具有抑制生長激素釋放活性的促生長素抑制素類似物的製作方法

2023-05-18 15:28:41

專利名稱：具有抑制生長激素釋放活性的促生長素抑制素類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及促生長素抑制素類似物，更具體的說就是與某些促生長素抑制素受體亞型發生特異性相互作用的促生長素抑制素類似物。
背景促生長素抑制素(SS)既是擔當激素、神經遞質、和神經調質的內源肽，又是鄰近細胞的旁分泌調節物。它存在兩種形式，SS-14和SS-28，分別是十四肽和二十八肽，它們源自蛋白質前促生長素抑制素原(preprosomatostatin)，而且在神經內分泌及中樞和周圍神經系統的組織中差異分布。促生長素抑制素受體存在五種亞型，都是具有高度序列同源性的G蛋白偶聯受體。
不顧奧曲肽(octreotide)、蘭瑞肽(lanreotide)、和伐普肽(vapreotide)的商業效用，大量的促生長素抑制素類似物已被建議作為成像劑和/或治療劑用於檢測和/或治療癌症和其它促生長素抑制素響應性疾病狀態。希望得到對促生長素抑制素受體(SST)和SST亞型特別是SST2和SST5具有較高親和力的類似物，使得施用較低劑量的促生長素抑制素類似物就可以獲得臨床反應。
概述本發明提供了環狀肽模擬物促生長素抑制素類似物，它設計用於滿足對有效的且有選擇性的SST2和SST5配體的需要。官能化芳香族胺基酸的存在為額外官能化和更廣應用打開了通向新「把手」的道路。
本發明的類似物是有益的抗腫瘤試劑。它們可以用於治療肢端肥大症和糖尿病，以及在放射性標記後用於閃爍顯像目的。另外，可以將類似物進行放射性標記和/或連接能夠引起細胞死亡(如腫瘤細胞死亡)的胞毒劑(cytotoxic agent)。
本發明的組合物(即SS類似物)是設計用於在體外和在體內與細胞上的某些SST亞型(如SST2和SST5)發生相互作用的有用配體。
本發明提供了促生長素抑制素(SS)類似物，其中所述類似物選自SEQ ID NO1-10之任一。在本發明的一個方面，可以將SS類似物連接放射性元素。
本發明還提供了在受試者中顯現惡性細胞的方法，包括對受試者施用本發明的SS類似物。
本發明還提供了在受試者中治療多種增殖性疾病的方法，包括對受試者施用本發明的SS類似物。在本發明的一個方面，增殖性疾病包括腫瘤、肢端肥大症、和/或糖尿病。
本發明還提供了設計用於與SS受體2(SST2)和/或SST5而非其它SS受體發生選擇性結合的促生長素抑制素(SS)類似物，其中所述SS類似物具有選自下組的結構4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ IDNO1)；4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ IDNO2)；4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2(SEQID NO3)；4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2(SEQID NO4)；4-氨基-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO5)；4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO6)；4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ ID NO7)；4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO8)；4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ ID NO9)；和D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2以及含有二或多碘化芳香族殘基的化合物。
本發明還提供了包含本發明的SS類似物和至少一種製藥學可接受載體的混合物的藥物組合物。
下文說明書詳細闡明了本發明的一個或多個實施方案。根據說明書和權利要求書，本發明的其它特色、目的、和優勢將是顯而易見的。
詳述促生長素抑制素抑制胰腺釋放胰島素和胰高血糖素，抑制垂體釋放生長激素，並減少胃分泌。天然促生長素抑制素的血漿半衰期小於3分鐘。它被肽酶快速降解。因而，目前正在尋找具有改進的生物利用度和受體特異性的促生長素抑制素類似物。促生長素抑制素及其類似物有可能牽涉多種疾病的治療。SS類似物尤其是受體特異的肽模擬物配體和非肽配體的診斷性和治療性用途的數目和種類發生激增。
人體中的多種組織表達促生長素抑制素受體，包括但不限於(1)胃腸道、(2)周圍神經系統、(3)內分泌系統、(4)血管系統、和(5)淋巴組織，在那裡受體位於生發中心。在所有這些情況中，有生物活性的促生長素抑制素類似物的促生長素抑制素結合具有高度親和力和特異性。配體與促生長素抑制素受體結合後，激動劑-受體複合物被細胞內化。這種特性在實踐中是重要的，並且構成定位和治療過度表達促生長素抑制素受體的腫瘤的基礎。
促生長素抑制素受體還在病理學狀態中表達，特別是胃腸道神經內分泌腫瘤。源自促生長素抑制素靶組織的大多數人類腫瘤保留了它們的促生長素抑制素受體。首先在生長激素生成性腺瘤和TSH生成性腺瘤中觀察到這種現象；大約半數內分泌停止的腺瘤展示促生長素抑制素受體。90％的類癌和多數胰島細胞癌，包括它們的轉移，常常具有高密度的促生長素抑制素受體。然而，10％的結腸直腸癌和所有外分泌胰腺癌不含促生長素抑制素受體。可以使用體外結合法或者使用體內成像技術來鑑定腫瘤中的促生長素抑制素受體；後者容許對受試者體內的腫瘤及其轉移做出精確定位。因為胃腸胰腺腫瘤中的促生長素抑制素受體是有功能的，所以它們的鑑定可用於評估類似物在受試者中抑制過量激素釋放的治療性功效。
環十四肽促生長素抑制素-14(SS-14)最初是由下丘腦分離的，並且鑑定為來自垂體前葉的生長激素釋放的抑制物(參閱例如美國專利號3,904,594，收入本文作為參考)。這種十四肽在第3和14位的兩個半胱氨醯胺基酸殘基的巰基之間具有橋鍵或環鍵。SS-14調控胰腺的胰島素、胰高血糖素、和澱粉酶分泌以及胃的胃酸釋放。例如，SS-14抑制五肽促胃泌素和組胺對胃黏膜的作用。SS-14還在大腦的下丘腦內區域表達，並且在調控運動活力和認知功能中發揮作用。SS-14存在於整個中樞神經系統中，並且擔當神經遞質。在中樞神經系統中，SS-14已經顯示以積極和消極兩個方面調節神經元激動，影響其它神經遞質的釋放，並調控運動行為和認知過程。
