一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法

2023-05-18 10:41:41

專利名稱：一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法
技術領域：
本發明涉及一種劍麻組織培養的方法，特別是涉及一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，屬於組織培養育苗技術領域。
背景技術：
劍麻為重要的熱帶纖維作物，主要分布在南北回歸線之間的部分熱帶、亞熱帶地區，種植區域十分有限，資源總量稀缺；劍麻纖維是航運、漁船、鑽探所用繩纜、繩網，電梯、 吊車的鋼索繩心等不可替代的原料，目前劍麻製品已廣泛用於金屬拋光、特種紙漿、金屬製品、運輸、礦山、家庭裝飾、地毯、工藝、醫藥和汽車工業中。我國劍麻生產上目前種植的唯一劍麻品種H. 11648是20世紀60年代從國外引進的優良品種，其纖維產量高，抗寒性強，在我國大面積推廣種植，大幅度提高了劍麻產量，使我國劍麻躍居世界前列，成為可出口創匯的優勢產業。然而，H. 11648的種植目前已經歷了 3個生命周期，由於種植品種的長期單一和種苗的隨意繁衍，造成目前劍麻早花早衰現象極其突出，纖維抽出率有逐年下降的趨勢，甚至出現葉緣有刺的返祖現象，這是品種退化的一種象徵；由於品種退化，抗性減弱，劍麻病害不斷滋生，嚴重影響麻園高產穩產。劍麻生命周期長，一生僅開一次花，其基因的分配與重組的機會有限，而且劍麻是引進的外來物種，種質資源全部需要從國外引進，新品種培育常常受到種質資源的約束，因而有性雜交育種時間長、效率低，種植品種單一的局面還將長時期存在。麻園高產穩產，種苗培育是關鍵，種苗優良，植株生勢壯旺，抗性強，鮮葉產量高；幾十年的劍麻生產實踐證明，H. 11648是優良的劍麻品種，其豐產性是目前其它品種難以比擬的，通過對H. 11648進行提純復壯，恢復其種性，在短期內即可緩解由於劍麻品種缺乏帶來的風險。通過H. 11648 優良單株篩選，利用組織培養腋芽成苗途徑對優良單株進行快速繁殖，應用株系提純法是實現H. 11648提純復壯的有效途徑。因此，劍麻組織培養不僅是目前劍麻生產的迫切需求， 對利用基因工程進行劍麻品種遺傳改良以緩解劍麻種植品種長期缺乏有重要現實意義。 國內外對劍麻的組織培養和植株再生也做了一定的探索，在國外，利用種子、 珠芽、走莖以及莖段等為外植體，通過直接或間接的器官發生方式已成功的建立了亞洲馬 H麻 C4. cantala Robx)、灰卩十麻 Cl fourcroydes Lem)> Hil^lJ (A sisalana Perrine)、藍劍麻(A tequilana Weber cultivar azul )> A. parrasana Berger> A. tequilana ^A. crassispina > A. duranguensis ,A. vera-cruz Mill·、A. atroFii-e1/ ^·禾口 A. arizonica等體外再生體系，並獲得了完整的再生植株，在國內，廣東省農墾科技中心以劍麻鑽心芽莖尖作為外植體，通過快繁的方式獲得大量叢生芽。廣東湛江農墾科研所2005 年初利用H. 11648高產植株的珠芽做外植體，通過快繁的方式成功培育了 2萬多株小苗， 中國熱帶農業科學院和海南大學分別利用劍麻(Agave sisalana Perrine ex Engelmann) 嫩芽和無菌苗葉片為外植體，通過愈傷誘導獲得完整再生植株，中國熱帶農業科學院以 H. 11648麻莖尖為外植體，通過快繁的方式獲得了一定數量的H. 11648植株，但以上方法獲得的叢芽或再生植株均存在不同程度的玻璃化現象，本課題組也開展了劍麻再生體系構建研究，獲得了一定數量的再生植株，但再生植株玻璃化率最高可達80%以上，嚴重影響了劍麻體外快速繁殖，同時對利用生物技術手段開展劍麻遺傳改良也有不利影響。 組培苗玻璃化現象在植物組織培養中普遍存在，玻璃化的植株常呈半透明狀，夕卜觀形態往往異常。通常玻璃化植株在後續培養期間很難恢復正常生長，在繼代培養中仍然形成玻璃化苗，且玻璃化苗的分化能力低，難以增殖生根成苗。由於玻璃化苗的生理功能異常，難以移栽成活，因此對利用組織培養技術開展植物體外快繁極為不利，組培苗玻璃化問題也成了組培苗生產中亟待解決的問題。對於組培苗玻璃化的誘發因素早在1981年 Debergh等就進行了系統研究，但由於不同植物玻璃化的誘發因素很不相同，大家眾說紛紜，對其玻璃化的發生規律和機理至今還缺乏真正的了解，也沒有普遍適用的行之有效的防止玻璃化發生技術措施。本方法不僅在很大程度上克服了劍麻組培快繁中的玻璃化現象，同時也可在一定程度上使已經玻璃化的植株恢復正常生長，同時還能誘導玻璃化的愈傷組織再生出正常植株，為利用生物技術開展劍麻相關研究打下了良好的基礎。

發明內容
為實現上述目的本發明所採用的技術方案是
一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於實施步驟如下
(1)外植體表面消毒及培養
