一種用於研究魚類遺傳關係的dna分子標記方法
2023-05-18 06:43:06
專利名稱：一種用於研究魚類遺傳關係的dna分子標記方法
技術領域：
本發明涉及利用分子遺傳標記來分析魚類之間的分子遺傳關係，具體涉及用DNA分子標記來判斷和分析不同魚類的遺傳特性和遺傳關係。
背景技術：
對生物遺傳變異的分析，一是直接測序，一是藉助分子遺傳標記。目前大規模全基因組測序發展迅猛，但對生物界所有物種測序是不現實的。分子遺傳標記仍然是個體水平和群體水平上分析生物遺傳多樣性及其變化規律的主要手段，廣泛應用於群體遺傳學、系統學、進化生物學、遺傳作圖等理論研究及保護生物學、動植物遺傳育種、疾病診斷等實踐領域。
目前，DNA分子標記主要有以下五種(1)線粒體DNA(mtDNA)分子標記；(2)基於Southern雜交分子標記，如限制性片段長度多態性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)，螢光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和單鏈構象多態性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)；(3)基於PCR的分子標記技術，如隨機擴增多態性DNA(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)，擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和單鏈構象多態-DNA聚合酶鏈式反應(Single-Strand ConformationPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，SSCP-PCR)；(4)基於重複序列的分子標記，如微衛星DNA和小衛星DNA；(5)基於mRNA的分子標記，如逆轉錄PCR(Polymerase ChainReaction)和差異顯示逆轉錄PCR。
1990年，Sinclair等人在人類和小鼠中克隆了睪丸決定因子SRY/Sry(Sexdetermining region on Y chromosome)基因，進一步研究發現Sry基因編碼的蛋白質產物中含有一段具有高度保守性且具有結合DNA功能的區域(稱為high mobility group，HMG)。Sox基因族編碼的蛋白質中都含有HMG區域，每個Sox基因的HMG序列與Sry基因的HMG序列至少具有60％的同源性。目前，已在進化位置明顯不同的各類物種如哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類以及昆蟲中克隆出了40多個Sox基因，對其序列和功能進行了研究，迄今發現的所有Sox基因，按其HMG-box盒的同源性程度，可劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個不同的亞族。如C組的Sox4基因參與心臟管腔發育，E組的Sox9基因參與睪丸的發育，F組中的Sox18基因參與血管的發育。但是目前還沒有利用Sox基因族的DNA片段作為分子遺傳標記來判斷不同魚類的遺傳特性和分析它們的遺傳關係的報導。
發明內容
本發明旨在應用擴增獲得的DNA片段作為分子遺傳標記分析不同魚類之間的遺傳關係。
本發明是通過以下技術方案實現上述發明目的的用Sox基因族的HMG-box的保守序列設計簡併引物，通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得Sox基因的DNA片段，根據擴增片段在數目和種類上的共同性和差異性分析不同魚類之間的遺傳關係，簡併引物序列為上遊引物5』TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3』；下遊引物5』AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3』。
下面結合附圖進一步詳述本發明。
圖1部分魚種Sox基因HMG-box DNA片段的擴增圖。
其中M200bp分子梯度標記；1.紅鯽；2.鯉魚；3.鯽鯉F1；4.鯽鯉F2；5.異源四倍體鯽鯉；6.雄核發育二倍體鯽鯉；7.雌核發育二倍體鯽鯉第一代(G1)；8.雌核發育二倍體鯽鯉第一代(G2)；9.日本白鯽；10.雌核發育日本白鯽；11.三倍體湘雲鯽(日本白鯽(♀)×四倍體鯽鯉(♂))；12.三倍體鯽魚(紅色雙尾金魚(♀)×四倍體鯽鯉(♂))；13.異源四倍體鯽鯉；14.紅色雙尾金魚；15珍珠雙尾金魚；16.黑色雙尾墨龍金魚；17.本地鯽魚；18.彭澤鯽。
圖2部分魚種Sox基因HMG-box DNA片段的擴增圖。
其中M200bp分子梯度標記1.雌核發育二倍體鯽鯉；2.異源四倍體鯽鯉；3.雌核發育二倍體鯽鯉(G1)(♀)×四倍體鯽鯉(4n)(♂)；4.單尾紅鯽；5.雙尾紅鯽；6.灰色鯉魚；7.白色鯽魚。
引物設計參照不同物種中Sox基因HMG保守區序列，用Primer Premier 5.0軟體和Jellyfish1.4軟體設計獨特的簡併引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下上遊引物5』TGAAGCGACCCATGAAC/TG3』；下遊引物5』AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT3』。