SS-14影響多種細胞過程。研究顯示SS-14是不同組織中腺苷醯環化酶的抑制性調節物。SS-14還調節離子通道的電導，包括鉀和鈣兩種通道。SS-14的這些作用是由百日咳毒素敏感性鳥嘌呤核苷酸結合蛋白介導的。SS-14還通過百日咳毒素不敏感性機制調節酪氨酸磷酸酶的活性和細胞增殖。
SS-14通過與結構相似的膜結合受體家族的相互作用來誘發它的生物學作用。已經克隆了五種SS-14受體，稱為SST 1-5。人SST1、小鼠SST2、和小鼠SST3描述於Raynor等，Molecular Pharmacology 43838-844，1993。現在可以獲取所有五種人SS受體用於研究目的。人SST1、2、和3還公開於美國專利號5,436,155。另外的SS-14受體公開於美國專利號5,668,006和5,929,209。所有五種受體以高親和力結合SS-14和SS-28。已經鑑定了SST2和SST5的選擇性激動劑，並且用於揭示這些受體的不同功能。認為這兩種受體是周圍組織中的優勢亞型。認為SST2介導對生長激素、胰高血糖素、和胃酸分泌的抑制。相反，SST5似乎主要參與對胰島素和澱粉酶釋放的控制。SST3是在皮層組織、垂體、和腺瘤組織中發現的；認為它通過SS-14的結合而介導對胃平滑肌收縮的抑制。這些發現指示不同受體亞型介導SS-14在體內的不同功能。
促生長素抑制素以較高親和力結合五種不同受體(SST)亞型的每一種亞型。激動劑與不同SST亞型的結合與如下病症和/或疾病的治療有關。第2和5型的激活與生長激素抑制有關，更具體的說就是GH分泌性腺瘤(肢端肥大症)和TSH分泌性腺瘤。第2型而非第5型的激活與治療催乳素分泌性腺瘤有關。與促生長素抑制素亞型激活有關的其它適應症有再狹窄、胰島素和/或胰高血糖素抑制、更具體的說就是糖尿病、高脂血症、胰島素不敏感、X症候群、血管病、增殖性視網膜病、黎明現象、和腎病；胃酸分泌抑制，更具體的說就是消化性潰瘍、腸皮膚和胰腺皮膚瘻管(enterocutaneous and pancreaticocutanieousfistula)、腸應激症候群、傾倒症候群、水瀉症候群、AIDS相關腹瀉、化療誘發的腹瀉、急性或慢性胰腺炎、和胃腸激素分泌性腫瘤；癌症諸如肝癌的治療；血管發生的抑制、炎性疾病諸如關節炎的治療；慢性同種異體移植排斥；血管成形術；預防移植血管和胃腸出血。促生長素抑制素激動劑還可用於在患者中降低體重。
促生長素抑制素-28(SS-28)是由豬上部小腸分離的(L.Pradayrol等，FEBS Letters 10955-58，1980)。SS-28是SS-14的N端延伸形式，添加了額外14個胺基酸殘基，並且在體內施用時顯示一些升高的效力。
稱為SMS-201-995(奧曲肽)的環SS-14類似物，即D-Phe-c[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-ol，正在臨床上用於抑制某些腫瘤生長。這種類似物顯示改進了受治療受試者的生活質量，而且存在控制腫瘤生長和降低死亡率的有力證據。還開發了兩種類似的八肽類似物，即蘭瑞肽(D-β-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)和伐普肽(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2)，參閱Smith-Jones等，Endocrinology 1405136-5148，1999。已經開發了這些促生長素抑制素類似物，用於放射性成像或者在放射性核素療法中用作放射性藥物。為了放射性成像，可以如英國專利申請8927255.3中所公開的和Bakker等，J.Nucl.Med.321184-1189，1991中所述使用123I標記。通常，通過使用螯合劑來放射性標記蛋白質，而且存在用99Tc、99Y、或111In與促生長素抑制素類似物複合的多個實例，參閱美國專利號5,620,675和5,716,596。例如，奧曲肽閃爍顯像法是以奧曲肽結合受體的顯像為基礎的。出於這些目的，使用奧曲肽的放射性標記形式，諸如[123I-Tyr3]-奧曲肽。這種以及開發的其它類似物(蘭瑞肽(D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)；伐普肽c(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2)；AN-238，即與胞毒劑相連的RC-121(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2))是當前可用於抗癌戰場的軍火庫的一部分。
還揭示了促生長素抑制素激動劑可用於抑制幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的繁殖。
奧曲肽和其它臨床使用的SS-14類似物與三種受體亞型即SST2、SST3、和SST5發生重要的相互作用。已經報導了SST2和SST5介導SS-14對腫瘤細胞生長的抗增殖作用；因此，它們可能介導奧曲肽在人體中的臨床效果。例如，化合物RC-121不如天然SS-14和善得定有效，但是展示對受體SST2和SST5的選擇性結合的優勢(見例如表1)。
表1SS-14、善得定、和RC-121的結合親和力

本發明提供了與SST2和/或SST5發生選擇性相互作用的方法和組合物。認為對生長激素釋放的抑制是通過配體與SST2受體的相互作用介導的，或者SST2和SST5二者都參與其中。還認為與SST5的相互作用負責胰島素釋放抑制活性。由此，對這兩種受體或其中之一具有選擇性的類似物將可用於治療癌症和糖尿病等用途。
本發明提供了用酸性和鹼性殘基和/或肽模擬模塊(buildingblock)修飾末端殘基以改進效力、選擇性、和生物利用度的SS類似物。
本發明的SS-14類似物是在親本化合物RC-121(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)(SEQ ID NO11)的基礎上由於此親本化合物的結合特性而開發的。親本化合物具有針對SST2和SST5的選擇性(見例如表1)，但是從效力、生物結構域的穩定性、以及對SST2和SST5的效力比率的立場看，它的特性還可以改進。
