夠儲存大量PHA這一點上看， 優選使用微生物。在生產作為PHA的一種的3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體(PHBH)中，可以使用例如豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等本身生產PHBH的微生物，也可以使用通過對本身不生產PHBH的微生物使用基因工程的方法、導入聚羥基烷酸酯合成酶基因，而人為施加了使之生產PHBH的改良的生物細胞。作為導入基因的宿主微生物，例如可以適宜使用鉤蟲貪銅菌。另外，作為聚羥基烷酸酯合成酶基因，可以使用來源於豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的聚羥基烷酸酯合成酶基因或者其改良體。作為改良體，可以使用編碼在天然的聚羥基烷酸酯合成酶中缺失、添加、插入或者置換了胺基酸殘基的聚羥基烷酸酯合成酶的鹼基序列。具體來說，可以使用嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因為編碼序列編號1中表示的胺基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對於所述胺基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。在利用本發明培養微生物時，使用在培養基中添加碳源的方法。關於培養基組成、 碳源的添加方法、培養規模、通氣攪拌條件和培養溫度、培養時間，根據培養的微生物的種類適當決定即可，並不特別限定。優選的是連續或者間歇性地添加碳源。本發明中的碳源可以在添加到培養基中時已經是混合組成物，也可以是分別添加各組成成分，在培養基內
混合ο本發明的PHA等微生物代謝產物的製造方法只要是通過上述培養方法使微生物內儲存微生物代謝產物，此後，再使用公知的方法從菌體內回收微生物代謝產物即可。在微生物代謝產物是PHA的情況下，例如，可以通過以下的方法進行。培養結束後，從培養液中用離心分離機等分離菌體，將該菌體用蒸餾水和甲醇等有機溶劑洗淨、乾燥。從該乾燥菌體中用氯仿等有機溶劑提取PHA。從該含有PHA的溶液中利用過濾等除去菌體成分，在濾液中加入甲醇、己烷等弱溶劑，使PHA沉澱。接著，在利用過濾、離心分離除去上清液之後，可以乾燥並回收PHA。本發明的發明人確認了本發明在2. 5L規模的培養下能夠適宜實施，而且在 16000L以上的規模也能適宜地再現。該5000倍以上的放大的實現，意味著在較大工業規模中的製造中，適宜地並且最大限度地發揮了本發明的效果。在本發明中，將所述脂肪酸組成物(1)或者所述混合組成物(2)作為碳源使用而帶來的同化性提高是指，由於含有多種難以同化的長鏈飽和脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸或者棕櫚酸)，或者含有難以同化的所述長鏈飽和脂肪酸和容易同化的長鏈不飽和脂肪酸(油酸)，與將其單獨使用的情況相比，難以同化的所述長鏈飽和脂肪酸的同化性提高的意思。 或者，由於含有難以同化的所述長鏈飽和脂肪酸和油脂，與將其單獨使用的情況相比，難以同化的所述長鏈飽和脂肪酸的同化性提高的意思。另外，本發明中，同化性的提高是指，每小時的碳源的消耗量增加，結果微生物菌體的產量和微生物產生的物質的產量增加的意 )思ο
微生物菌體的產量可以通過吸光度法、乾燥菌體重量測定法等公知的方法測定。 微生物產生的物質的產量可以通過GC法、HPLC法等公知的方法測定。細胞中貯藏的PHA的含量，可以按照加藤等的方法(Appl. MicroBiol. Biotechnol.，第45卷，第363頁，(1996); Bull. Chem. Soc.，第69卷，第515頁(1996))，用氯仿等有機溶劑從培養細胞提取、乾燥細胞中貯藏的PHA來進行測定。實施例
以下，通過實施例進一步具體說明本發明。但是，本發明並不限於這些實施例。各組成物的上升熔點利用前面述及的方法算出。(實施例1)大腸桿菌的培養
使用各種碳源，培養E. coli HBlOl株(寶生物公司(夕力才社)生產)。作為預培養基使用LB培養基(10g/L細菌用胰蛋白腖(Bact0-trypt0ne)，5g/L細菌用酵母抽提物(Bacto-yeast extract), 5g/L NaCl)。生長試驗中使用 M9 培養基(6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,0. 5g/L NaCl, lg/L NH4Cl, ImM MgSO4,0. OOlw/v% 硫胺，0. ImM CaCl2)。將大腸桿菌(Ε. coli)的甘油菌(glycerol stock)在預培養基上接種，於37°C培養12小時，進行預培養。之後，將預培養液以2v/v%的濃度接種在加入了 50ml的M9培養基的500ml用的坂口搖瓶(Sakaguchi flask)中。接著，作為碳源，將表1所示的各種脂肪酸組成物以0. 25w/v%的濃度加入到坂口搖瓶中，在37°C振蕩培養96小時。碳源一併添加到坂口搖瓶內。培養結束後，通過離心分離回收菌體，用甲醇洗淨後，冷凍乾燥，測定乾燥菌體重量。結果示於表1。表1
權利要求
1.一種微生物的培養方法，包括在包含下述組成物中任意一種的碳源的存在下培養微生物的工序，(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物，(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。
2.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少一種以及油酸，所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少一種、 油酸以及油脂。
3.根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含月桂酸和油酸，所述混合組成物包含月桂酸、油酸和油脂。