實驗材料紅鯽(Carassius carassius red var.，2n＝100)和鯉魚(Cyprinus carpio L.，2n＝100)及其二倍體雜交後代鯽鯉F1-F2，異源四倍體鯽鯉(人工鯽鯉雜交產生的四倍體魚)，雄核發育二倍體鯽鯉，雌核發育二倍體鯽鯉第一代(G1)、第二代(G2)，日本白鯽(Carassius auratus cuvieri)，雌核發育日本白鯽，三倍體湘雲鯽(日本白鯽(♀)×四倍體鯽鯉(♂))，三倍體金魚(紅色雙尾金魚(♀)×四倍體鯽鯉(♂))，黑色雙尾墨龍金魚，珍珠雙尾金魚，紅色雙尾金魚，雌核發育二倍體鯽鯉第一代G1(♀)×異源四倍體鯽鯉4n(♂)自交後代分離出的單尾紅鯽，雙尾紅鯽，灰色鯉魚，白色鯽魚，本地鯽魚，彭澤鯽(Carassius auratus varpengze)。
基因組DNA的提取血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒進行。提取的DNA用紫外分光光度計檢測其濃度，-20℃保存。
PCR擴增和克隆PCR反應在美國Applied Biosystems公司生產的GeneAmpPCR System 2700熱循環儀上進行，每個擴增反應總體積為25μl，其中模板基因組DNA 80ng，每種dNTP200μmol.l-1，每種引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反應液在94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35個循環，最後在72℃延伸10min。PCR產物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳中分離，用上海Sangon公司膠回收試劑盒純化切取的擴增片段，純化方法參照產品手冊進行。將回收的DNA片段克隆於載體pMD18-T(TakaRa公司)，連接反應及細菌轉化按pMD18-T載體試劑盒說明書進行操作。
測序和序列分析選取陽性克隆菌落，提取重組質粒pMD18-T，經過菌落PCR和酶切鑑定後，由上海Sangon公司對陽性克隆進行測序，採用Blast軟體進行核苷酸和胺基酸序列同源性比較，根據其與查詢序列的最高相似性而命名所得克隆。
本研究根據Sox基因家族HMG保守區設計獨特簡併引物，通過PCR擴增不同魚類基因組DNA片段並對一些DNA片段的序列進行了測序。結果表明，不同魚類中Sox基因的DNA片段擴增產物在數目、大小和種類方面存在共同性和差異性，通過這些差異性和共同性可以確定它們各自的遺傳特性和分析它們的遺傳關係。本發明基於Sox基因組DNA片段的數目、大小和種類的分子標記技術可以快速、準確、特異、敏感地確定不同魚類的分子遺傳特性並分析它們的分子遺傳關係。
具體實施例方式
現以紅鯽(Carassius carassius red var.)為例具體介紹本發明。按活體解剖確定紅鯽性別，選擇性成熟紅鯽個體。用一次性注射器從紅鯽背動脈取血，血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒進行。提取的DNA用紫外分光光度計檢測其濃度，-20℃保存。
參照不同物種中Sox基因HMG保守區序列，用Primer Premier 5.0軟體和Jellyfish1.4軟體設計獨特的簡併引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下上遊引物5』TGAAGCGACCCATGAAC/TG3』；下遊引物5』AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT3』。以紅鯽基因組DNA為模板，設計PCR體系擴增其Sox基因。具體步驟如下PCR反應在美國Applied Biosystems公司生產的GeneAmpPCR System 2700熱循環儀上進行，每個擴增反應總體積為25μl，其中紅鯽基因組DNA 80ng，每種dNTP 200μmol.l-1，每種獨特的簡併引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反應液在94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35個循環，最後在72℃延伸10min。PCR產物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳中分離，用凝膠成像掃描儀拍照，結果見圖1中1號樣品所示，可見清晰的三條擴增帶，大小分別約為200、600和1900bp。