本發明的SS-14類似物提供了數項誘人的特色，包括(1)類似物易於由商業性模塊快速合成；(2)設計用於提高生物利用度的肽模擬修飾(例如對-氨基-D-苯丙氨酸，(2-氨基-3-(4-氨基苯基)-丙酸)和3-碘代-酪氨酸，(2-氨基-3-(4-羥基-3-碘代苯基)-丙酸))；(3)設計用於比奧曲肽更加有效的在體外抑制生長激素的有力的且有選擇性的化合物(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2，奧曲肽在本文中用作參考化合物；和(4)類似物部分基於碘代芳基衍生物，使得這些化合物的放射性標記易於使用放射性碘來實現。這些分子有可能在惡性細胞的成像和根除中具有應用。
本發明提供了包含二硫鍵連接的八肽且摻入非天然胺基酸模塊的SS-14類似物。本發明提供了符合如下通式I的SS-14類似物X-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Y-NH2，其中X選自D-Phe、(4-氨基)-D-Phe、和(4-氨基-3-碘代)-D-Phe，Y選自L-或D-Thr和L-或D-Asp，且位於第3位的Tyr可以單或多碘化。表2提供了符合通式I的例示性肽結構。
表2

用於定義肽的命名法如M Goodman、A Felix、L Moroder、和CToniolo編，Synthesis of Peptides and Peptidomimetics，2003中所述，其中與傳統表述一致，氨基位於左邊而羧基位於右邊。當胺基酸殘基具有同分異構形式時，用於鑑別α-胺基酸殘基的標準3字母縮寫指L型胺基酸，除非另有明確指示，例如Ser＝L-絲氨酸。D，L指特定α-胺基酸的D-和L-異構體的混合物。
在另一個方面，本發明提供了包含有效量的通式(I)化合物或其製藥學可接受鹽和製藥學可接受載體的藥物組合物。
在還有一個方面，本發明提供了在有所需要的受試者中引發促生長素抑制素受體激動劑效應的方法，包括對所述哺乳動物施用有效量的通式(I)化合物或其製藥學可接受鹽。
在另一個方面，本發明提供了在有所需要的受試者中治療催乳素分泌性腺瘤、再狹窄、糖尿病、高脂血症、胰島素不敏感、X症候群、血管病、增殖性視網膜病、黎明現象、腎病、胃酸分泌、消化性潰瘍、腸皮膚和胰腺皮膚瘻管、腸應激症候群、傾倒症候群、水瀉症候群、AIDS相關腹瀉、化療誘發的腹瀉、急性或慢性胰腺炎、胃腸激素分泌性瘤、癌、肝癌、血管發生、炎性疾病、關節炎、慢性同種異體移植排斥、血管成形術、移植血管出血、或胃腸出血的方法，包括對受試者施用通式(I)化合物或其製藥學可接受鹽。
在另一個方面，本發明提供了在有所需要的受試者中抑制幽門螺桿菌繁殖的方法，包括對受試者施用通式(I)化合物或其製藥學可接受鹽。
治療有效量的本發明肽和製藥學可接受載體物質一起形成治療性組合物(例如丸劑、片劑、膠囊、或液體)，用於對需要所述肽的受試者進行施用(例如通過口、靜脈內、玻璃體內、經皮、肺、陰道、皮下、鼻、離子電滲、或氣管內)。可以用能夠在受試者的胃中保護組合物免於胃酸或腸酶作用達一段時間而足以容許組合物未經消化就進入受試者小腸的物質包被丸劑、片劑、或膠囊。治療性組合物還可以採用用於皮下或肌肉內施用的生物可降解或非生物可降解緩釋製劑的形式。還可以使用用於施用治療性組合物的可植入或外部泵來獲得連續施用。
本發明肽或治療性組合物用於治療上文所述疾病或紊亂的劑量隨著施用方式、受試者的年齡和體重、以及待治療受試者的狀況而變化，而且最終將由主治醫師或獸醫來決定。由主治醫師或獸醫決定的肽或治療性組合物的這種數量在本文中稱為「治療有效量」。
本發明的類似物肽與SST2和/或SST5的結合選擇性可以通過測試它們與克隆的五種不同人SS-14受體的相互作用來證明。本文描述了關於類似物結合多種促生長素抑制素受體亞型的能力的體外測定法，而且在本領域是知道的(參閱例如美國專利號6,602,849和美國專利號6,001,801，將其公開書收入本文作為參考)。一般而言，如本領域所知道的，在合適緩衝液中清洗表達受體的重組細胞並勻漿，以製備粗製蛋白質勻漿。在一個代表性測定法中，將來自細胞勻漿的一定量蛋白質置於小體積的合適pH的合適測定緩衝液中。向混合液中添加合適濃度的候選物質，諸如本發明的類似物，並且監測候選物質(例如本發明的類似物)與受體多肽之間的相互作用。本發明的肽設計成以高親和力充分結合某些SST亞型，諸如SST2和/或SST5。
可以在克隆的SS-14受體上進行受體結合測定法。可以使用這些測定法得到KD值，它指示佔據選定數量的受體等的半數(50％)結合位點所必需的配體濃度，或者可以使用競爭性測定法得到IC50值，它指示在50％的結合位點取代所測量目標配體的飽和濃度所必需的競爭性配體的濃度。
儘管奧曲肽的一種類似物已經通過使用正電子放射X線斷層攝影術用於檢測具有SS-14高表達的人體腫瘤，現有的SS-14類似物不能區分SST2、SST3、和SST5。比較而言，本發明的放射性標記SS-14類似物可用於類似目的，而且認為它們在鑑定表達SST2和/或SST5的腫瘤中特別有用，這些腫瘤隨後成為用胞毒劑和/或放射劑標記的本發明選擇性類似物進行治療的治療靶。
本發明的SS-14類似物(例如SEQ ID NO1-10)設計用於與SST2和/或SST5發生選擇性相互作用，而且可用於抗擊表達SST2和/或SST5的癌。它們還可用於閃爍顯像法，以測定大腦中以及內分泌和外分泌系統中表達SST2和/或SST5受體的細胞和組織的分布，而且還可用於鑑定這種受體在體內的選擇性功能。它們還可用於治療與表達SST2和/或SST5的組織有關的非腫瘤性疾病。
本發明還包括本發明的肽類似物(例如SEQ ID NO1-10)與胞毒藥物諸如紫杉醇或任何其它胞毒部分的組合。胞毒藥物可以通過共價鍵或物理封裝與類似物相連。
一般而言，SS-14類似物(例如SEQ ID NO1-10)是在固相肽合成儀上使用Fmoc化學合成的。意欲投遞至靶細胞的期望化合物，諸如抗癌藥物紫杉醇、多柔比星、或喜樹鹼等等，與間隔物(通常具有末端羧基)發生反應而形成共價鍵，得到藥物-間隔物複合物。然後將這種複合物與樹脂上的SS-14類似物肽的N末端偶聯而形成終產物，即藥物-間隔物-肽複合物。
可以以放射性標記或未標記形式使用本發明的化合物(例如包含SEQ ID NO1-10的肽類似物)，用於任何促生長素抑制素響應性疾病狀態的診斷或治療。本發明的化合物對於腫瘤性紊亂和腫瘤諸如例如神經內分泌腫瘤、垂體腺瘤、嗜鉻細胞瘤、副神經節瘤、甲狀腺髓樣癌、小細胞和非小細胞肺癌、星形細胞瘤、黑素瘤、腦脊膜瘤、乳房腫瘤、惡性淋巴瘤、腎細胞癌、前列腺腫瘤等等的診斷和/或治療特別有用。本發明的SS-14類似物還可用於診斷或治療其中出現血管發生並伴隨SST上調的病症。這些病症包括例如動脈硬化症和侵入性流程諸如血管成形術後動脈中發生的細胞增殖。