以劍麻珠芽苗(5-lOcm)或吸芽苗(10-20cm)的莖尖為材料進行消毒，先將外層老葉剝離，流水衝洗，用0. 3%高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超淨工作檯上用75%酒精浸泡 lmin，再用0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最後用無菌水衝洗3_5次；晾乾後切除部分外植體，縱切後接種於改良SH+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2. 5-5. Omg/L培養基上，培養條件為每天光照12-14小時，暗培養10-12小時，光照強度20001UX，培養溫度為28士2°C ；
(2)叢芽誘導和增殖培養
將初代培養45天後的莖尖轉入叢芽誘導和增殖培養基上進行叢芽誘導和增殖，叢芽誘導和增殖培養基為改良SH培養基，添加外源激素為6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸 (NAA)和吲哚3丁酸(IBA);6-BA 的濃度為 1. 0-5. Omg/L ； NAA 的濃度為 0-1. 5mg/L，IBA 的濃度為 0-1. Omg/L，pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，光照為 2000Lx，溫度 28士2°C;
(3)生根培養
經增殖培養和壯苗後，將高5cm以上，帶有4-5片葉的小苗轉入生根培養基進行生根培養，生根基本培養基為改良SH，添加外源激素為IBA，激素濃度為0.5-2. 5 mg/L, pH為 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗 10_12h，溫度 28士2°C ；
(4)無菌苗移栽
待植株生根2-3周時，將瓶苗置於自然條件下煉苗1周，然後取出洗去基部的培養基， 用高錳酸鉀1000倍液浸泡3-5min，移植到基質為椰糠和河沙(椰糠河沙為1:1)的塑料遮光大棚中培育，遮光度75%以上，白天最高溫度不超過32°C，夜晚最低溫度不低於20°C， 每天早晚各澆透水1次，植株的成活率在95%以上，幼苗長出新葉後開始追施2%複合肥水月巴，施肥後要立即用清水淋洗小苗葉片，待幼苗長出新葉3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然環境下繼續培育。上述的改良SH培養基大量修改的成分為硝酸鉀2000-2520 mg/1，磷酸二氫鉀300-353 mg/1，硝酸氨 100-300 mg/1，SH 鐵鹽中的 FeSO4 7H20 為 15-27. 8mg/l，Na2-EDTA 為 15-37. 3mg/l, SH 微量的 ZnSO4 7H20 為 5_15mg/l。本發明的優點在於
本發明首次通過調節培養基的有效組分來控制組培苗玻璃化現象，利用本法在劍麻莖尖叢芽誘導中能高效誘導出正常植株，還可使已玻璃化的再生植株恢復正常生長，為劍麻的組培快繁，再生體系建立、遺傳轉化等奠定了良好的基礎。該方法實施步驟簡單易行，快速、高效，實施條件寬鬆，效果非常顯著。


圖1為本發明例1莖尖誘導的叢芽圖2為本發明例2玻璃化的植株
圖3為本發明例2玻璃化的植株培養20天後的恢復情況圖4為玻璃化的愈傷組織； 圖5為玻璃化的愈傷組織誘導的不定芽(1個月) 圖6為不定芽生根培養(20天)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。實施例1
取保存於南亞熱帶作物研究所劍麻種質圃的高8-lOcm珠芽苗15株，去除根及老葉， 流水衝洗，用高錳酸鉀溶液1000倍處理30min，接著用75%酒精浸泡lmin，再用0. 1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最後用無菌水衝洗3-5次。晾乾後切除部分外植體，縱切後接種於改良SH+6-BA3. 0-5. Omg/L培養基上，培養條件為每天光照12-14小時，暗培養10-12小時， 光照強度20001UX，培養溫度為28士2°C。培養45天後轉接入叢芽誘導和增殖培養基，叢芽誘導和增殖基本培養基為改良SH培養基，添加外源激素為6-BA、NAA和IBA ；6-BA的濃度為 1. 0-5. Omg/L ；NAA 的濃度為 0-1. 5mg/L，IBA 的濃度為 0-1. Omg/L，pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗10-12h，光照為2000Lx，溫度28士2°C。每45-60天繼代1次，半年後共獲得 5347株完整植株，正常植株比例在98%以上。實施例2
取85簇(每簇5-8株)部分或完全玻璃化的再生植株接種於改良SH培養基上，添加外源激素為 6-BA、NAA 和 IBA ；6-BA 的濃度為 1. 0-5. Omg/L ；NAA 的濃度為 0-1. 5mg/L, IBA 的濃度為0-1. Omg/L, pH為5. 8-6. O ；光照12_14h，黑暗10_12h，光照強度為2000Lx，溫度 28士2°C。培養1個月後23簇已完全恢復正常生長，34簇部分恢復，玻璃化苗恢復比例為 67. 06%ο實施例3
