用於培養羊膜來源間充質幹細胞的培養基組合物和用其培養羊膜來源間充質幹細胞的方法
2023-05-18 00:42:51 1
專利名稱：用於培養羊膜來源間充質幹細胞的培養基組合物和用其培養羊膜來源間充質幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的培養基，更特別涉及一種用於培養間充質幹細胞的培養基組合物和使用所述培養基組合物培養間充質幹細胞的方法，其中所述培養基組合物含有基礎培養基、L-抗壞血酸2-磷酸鹽、胎牛血清、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、非必需胺基酸(NEAA)、胰島素、N-乙醯基-L-半胱氨酸、氯化鈣和氫化可的松。
背景技術：
幹細胞是指不僅具有自我複製能力而且還具有分化為至少兩種細胞的能力的細胞，並且可分為全能幹細胞(totipotent stem cell)、多能幹細胞(pluripotent stemcell)和多向幹細胞(multipotent stem cell)。成體幹細胞通過從各種人器官獲取細胞並使細胞發育成幹細胞而獲得，成體幹細胞的特點是它們僅分化為特定組織。然而，近來將成體幹細胞分化為包括肝細胞在內的多種組織的實驗獲得了巨大成功，成為眾目之焦點。多向幹細胞最初分離自成體骨髓(Y.Jiang等人，Nature，418:41，2002)，隨後在其他幾種成體組織中也有發現(C.M.Verfaillie, Trends Cell Biol.，12:502，2002)。換句話說，骨髓是最廣為人知的幹細胞源，多功能性幹細胞也發現於皮膚、血管、肌肉和腦中(J.G.Toma 等人，Nat.Cell Biol., 3:778, 2001 ;M.Sampaolesi 等人，Science, 301:487，2003; Y.Jiang 等人，Exp.Hemato1.，30:896，2002)。然而，幹細胞很少存在於成體組織如骨髓中，並且沒有誘導分化則該細胞難以培養，因此在不存在特定篩選的培養基的情況下難以培養。即，難以在體外維持所分離的幹細胞。同時，從胎兒組織分離間充質幹細胞的研究結果顯示，胎兒組織中有豐富的間充質幹細胞。然而，將胎兒組織用作細胞治療劑的來源已受到倫理方面的限制。也可從作為胎兒間充質幹細胞(MSCs)源的臍帶血(UCB)中分離間充質幹細胞，但是它們的數量非常少，且且顯示出弱的增殖性。近年來，已知間充質幹細胞存在於羊膜(羊膜內膜(amniotic liningmembrane))中，即，胎盤和發育的哺乳動物胚胎周圍的最內薄膜凹陷(thin innermostmembrane sag)。因此，已經開發了分離和培養該間充質幹細胞的技術(PCT國際專利公開W02006/019357，韓國專利註冊號 0795708 和 0818214)。然而，培養羊膜來源的幹細胞的常規方法的缺點是幹細胞增殖的時間長。因此，本發明人通過大量努力建立了一種能提高羊膜來源的幹細胞的增殖率同時保持分化能力的方法，並由此發現當羊膜來源的幹細胞在含有DMEM-P和KSFM-P的培養基中培養時，細胞增殖能力可得到提高同時保持分化能力，由此實現了本發明。
發明內容
摶術問是頁
本發明的一個目的是提供一種用於培養間充質幹細胞的培養基，其使細胞顯示高增殖率同時使細胞保持分化能力。
本發明的另一個目的是提供一種使用上述培養基培養間充質幹細胞的方法。
技術方案
為達到上述目的，本發明提供了一種用於培養間充質幹細胞的培養基組合物，其含有基礎培養基、L-抗壞血酸2-磷酸鹽、胎牛血清、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、非必需胺基酸(NEAA)、胰島素、N-乙醯基-L-半胱氨酸、氯化鈣和氫化可的松。
本發明還提供一種用於培養間充質幹細胞的方法，所述方法包括在上述培養基組合物中培養間充質幹細胞。
通過以下詳細描述和所附權利要求使本發明的其他特徵和實施方案更明顯。
圖1顯示了在DMEM-P、KSFM-P或DMEM-P和KSFM-P的混合培養基中培養3天的羊膜來源間充質幹細胞的圖片。
圖2是在DMEM-P、KSFM-P或DMEM-P和KSFM-P的混合培養基中培養4天的羊膜來源間充質幹細胞的圖片。