放射性標記的本發明SS-14類似物可用於這些診斷和治療。本發明類似物的放射性標記實施方案可用於放射性同位素指導的手術，如WO93/18797和Woltering等，Surgery 1161139-1147，1994中所述。在一個實施方案中，將放射γ的放射性核素與本發明類似物的複合物用於診斷表達SST的腫瘤，隨後將放射β的放射性核素諸如188Re或186Re與本發明類似物的複合物用於治療腫瘤。其它治療性放射性核素標記物包括胞毒性放射性同位素，諸如鈧-47、銅-67、鎵-72、釔-90、碘-125、碘-131、釤-153、釓-159、鏑-165、鈥-166、鐿-175、鑥-177、錸-186、錸-188、砹-211、和鉍-212。
出於診斷性目的，施用診斷有效量的放射性標記的本發明類似物，通常通過靜脈內施用。診斷有效量定義為使用常規方法學諸如磁共振、計算機化X線斷層攝影術、伽馬閃爍掃描法、SPECT、PET等等在體內實現標記物的定位和檢測所必需的放射性標記類似物的數量。
在使用閃爍掃描成像進行診斷時，通常以一個單位的可注射劑量施用放射性標記的本發明類似物。可以在用於靜脈內注射的任何常規介質諸如鹽水介質或血漿介質中靜脈內施用由本發明提供的經標記的類似物。一般而言，將施用的單位劑量含有約0.01mCi-約100mCi的放射性，通常是1mCi-50mCi。將以單位劑量注射的溶液是約0.01m1-10ml。靜脈內施用後，可以在幾分鐘內取得體內成像。然而，如果需要，可以在將放射性標記化合物注射到受試者體內後數小時甚至更長時間進行成像。在大多數情況中，在約0.1小時內在待成像區域中將積累足夠數量的施用劑量，從而容許獲得閃爍照片。可以依照本發明利用用於診斷目的的閃爍掃描成像的任何常規方法。
在將放射性標記的本發明化合物用於治療目的時，將它們用治療有效量的胞毒性放射性同位素進行放射性標記，通常是188Re。依照本發明，治療有效量的胞毒性放射性同位素指藥物組合物或方法的每一種活性成分的總量足以顯示對受試者有意義的益處，例如歸咎於促生長素抑制素響應性疾病狀態之症狀的發生頻率或嚴重程度與預期作為可比組的未接受本發明放射性治療性試劑的受試者相比降低。在將活性成分單獨應用於個體時，該術語單獨指該成分。在聯合應用時，該術語指活性成分產生治療效果的聯合量，無論是聯合、連續、或同時施用。出於本發明的目的，放療涵蓋任何治療性效果，包括由疼痛減輕至腫瘤消退或與所治療的特定促生長素抑制素響應性疾病有關的症狀消除。
在用於放療時，將本發明SS-14類似物與胞毒性放射性同位素的複合物施用於需要治療促生長素抑制素響應性疾病或紊亂的受試者，通常是哺乳動物，包括人。在本發明的放療方法中，可以通過任何合適的臨床路徑施用數量為約5mCi-約200mCi的胞毒性放射性同位素，通常是靜脈內注射或腫瘤內注射。本發明的放療複合物可以任選聯合化療藥物進行施用，諸如它莫西芬、順鉑、紫杉醇、抗血管發生化合物等等。
在將未標記化合物用於促生長素抑制素響應性疾病或紊亂的治療時，SS-14類似物的施用通常是腸胃外，更常用的是靜脈內。為了治療促生長素抑制素響應性疾病或紊亂而施用的未標記SS-14類似物的數量將取決於所治療病症的本質和嚴重程度以及受試者先前接受的治療的本質。最終，主治醫師將決定治療每一位受試者個體的SS-14類似物的數量。首先，主治醫師將施用低劑量的SS-14類似物，並觀察受試者的反應。可以施用更大劑量的SS-14類似物，直至對受試者得到最佳治療效果，此時不再增加劑量。預期在本發明治療性方法中施用未標記SS-14類似物的劑量應當在約0.1μg-約100μg化合物/kg體重的範圍內。更常見的是，在本發明的治療性方法中施用未標記SS-14類似物的劑量在約0.1μg-約100μg SS-14類似物/kg體重的範圍內。本發明的未標記SS-14類似物還可以任選聯合化療藥物進行施用。
治療的持續時間將根據所治療疾病的嚴重程度以及每一位受試者個體的狀況和特異反應而變化，無論是包含本發明SS-14類似物的放射性藥物還是未標記的本發明SS-14類似物。預期每次施用本發明放射性藥物的持續時間將在連續靜脈內施用約1-約120分鐘的範圍內。預期每次施用未標記的本發明SS-14類似物的持續時間將在連續靜脈內施用約1-約120分鐘的範圍內。最終，主治醫師將決定使用經標記或未標記的本發明化合物進行靜脈內治療的合適持續時間，無論是單獨施用還是聯合其它藥物。
依照本發明的一個方面，與製藥學可接受載體一起提供包含一種或多種本發明SS-14類似物(例如SEQ ID NO1-10)的製劑。該製劑在約10μg/kg體重-約60μg/kg體重的範圍內提供了本發明SS-14類似物的活性劑量；通常是約10μg/kg體重-約20μg/kg體重。
表述「製藥學可接受的」意圖包括這樣的成分，它既與本發明SS-14類似物相容，對接受製劑的受試者例如人而言又是生理學可接受的，不產生令人不快的生理學效果，諸如噁心、頭暈、胃部不適等等。依照本發明使用的組合物可以包含一種或多種下文所列載體、賦形劑、和/或稀釋劑。
依照本發明的一個方面，提供了在用於治療、預防、或處理腫瘤細胞相關疾病的藥物中包含一種或多種本發明SS-14類似物的配方。
依照本發明的一個方面，提供了用於治療患有腫瘤細胞相關疾病的人或非人動物的方法，包括施用包含本發明SS-14類似物(例如包含SEQ ID NO1-9和/或10的類似物)的製劑的步驟。腫瘤細胞相關製劑可以是例如結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、胰腺中的癌。
可以治療的非人動物通常包括哺乳動物，特別是牲畜和家畜，諸如狗、貓、兔、豚鼠、倉鼠、小鼠、大鼠、馬、山羊、綿羊、豬、和牛。
根據施用的模式，可以使用多種形式的組合物。由此，可以使用易於獲得的成分以常規方式配製藥物組合物。可以摻入包含肽類似物SEQ ID NO1-10的活性成分，任選連同其它活性物質，以及一種或多種常規載體、稀釋劑、和/或賦形劑，以生成常規製劑，諸如片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小藥囊、糯米紙包劑、酏劑、懸浮液、乳狀液、溶液、糖漿劑、氣霧劑(作為固體或在液體介質中)、油膏、軟的和硬的明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、無菌包裝粉劑等等。