4.根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包含棕櫚酸、油酸和油脂。
5.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少三種，所述混合組成物包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少三種以及油脂。
6.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含從由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕櫚酸所構成的組中選擇的至少兩種以及油酸，所述混合組成物包括從由月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸所構成的組中選擇的至少兩種、 油酸以及油脂。
7.根據權利要求6所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包含月桂酸、棕櫚酸、油酸和油脂。
8.根據權利要求7所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸，所述混合組成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和油脂。
9.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長鏈脂肪酸中的長鏈飽和脂肪酸的含有率為20重量％以上。
10.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物中包含的長鏈脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕櫚酸的合計含有率為5重量％以上。
11.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述脂肪酸組成物或者所述混合組成物的上升熔點為培養溫度+10°C以下。
12.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述混合組成物中的脂肪酸的含有率為45重量％以上。
13.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物為細菌。
14.根據權利要求13所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物為屬於貪銅菌屬或者埃希氏菌屬的微生物。
15.根據權利要求14所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物為屬於貪銅菌屬的微生物。
16.根據權利要求15所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物為鉤蟲貪銅菌。
17.根據權利要求16所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物為嵌入了如下聚羥基烷酸酯合成酶基因的鉤蟲貪銅菌，所述聚羥基烷酸酯合成酶基因為編碼序列編號1所表示的胺基酸序列的聚羥基烷酸酯合成酶基因，或者編碼相對於所述胺基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羥基烷酸酯合成活性的多肽的聚羥基烷酸酯合成酶基因。
18.根據權利要求14所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物是屬於埃希氏菌屬的微生物。
19.根據權利要求18所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物是大腸埃希氏菌。
20.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述微生物是酵母。
21.—種微生物代謝產物的製造方法，所述製造方法包括在包含下列組成物中任意一種的碳源的存在下培養微生物的工序、以及回收所培養的所述微生物產生的代謝產物的工序，(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物，(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸所構成的組中選擇的至少一種脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量％以上的混合組成物。
22.根據權利要求21所述的製造方法，其特徵在於，所述微生物代謝產物為聚羥基烷 酸酯。
23.根據權利要求22所述的製造方法，其特徵在於，所述聚羥基烷酸酯為3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚體。
全文摘要
將迄今為止未必被有效產業利用的長鏈脂肪酸作為碳源來利用，在工業上高效進行微生物的培養以及利用微生物製造物質。在包含下列組成物中任意一種的碳源的存在下，培養微生物；(1)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸以及油酸所構成的組中選擇的至少兩種脂肪酸的脂肪酸組成物；(2)包含從由月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸以及油酸所構成的組中選擇的至少一種脂肪酸和油脂、所述脂肪酸的含有率為10重量%以上的混合組成物。
文檔編號C12P7/62GK102325883SQ20108000773
公開日2012年1月18日 申請日期2010年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者佐藤俊輔, 藤木哲也 申請人:株式會社鍾化