圖3顯示了各組針對⑶31的流式細胞分析結果。
圖4顯示了各組針對⑶34的流式細胞分析結果。
圖5顯示了各組針對⑶45的流式細胞分析結果。
圖6顯示了各組針對⑶29的流式細胞分析結果。
圖7顯示了各組針對⑶44的流式細胞分析結果。
圖8顯示在各組針對⑶73的流式細胞的結果。
圖9顯示了在DMEM-P和KSFM-P混合培養基中培養的羊膜間充質幹細胞(第2組)的第I代(PD的組圖。
圖10顯示了在DMEM-P和KSFM-P混合培養基中培養的羊膜間充質幹細胞(第2組)的第2代(P2)的組圖。
圖11顯示了在不同條件下使用菌素紅S (Alizarin red s)染色分析在DMEM-P和KSFM-P混合培養基中培養的羊膜間充質幹細胞(第2組)的成骨分化的結果。
圖12是顯示在不同條件下在DMEM-P或混合培養基(第2組)中培養且分化為骨細胞的羊膜來源間充質幹細胞中茜素紅S的定量濃度與對照組(其成骨分化沒有被誘導)之間的比較圖。
具體實施方式
在一個方面中，本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的培養基組合物，其含有基礎培養基、L-抗壞血酸2-磷酸鹽、胎牛血清、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、非必需胺基酸(NEAA)、胰島素、N-乙醯基-L-半胱氨酸、氯化鈣和氫化可的松。
在本發明中，所述基礎培養基可選自由DMEM-HG、無血清角朊細胞培養基(definedkeratinocyte-SFM)和其混合物構成的組。
在本發明中，所述培養基組合物 可含有0.05-lmM的抗壞血酸2_磷酸鹽、2_20%胎牛血清、l-100ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子(b_FGF)、1-100 μ L/ml的非必需胺基酸(NEAA)、0.1-100 u g/ml的胰島素、0.2-20mM的N-乙醯基-L-半胱氨酸、0.0l-1mM的氯化鈣和5ng/ml-l u g/ml的氫化可的松。在本發明中，所述非必需胺基酸(NEAA)可由甘氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、脯氨酸和絲氨酸構成。此外，所述非必需胺基酸(NEAA)可由750mg/L的甘氨酸、890mg/L的丙氨酸、1，320mg/L的天冬醯胺、1，330mg/L的天冬氨酸、1，470mg/L的穀氨酸、1，150mg/L的脯氨酸和1，050mg/L的絲氨酸構成。 在本發明中，所述間充質幹細胞可來源於羊膜。在另一個方面中，本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的方法，所述方法包括在上述培養基組合物中培養間充質幹細胞。在本發明中，間充質幹細胞可來源於羊膜。在本發明一個實施例中使用的羊膜來源間充質幹細胞不是從胎盤分離的完整羊膜中提取的多種細胞，而僅僅是羊膜來源的間充質幹細胞。在本發明的一個實施例中，對於分離羊膜來源的間充質幹細胞的方法，羊膜組織是從分娩過程中收集的胎盤組織中分離的，分離的羊膜組織用無菌生理鹽水洗滌並用手術剪儘可能地剪小。加入膠原酶溶液並與剪小的組織充分混合。將混合物放入燒瓶，其後將燒瓶在37°C、5%C02的培養箱中溫育90分鐘以裂解組織。使裂解的組織過濾通過細胞濾網並離心。離心後， 除去上清液，將細胞沉澱物懸浮在DMEM-P中並接種到方瓶(T-f Iask)中，然後在37°C、5%C02的培養箱中培養3-4天。接下來，僅收集附著至培養瓶上的間充質幹細胞。在本發明的一個實施例中，羊膜來源的間充質幹細胞在DMEM-P和KSFM-P混合培養基中的細胞增殖率比單獨的DMEM-P或KSFM-P中的高。特別地，羊膜來源的間充質幹細胞在由以66:33比率混合的DMEM-P和KSFM-P構成的培養基中顯示最高的增殖率。實施例在下文中，將參照實施例進一步詳細描述本發明。本領域普通技術人員知曉，這些實施例僅出於說明的目的而不被解釋為限制本發明的範圍。