合適載體、賦形劑、和稀釋劑的實例是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃芪膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、water syrup、水、水/乙醇、水/二元醇、水/聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素、羥基安息香酸甲酯、羥基安息香酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油、或脂肪物質諸如硬脂或其合適混合物。組合物可以額外包含潤滑劑、溼潤劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、芳香劑等等。通過採用本領域眾所周知的流程，可以將本發明的組合物配製成在施用於患者後提供活性成分的快速、持續、或延遲釋放。組合物可以是合適的劑量形式，例如乳劑或是在脂質體、niosome、微球體、納米微粒等等中。
可以通過任何常規路徑進行組合物在本發明用途中的施用，例如吸入、口服、直腸、或腸胃外，諸如肌肉內、皮下、關節內、顱內、皮內、眼內、腹膜內、鞘內、靜脈內注射，儘管這取決於待治療的病症。甚至可以直接對患病部位進行注射(例如通過立體定位注射)。還可以進行局部施用，例如在患病部位，例如通過使用導管或注射器。對於合適的病症而言，通過對皮膚局部應用組合物例如油膏來進行治療也是可能的。任選的是，可以以一定間隔進行施用，例如2次或更多次應用，例如以小時、天、周、或月為間隔的2-4次應用，例如每天、或每3-5天、或以兩周、月、或季為間隔的幾次。
組合物中存在的本發明SS-14類似物以重量計佔製劑的約0.01％-約99％，通常是約0.1-約50％，例如10％。組合物可以配製成單位劑量形式，例如每個劑量含有約0.01mg-約1g活性成分，例如對人而言是0.05mg-0.5g，例如1-100mg。待施用的活性化合物的精確劑量和療程的長度當然將取決於許多因素，包括例如受試者的年齡和體重、需要治療的具體病症及其嚴重程度、以及施用的路徑。然而，一般而言，根據待治療的受試者和劑量形式，作為單一劑量的有效劑量可能在約10μg/kg體重-約60μg/kg體重的本發明SS-14類似物的範圍內，通常是約10μg/kg-約20μg/kg每天。由此，例如，對於成年人的合適每日劑量可能是每天0.5mg-2g，例如每天1.0-500mg本發明SS-14類似物。
可以使用任何多種本領域已知技術來生產本發明的肽。可以通過合適方法來合成肽，諸如完全固相技術，部分固相技術，通過片段縮合，或通過經典的溶液加成。例如，許多教科書中闡述了完全固態合成的技術，包括例如Solid-Phase Peptide Synthesis，Stewart和Young，Freeman Co.，舊金山，1969。合成的片段縮合法例示於美國專利號3,972,859(1976年8月3日)。其它可用的合成方法例示於美國專利號3,842,067(1974年10月15日)和美國專利號3,862,925(1975年1月28日)。
偶聯型合成中共同的是用合適的保護基團保護多種胺基酸部分中不穩定的側鏈基團，這將預防該位點發生化學反應直至最終除去所述基團。通常，共同的還有在將胺基酸或片段的羧基基團進行反應時保護該實體的α-氨基基團，隨後選擇性除去α-氨基保護基團以容許該位置進行後續反應。因此，共同的是，作為合成的一個步驟，生成了中間化合物，其肽鏈中每一胺基酸按其所需的順序排列，並且這些殘基中的多個與副反應保護基團相連。
典型的保護基團、偶聯劑、試劑、和溶劑，諸如但不限於下文所列，在用於本文和權利要求書時具有如下縮寫。本領域技術人員理解每一組中所列化合物可以互換使用。另外，本領域技術人員知道其它可能的保護基團、偶聯劑、和試劑/溶劑；這些也意欲包括在本發明的範圍之內。
縮寫名稱 保護基團Ada 金剛烷乙醯基Alloc 烯丙基氧羰基Allyl 烯丙酯Boc 叔丁基氧羰基Bzl 苄基Fmoc 芴甲氧羰基OBzl 苄酯OEt 乙酯OMe 甲酯Tos(Tosyl)對甲苯磺醯Trt 三苯甲基Z 苄基氧羰基縮寫名稱 偶聯劑BOP 苯並三唑-1-基-氧三-(二甲基-氨基)六氟磷酸鹽DIC 二異丙基碳二亞胺HBTU 2-(1H-苯並三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子(tetramethyluronium)
六氟磷酸鹽PyBrOP 溴三吡咯烷六氟磷酸鹽PyBOP 苯並三唑-1-基-氧-三-吡咯烷六氟磷酸鹽TBTUO-(1，2-二氫-2-氧-1-吡啶基)-N，N，N′，N′-四甲基脲陽離子四氟硼酸鹽縮寫名稱試劑和溶劑ACN 乙腈Ac2OH 乙酸Ac2O 乙酸酐AdacOH 金剛烷乙酸Alloc-Cl烯丙基氧羰基氯Boc2O 二叔丁基碳酸氫鹽DMA 二甲基乙醯胺DMF N，N-二甲基甲醯胺DIEA二異丙基乙胺Et3N 三乙胺EtOAc 乙酸乙酯FmocOSu 9-芴甲氧羰基N-羥基琥珀醯亞胺酯HOBT1-羥基苯並三唑HF 氫氟酸MeOH甲醇Mes(Mesyl) 甲磺醯NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮nin.茚三酮i-PrOH 異丙醇Pip 哌啶PP 4-吡咯烷吡啶
Pyr吡啶SRIF 生長激素釋放抑制因子SST促生長素抑制素受體TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氫呋喃Triflate(Trf) 三氟甲磺醯Trf2O 三氟甲磺酸酐本文所述化合物可以具有不對稱中心。本發明包括所有手性的、非對映異構的、和外消旋的形式。本文所述化合物中還可以存在烯烴等的許多幾何學異構體，而且本發明涵蓋所有這些穩定的異構體。
通過固相技術使用Rink-醯胺MBHA樹脂作為固相支持物合成了幾種八肽。一般而言，通過Fmoc策略裝配線性肽序列，並且採用HBTU/HOBt/DIEA或PyBOP/HOBt/DIEA作為偶聯劑。環化是用過量的碘在DMF中進行的。然後使用由TFA、水、和苯甲醚組成的切割混合物由樹脂上切下肽，同時將側鏈脫保護。可以通過任何常規技術純化肽，包括例如RP-HPLC，並通過分析性HPLC和MALDI-FTMS進行鑑定。