其它實驗魚Sox基因的擴增和克隆方法與紅鯽基本一致，結果見圖1圖2。從圖1可知，二倍體鯽鯉F1-F2(3、4號樣品)以及異源四倍體鯽鯉(在鯽鯉F3中形成四倍體鯽鯉，目前繁殖到F15，證明鯽鯉F3-F15都是四倍體魚)(5號樣品)中有四條大小分別約為200、600、900和1900bp的DNA擴增帶，而在其原始母本-紅鯽(1號樣品)只有3條帶和原始父本-鯉魚中(2號樣品)只有2條擴增帶，大小分別約為200、600、1900bp和200、900bp。這些結果表明二倍體鯽鯉F1-F2和四倍體鯽鯉都既兼有其原始親本共有的200bp擴增帶，又有區別於鯉魚，紅鯽特有的600，1900bp擴增帶和區別於紅鯽，鯉魚特有的900bp擴增帶。通過這些擴增帶特徵，我們能很容易的區分紅鯽和鯉魚及它們的二倍體和四倍體雜交後代。四倍體鯽鯉產生的二倍體精子通過無需染色體加倍的雄核發育過程發育成為二倍體雄核發育雜交後代(6號樣品)，本實驗結果表明它們具有同鯽鯉F1-F2、四倍體鯽鯉同樣大小的四條帶，從分子水平證明了它們的異源性，同樣本實驗結果也證明四倍體鯽鯉產生的二倍體卵子通過雌核發育過程形成的雌核發育後代(G1和G2)(7、8號樣品)也具有類似的四條帶，顯示出異源性，證明它們是一個雜交克隆體系。
日本白鯽(9號樣品)和雌核發育白鯽(10號樣品)具有相同的大小分別約為200和640bp的2條帶，說明雌核發育白鯽的遺傳組成中與其母本的遺傳組成是一致的，沒有檢測到父本(團頭魴，Megalobrama amblycephala)的遺傳物質。這兩條帶特別是640bp這條帶的特徵可作為區分白鯽與紅鯽、鯉魚、金魚、本地鯽魚以及彭澤鯽的分子遺傳標記。三倍體湘雲鯽(11號樣品)具有5條帶(大小分別約為200、600、620、900和1900bp)，兼有父母本的帶，這五條帶可作為區分紅鯽、鯉魚、白鯽、四倍體鯽鯉等魚的分子遺傳標記。而由紅色雙尾金魚作為母本製備的三倍體鯽魚(12號樣品)只具有四條帶，以此可以把此三倍體鯽魚與三倍體湘雲鯽區分出來。紅色雙尾金魚(14號樣品)，珍珠雙尾金魚(15號樣品)，黑色雙尾墨龍金魚(16號樣品)，都只具有2條大小分別為200和600bp的帶，說明這三種金魚雖然在體色和形態方面都存在差異，但是在遺傳組成方面它們是非常相似的並與白鯽的遺傳組成很接近。本地鯽魚(17號樣品)與金魚、日本白鯽很接近都只具有2條帶，但是與彭澤鯽(18號樣品)有顯著的差異(彭澤鯽具有4條帶)，這說明彭澤鯽比本地鯽魚、日本白鯽和金魚具有更複雜的遺傳組成。
從圖2可知，雌核發育二倍體鯽鯉(G1)(♀)×四倍體鯽鯉(4n)(♂)(3號樣品)具有與親本(1和2號樣品)完全相同的擴增帶，說明G1(♀)×4n(♂)具有紅鯽和鯉魚兩種遺傳成分，單尾紅鯽(4號樣品)，雙尾紅鯽(5號樣品)，灰色鯉魚(6號樣品)和白色鯽魚(7號樣品)是一些特殊的G1(♀)×4n(♂)後代通過自交的方式產生的具有分離性狀的不同類型的魚，其中紅色單尾紅鯽，雙尾紅鯽，白色鯽魚都是類似紅鯽的鯽魚，其外形特徵偏向於它們的原始母本紅鯽，其共同的基本特徵就是它們都沒有須。本研究結果顯示它們具有3條同樣大小的DNA帶，說明它們的遺傳組成與紅鯽是一致的；分離後代中的灰色鯉魚與普通鯉魚的外形是完全一致，本實驗結果表明它們都具有相同大小的4條DNA帶，說明它們的遺傳組成是一致的。該實驗結果為證明雌核發育效應可以導致異源四倍體鯽鯉的自交後代出現分離提供了重要的分子遺傳標記證據。
為了進一步確定紅鯽這三條擴增帶的性質，用一次性刀片分別切取這三條擴增帶，經Sangon公司膠回收試劑盒純化切取的擴增片段，純化方法參照產品手冊進行。將回收的三個不同大小的DNA片段分別克隆於載體pMD18-T(TakaRa公司)，連接反應及細菌轉化按pMD18-T載體試劑盒說明書進行操作。
從三個不同平板上選取陽性克隆菌落，分別提取重組質粒pMD18-T，經過菌落PCR和酶切鑑定後，由上海Sangon公司對三種不同陽性克隆進行測序，採用Blast軟體進行核苷酸和胺基酸序列同源性比較，並根據其與查詢序列的最高相似性而命名所得克隆。
對四倍體鯽、鯉的4條擴增帶(5號)進行測序，測序結果表明四倍體鯽鯉中的200bpDNA片段屬於Sox18基因，600bpDNA片段屬於Sox9a基因，900bpDNA片段屬於Sox9b基因，1900bpDNA片段屬於Sox4基因。該結果表明四倍體鯽鯉兼有其原始父母本的遺傳基因，它們是異源四倍體而不是同源四倍體，研究表明異源四倍體比同源四倍體具有更多的生物學優勢。
權利要求
1.一種用以分析魚類遺傳特性和遺傳關係的DNA分子標記方法，其特徵在於用Sox基因族的HMG-box的保守序列設計簡併引物，通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得Sox基因的DNA片段，根據擴增片段在數目和種類上的共同性和差異性分析不同魚類之間的遺傳關係，簡併引物序列為上遊引物5』TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3』；下遊引物5』AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3』。
全文摘要
本發明涉及魚類的DNA分子標記技術。本發明選擇Sox基因族的HMG(High mobilitygroup)保守區域為分子克隆的目標，設計獨特簡併引物，應用PCR、瓊脂糖凝膠電泳等方法獲得在數目和種類上有差異的Sox基因的DNA片段，用這些特殊的DNA分子來判斷和分析不同魚類的遺傳特性和遺傳關係。該方法可以快速準確分析魚類的遺傳關係，也能應用於其他動物的遺傳關係分析。
文檔編號C07H21/04GK1884529SQ20061003179
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者劉少軍, 劉筠, 劉季芳, 李偉, 陶敏 申請人:湖南師範大學