取玻璃化的帶芽的愈傷團塊62塊，去除玻璃化的芽和嫩葉，接種於改良SH培養基上， 添加外源激素為6-BA、NAA和IBA ；6-BA的濃度為1. 0-5. Omg/L ；NAA的濃度為0-1. 5mg/L, IBA 的濃度為 0-1. Omg/L, pH 為 5. 8-6. O ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，光照為 2000Lx，溫度28 士 2°C。2周後觀察有55個愈傷團塊有不定芽誘導， 其中有47個愈傷團塊誘導出的不定芽基本正常，有8個愈傷團塊誘導的不定芽有不同程度的玻璃化，不定芽誘導比例為88. 71%， 其中正常不定芽比例為85. 45%。
權利要求
1.一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)外植體表面消毒及培養以劍麻珠芽苗或吸芽苗的莖尖為材料進行消毒，先將外層老葉剝離，流水衝洗，用0. 3% 高錳酸鉀溶液處理30min，接著在超淨工作檯上用75%酒精處理lmin，再用0. 1%氯化汞溶液處理15-30 min,最後用無菌水衝洗3_5次，晾乾後縱切，接種於改良SH+6-苄氨基腺嘌呤 6-BA2. 5-5. Omg/L培養基上進行初代培養40-50天；培養條件為每天光照12-14小時，暗培養10-12小時，光照強度20001UX，培養溫度為28士2°C ；(2)叢芽誘導和增殖培養將經初代培養的莖尖轉入叢芽誘導與增殖培養基上進行叢芽誘導和增殖，叢芽誘導與增殖培養基為改良SH培養基，添加外源激素為6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸 IBA ；6-BA 的濃度為 1. 0-5. Omg/L ； NAA 的濃度為 0-1. 5mg/L, IBA 的濃度為 0-1. Omg/ L，pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12-14h，黑暗 10_12h，光照為 2000Lx，溫度 28士2°C ；(3)生根培養經叢芽誘導、增殖培養並壯苗後，將高5cm以上，帶有4-5片葉的小苗轉入生根培養基進行生根培養，生根基本培養基為改良SH，添加外源激素為吲哚3 丁酸IBA，激素濃度為 0. 5-2. 5 mg/L，pH 為 5. 8-6. 0 ；光照 12_14h，黑暗 10_12h，溫度 28士2°C ；(4)無菌苗移栽待植株生根2-3周，小苗長出3-5條壯根時，將瓶苗置於自然條件下煉苗1周，然後取出洗去基部的培養基，用高錳酸鉀1000倍液浸泡3min，移植到基質為椰糠和河沙的塑料遮光大棚中培育，遮光度75%以上，白天最高溫度不超過32°C，夜晚最低溫度不低於20°C，每天早晚各澆透水1次，植株的成活率在95%以上；幼苗長出新葉後開始追施2%複合肥水肥， 施肥後要立即用清水淋洗小苗葉片，待幼苗長出新葉3片、苗高IOcm左右即可移栽到自然環境下繼續培育。
2.根據權利要求1所述的一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於 所述的劍麻珠芽苗為5-lOcm高的種苗。
3.根據權利要求1所述的一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於 所述的吸芽苗為10-20cm高的種苗。
4.根據權利要求1所述的一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於 所述的改良SH培養基大量修改的成分為硝酸鉀2000-2520 mg/1，磷酸二氫鉀300-353 mg/ 1，硝酸氨 100-300 mg/1, SH 鐵鹽中的 FeSO4 7H20 為 15-27. 8mg/l，Na2-EDTA 為 15-37. 3mg/ 1, SH 微量的 ZnSO4 7H20 為 5_15mg/l。
5.根據權利要求1所述的一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，其特徵在於 所述的椰糠和河沙的比例為1:1。
全文摘要
本發明涉及一種克服劍麻組織培養苗玻璃化現象的方法，該方法是在離體條件下，利用劍麻莖尖為外植體經過表面消毒後，接種到添加有6-BA的改良SH培養基上進行初代培養約45天，然後將無菌外植體接種到含有6-BA的改良SH培養基上進行誘導分化和培養，誘導出的叢芽應用誘導分化相同的培養基每45天進行繼代增殖，經過生根培養可獲得大量健康種苗；該方法通過調節培養基的有效組分來控制組培苗玻璃化現象，方法簡便、經濟、高效，常見劍麻品種用此法生產組培苗均能有效克服玻璃化現象，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H4/00GK102283128SQ201110204540
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月21日 優先權日2011年7月21日
發明者周文釗, 張燕梅, 戴梅蓮, 李俊峰, 林映雪, 陸軍迎 申請人:中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所