可以通過經典的溶液合成法來合成本發明的SS-14類似物，但是通常通過固相技術來合成。可以使用氯甲基化樹脂或羥甲基化樹脂。例如，通常如1989年3月28日發布的美國專利號4,816,438(將其公開書收入本文作為參考)中所傳授的合成含有C末端游離羧基的這些肽。固相合成是以從C末端開始逐步添加鏈中胺基酸的方式進行的。本領域眾所周知的側鏈保護基團包括在內，作為具有特定反應性側鏈的任何胺基酸的一部分，而且任選可以用於其它情況，諸如Trp，此時將這些胺基酸偶聯到樹脂上正在構建的鏈上。這種合成法提供了完全受保護的中間產物肽樹脂。通常使用基於Rink醯胺的樹脂。Rink醯胺AM樹脂和Rink醯胺MBHA樹脂是用於通過Fmoc化學合成肽醯胺的最受歡迎的樹脂。可以使用固相肽合成法的相同方案實現第一個Fmoc胺基酸與樹脂的偶聯。可以以單一步驟通過95％TFA和合適清除劑的處理來實現肽醯胺與這些支持物的分離。由此，可以在體外化學合成本發明的促生長素抑制素類似物。另外，可以合成本發明的SS-14類似物，其中使用本領域技術人員眾所周知的技術在體外化學合成過程中將放射性標記-結合部分與肽共價相連。在合成過程中與放射性標記-結合基團共價相連的這些肽是有利的，因為限定了共價連接的特定位點。
上文已經描述了本發明，提供下文具體實施方案是為了進一步闡明本發明。下文具體實施例並非意圖限制本發明的範圍。
實施例肽的合成合成下列肽(經過修飾的殘基以粗體顯示)1.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH22.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH23.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH24.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH25.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH26.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH27.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH28.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH29.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH210.D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2使用了如下符號「(4-氨基)-D-Phe」指(4-氨基苯基)-D-苯丙氨酸，即2-氨基-3-(4-氨基苯基)-丙酸；「(3-碘代)-Tyr」指(4-羥基-3-碘代苯基)-L-酪氨酸，即2-氨基-3-(4-羥基-3-碘代苯基)-丙酸；和「(4-氨基-3-碘代)-D-Phe」指(4-氨基-3-碘代苯基)-D-苯丙氨酸，即2-氨基-3-(4-氨基-3-碘代苯基)-丙酸。
使用了如下受到保護的胺基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-AsD(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、和Boc-D-Phe-OH可以由Merck(達姆施塔特，德國)的Calbiochem-Novabiochem部門獲得。有些試劑(偶聯劑HBTU和DIC、H-(3-碘代)-Tyr-OH、Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH)購自Chem-ImpexInternational(伍德戴爾，伊利諾斯州)，只是Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH購自Bachem(託蘭斯，加利福尼亞州)。DMF購自FisherScientific，並用購自Sigma的矽酸鋁鈉分子篩(孔徑標稱4)和強酸性的Amberlite IR120(plus)陽離子交換樹脂進行處理。由鈣氫化物蒸餾二氯甲烷(DCM)。Rink醯胺MBHA樹脂和PyBOP購自Calbiochem-Novabiochem(Merck，達姆施塔特，德國)。通過在包被在鋁片(0.2mm厚，60F254)上的EM Science Merck矽膠上進行的薄層層析(TLC)監測反應，使用紫外線(254nm)作為顯色劑，並將10％溶於乙醇的茚三酮、溶於乙醇的溴甲酚綠、或7％溶於乙醇的磷鉬酸以及加熱作為顯影劑。將購自EM Science的矽膠60(230-400目)用於柱層析。
使用Kaiser測試作為固相反應過程中是否存在游離氨基基團的定性測定法。
使用取代水平0.54mmol/g的Rink醯胺MBHA樹脂，通過手工固相合成法構建肽。所用激活/偶聯劑是PyBOP∶HOBt∶DIEA(4∶4∶8eq)或HBTU∶HOBt∶DIEA(4∶4∶8eq)。所有偶聯和脫保護在DMF中進行。通常，為了偶聯第一個胺基酸，使用5個當量，並反應過夜完成偶聯。此後，使用4個當量的商業性受保護胺基酸，而偶聯反應的時間是4-8小時，胺基酸之間容許反應性差異。為了偶聯半胱氨酸，選擇不涉及使用鹼基的激活/偶聯方法，即溶於DCM/DMF 1/1(體積)混合物的DIC∶HOBt1∶1(mmol)，從而將差向異構降至最低。反應時間是約2小時。
首先將樹脂在DCM中膨脹至少30分鐘。樹脂上Fmoc基團的脫保護和整個合成是在20％溶於DMF的哌啶中完成的。脫保護後，將肽-樹脂用DMF清洗2次，每次1分鐘；然後用DCM清洗2次，每次1分鐘；再然後再次用DMF清洗2次，每次1分鐘。偶聯後，用DMF清洗4次，隨後用DCM清洗2次，然後是用MeOH清洗2次，用DCM清洗2次，和再次用DMF清洗4次。有時要重複進行清洗過程。
環化是通過在過量的溶於DMF(20ml)的I2(10eq)中反應3小時實現的。然後將肽-樹脂用DMF清洗10次或更多，直至由反應容器流出的溶劑變得清澈。為了徹底清除痕量的碘，在THF清洗後，進行0.5MNa2S2O3漂洗，隨後是DCM、MeOH、DCM、THF、和DMF清洗。最後，將肽-樹脂用DCM漂洗2次，並在乾燥器中在高度真空下乾燥，以通過升華徹底清除任何痕量的碘。
為了最後的脫保護及同時由樹脂上切下最後的肽，使用由9.5mlTFA、0.25ml H2O、和0.25ml苯甲醚組成的混合液。水和苯甲醚是清除叔丁基陽離子的合適清除劑，否則叔丁基陽離子會攻擊芳香族殘基。在冰中分別冷卻「清除混合液」和肽-樹脂，然後將溶液加到樹脂上，並將容器於室溫搖動恰好1小時。通過過濾除去液相，並將樹脂用純的TFA清洗5次。將收集的含有目標肽之TFA鹽形式的濾出液弄乾，並通過3次與甲苯的共沸蒸餾來清除痕量的TFA。將粗製的肽在冰浴中冷卻，並添加冷的乙醚。形成白色沉澱，用乙醚清洗，通過離心分離，溶於水，並將水溶液凍幹過夜。所有粗製的肽通過HPLC顯示一個主峰。