實施例1:從羊膜組織分離間充質幹細胞本發明實施例中所用的羊膜組織分離自胎盤，將分離的組織放入含抗生素的鹽水或DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium)培養基中，然後轉移到實驗室。在乾淨的工作檯上，用無菌生理鹽水洗滌5g羊膜組織，並且在皮氏培養皿內用手術剪將經洗滌的羊膜組織儘可能剪小。添加膠原酶溶液並與剪小的組織充分混合。將混合物放入燒瓶，然後將燒瓶在37°C、5%C02的培養箱中溫育90分鐘以裂解組織。在50mL管內使裂解的組織過濾通過細胞濾網並離心。離心後，除去上清液，將細胞沉澱物懸浮在DMEM-P中並接種到方瓶中，然後在37°C、5%C02的培養箱中培養3-4天。接下來，僅收集附著至培養瓶的間充質幹細胞。實施例2:在DMEM-P和KSFM-P混合培養基中培養分離的羊膜間充質幹細胞將實施例1中獲得的羊膜來源的間充質幹細胞以1.0X IO6細胞的密度分散於T175瓶中，並在由以表4所示的比率混合的DMEM-P培養基(表I)和KSFM-P培養基(表3)構成的混合培養基中培養，同時每隔2天更換培養基。培養第3天和第4天的細胞圖片如圖1和2所示。
表1:DMEM-P培養某的鉬分
權利要求
1.一種用於培養間充質幹細胞的培養基組合物，其含有基礎培養基、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、胎牛血清、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、非必需胺基酸(NEAA)、胰島素、N-乙醯基-L-半胱氨酸、氯化鈣和氫化可的松。
2.根據權利要求1所述的培養基組合物，其中所述基礎培養基選自DMEM-HG、無血清角朊細胞培養基及其混合物。
3.根據權利要求1所述的培養基組合物，其中所述培養基組合物含有0.05-lmM的抗壞血酸-2-磷酸鹽、2-20%胎牛血清、l-100ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子(b_FGF)、1-100 μ L/ml的非必需胺基酸(NEAA)、0.1-100 μ g/ml的胰島素、0.2_20mM的N-乙醯基-L-半胱氨酸、0.0l-1mM的氯化I丐和5ng/ml-l μ g/ml的氫化可的松。
4.根據權利要求1或3所述的培養基組合物，其中所述非必需胺基酸(NEAA)由甘氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、脯氨酸和絲氨酸組成。
5.根據權利要求4所述的培養基組合物，其中所述非必需胺基酸(NEAA)由750mg/L的甘氨酸、890mg/L的丙氨酸、I, 320mg/L的天冬醯胺、1，330mg/L的天冬氨酸、I, 470mg/L的穀氨酸、1，150mg/L的脯氨酸和1，050mg/L的絲氨酸組成。
6.根據權利要求1所述的培養基組合物，其中所述間充質幹細胞來源於羊膜。
7.一種用於培養間充質幹細胞的方法，所述方法包括在權利要求1-3任一項所述的培養基組合物中培養所述 間充質幹細胞。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述間充質幹細胞來源於羊膜。
全文摘要
本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的培養基，更特別涉及一種用於培養間充質幹細胞的培養基組合物，並且涉及一種使用所述培養基組合物培養間充質幹細胞的方法，所述培養基組合物含有基礎培養基、L-抗壞血酸2-磷酸鹽、胎牛血清、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、非必需胺基酸(NEAAs)、胰島素、N-乙醯基-L-半胱氨酸、氯化鈣和氫化可的松。根據本發明，可短時間內獲得幹細胞治療所需的很多間充質幹細胞，並且間充質幹細胞的分化能力也有所改進因而它們可用於幹細胞治療。
文檔編號C12N5/02GK103154241SQ201180038199
公開日2013年6月12日 申請日期2011年7月18日 優先權日2010年7月16日
發明者羅廷燦, 姜成根, 徐宙延, 金孝銀 申請人:Rnl生物技術株式會社