胺基酸模塊的合成Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH可以通過商業途徑獲得。
肽模擬的胺基酸H-(3-碘代)-酪氨酸(10)可以通過商業途徑獲得。將它轉變成Fmoc-(3-碘代)-酪氨酸(11，方案1)。反應在存在10％NaHCO3時進行過夜。

方案1Fmoc-(3-T)-Tyr-OH(11)的合成Fmoc-(3-碘代)-酪氨酸(11)向H-(3-碘代)-Tyr-OH(1.00g，3.26mmol)中添加7ml DMF和10ml丙酮，並將懸浮液在冰浴中冷卻至0℃。10分鐘後，逐滴添加10％NaHCO3(w/v)(7ml，8.15mmol)，隨後是FmocOsu(1.32g，3.91mmol)。再添加25ml DMF，並將乳狀懸浮液於室溫劇烈攪動過夜。(注意起始材料不溶於水、DMF、THF、二烷、乙腈、丙酮、CHCl3、和DCM)。在低壓下除去溶劑，並添加25ml水。將水用EtOAc(5ml)抽提一次，以除去不溶於水的雜質。在冰浴中冷卻水層，用2N NaHSO4酸化至pH約1，並用EtOAc(5×5ml)抽提5次。然後將EtOAc層用飽和NaCl清洗兩次，在Na2SO4上乾燥，過濾，並濃縮，產生清澈的油。將它在真空歧管上乾燥過夜，變成白色泡沫固體。添加氯仿(50ml)，形成白色沉澱。將沉澱(產物)在布氏漏鬥上過濾，並乾燥過夜，得到1.41g(82％)。
1H NMR(DMF，400MHz)δ(ppm)7.87(d，J＝8Hz，2H)，7.63(t，J＝8Hz，2H)，7.57(s，1H)，7.39(m，2H)，7.33(m，2H)，7.06(d，J＝8Hz，1H)，6.77(d，J＝8Hz，1H)，4.18(m，3H)，4.02(m，1H)，2.94(dd，J1＝16Hz，J2＝4Hz，1H)，2.72(dd，J1＝16Hz，J2＝12Hz，1H)MSESI(m/z)為C24H20NO5I計算[MH]+，預期530，實測530；[M+Na]+，預期552，實測552；[M-H]-，預期528，實測528。
D25＝+9.04°(c＝0.88，MeOH)TLC(CHCl3∶MeOH∶AcOH 90∶10∶1，溴甲酚綠)，Rf＝0.33為了製備受保護的單碘化胺基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12，方案2)，使用「經典的」碘化劑氯化碘ICl，執行一個簡單流程。

方案2Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)的合成Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)向100ml圓底燒瓶中加入Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH(300mg，1.070mmol)和5ml冰乙酸。用鋁箔包裹燒瓶。攪拌中，逐滴加入ICl(174mg，1.070mmol)，並立即將燒瓶封蓋。將反應混合液攪動10分鐘。添加過量的0.5NNa2S2O3終止反應，並淬滅剩餘未反應的碘(溶液由褐色變成淺黃色)。添加乙酸乙酯和水，並分層。將水層用乙酸乙酯反萃取兩次。再用0.5NNa2S2O3(3×5ml)和飽和NaCl(3×5ml)清洗合併的有機層，在Na2SO4上乾燥，並過濾。濃縮濾出液，並將殘餘物在真空歧管上乾燥。通過柱層析純化粗品，使用EtOAc∶己烷∶AcOH 5∶5∶0.1(ml)作為洗脫液，得到118.4mg產品(27％)。將一部分產品通過HPLC進一步純化並凍幹，得到作為分析的樣品(略帶黃色的固體)。
1H NMR(DMSO，400MHz)δ7.46(s，1H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H)，6.99(d，J＝8Hz，1H)，6.73(d，J＝8Hz，1H)，3.96(m，1H)，2.83(dd，J1＝16Hz，J2＝4Hz，1H)，2.63(dd，J1＝16Hz，J2＝12Hz，1H)，1.33(s，9H)13C NMR(DMSO，400MHz)δ173.4，155.1，146.6，138.5，129.6，127.3，113.9，82.9(C-I)，77.9，55.4，34.9，28.2MSESI(m/z)為C14H19N2O4I計算[MH]+，預期407，實測407；[M+Na]+，預期429，實測429；[M-H]-，預期405，實測405。MALDI-FTMS[M+Na]+，預期429.0282，實測429.0290。
m.p.68-80℃(有分解)[α]D25＝-27.5°(c＝1，MeOH)(起始材料[α]D25＝-26.9°，c＝1，MeOH)TLC(EtOAc∶己烷∶AcOH 5∶5∶0.1ml，茚三酮)Rf＝0.36分析性HPLC樣品濃度1mg/ml，注射量10μl，10-90％B(A含0.1％TFAv/v的H2O；B含0.1％TFAv/v的AcCN)，流速1ml/min，時間30min，λ＝220nm，Rt＝18.81min。起始材料在相同條件下展示Rt＝12.16min。
Boc保護基團在所述反應條件下繼續存在。得到二碘化Boc-(4-氨基-3，5-二碘代)-D-Phe-OH作為次要產物(在進行反應的一次實例中，單碘化∶二碘化的比例是大約2∶1)。通過柱層析分離混合物(單碘化化合物的產量是50％)。然後將模塊摻入具有無保護芳香族胺的肽結構，因為這種胺對醯胺鍵形成反應的反應性低得多。
肽的合成依照Fmoc方案，通過固相肽合成法(SPPS)合成肽醯氨。使用Rink醯胺MBHA樹脂作為固相支持物。可以通過單一步驟的95％TFA處理，實現由該樹脂上切下醯胺，提供較高的產量和純度。
Rink醯胺MBHA樹脂的結構使用了如下受到保護的胺基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Boc-D-Phe-OH、和Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH，以及如本文所述製備的不常用的碘化胺基酸Fmoc-(3-碘代)-Tyr-OH和Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH。
所用偶聯劑包括PyBOP或HBTU連同HOBt和DIEA。當側鏈受保護肽在樹脂上時，通過與DMF中過量碘的反應而形成二硫鍵。在這種情況中，碘行使除去Acm保護基團的功能，並氧化游離-SH基團而形成二硫鍵。
方案3、4、5、和6展示了少數例示性實施例，而且本文給出了詳細流程。
方案3詳述了肽2的合成。將受Fmoc保護樹脂在DCM中膨脹，並使用20％哌啶/DMF使Fmoc基團脫保護。使用胺基酸與HBTU、HOBt、和DIEA(4∶4∶2∶8eq，相對於理論樹脂負載0.54mmol/g)的預活化(2分鐘)混合物來偶聯第一個胺基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH。使用Fmoc方案來添加剩餘胺基酸。使用溶於DMF的DIC∶HOBt(1∶1mmol)來導入最後一個胺基酸Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH。然後將線性的受保護肽在樹脂上用過量的碘(5eq)環化3小時。用20％溶於DMF的哌啶除去側鏈Fmoc。通過TFA∶H2O∶苯甲醚(95∶2.5∶2.5％)處理，由樹脂上切下環肽，伴隨著清除剩餘保護基團Boc和叔丁基。通過RP-HPLC純化肽。

方案3肽2即(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2的固相合成方案4圖解了肽5的合成。由樹脂上除去原有的Fmoc保護基團後，使用溶於DMF的PyBOP/HOBt/DIEA(4∶2∶8eq，相對於理論最大負載)將第一個胺基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH(4eq)偶聯到樹脂上。使用相同偶聯混合液偶聯Fmoc-(3-I)-Tyr-OH過夜。如上所述使用DIC/HOBt偶聯最後一個胺基酸Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH。用碘實現環化。如上所述進行剩餘步驟。
方案4肽5即(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的固相合成方案5圖解了肽6的合成。如上所述偶聯第一個胺基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH。使用溶於DMF的DIC∶HOBt(1∶1eq)將最後一個胺基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)偶聯到肽鏈上10小時。將肽用碘環化，徹底清洗，並由樹脂上切下，伴隨著清除保護基團。
方案5肽6即(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的合成方案6圖解了肽8的合成。如上所述偶聯第一個胺基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH。如上所述還導入了Fmoc-(3-I)-Tyr-OH。使用溶於DMF的DIC∶HOBt(1∶1eq)將製備的具有游離側鏈胺的最後一個胺基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)偶聯到肽鏈上9小時。將肽用碘環化，徹底清洗，並由樹脂上切下，伴隨著清除保護基團。
方案6肽8即(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的固相合成(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(1)是如上所述通過手工SPPS在Rink醯胺樹脂(s.1.0.54mmol/g)上合成的，0.2mmol規模，228mg粗品產量。將一部分產品純化，使用25％B，於λ280nmUV檢測，產生16.9mg純的肽。分析條件如下梯度10-90％B，Rt＝14.33min；等度26％B，Rt＝11.13min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H68N12O10S2計算[MH]+，預期1061.4695，實測1061.4733。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(2)是如上所述通過手工SPPS在Rink醯胺樹脂(0.54mmol/g)上合成的，0.37g，0.2mmol規模，粗品產量143.8mg(67％)。將一部分肽(40mg)純化，使用25％B等度，於λ280nm檢測UV，產生13.3mg純的肽。分析條件如下梯度10-90％B，30min，Rt＝17.12min；等度26％B，Rt＝8.72min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H66N12O11S2計算[MH]+，預期1075.4488，實測1075.4448。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2(3)是如上所述合成的，0.1mmol規模，得到115mg粗品。使用等度條件23％B進行一部分物質的純化，於λ220nmUV檢測，得到了5mg純的產品。分析條件如下梯度10-90％B，30min，Rt＝13.58min；等度20％B，Rt＝11.59min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H68N12O10S2計算的[MH]+，預期1061.4695，實測1061.4650。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2(4)是如上所述在Rink醯胺MBHA樹脂(0.54mmol/g)上手工合成的，0.19g，0.1mmol規模，得到了88.9mg(82％)。使用等度條件20％B純化一部分肽，於λ220nmUV檢測，得到了6.16mg純的肽。分析性HPLC條件如下梯度10-90％B，30min，Rt＝13.59min；等度20％，Rt＝11.26min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H66N12O11S2計算[MH]+，預期1075.4488，實測1075.4492。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(5)是通過手工SPPS合成的，0.2mmol規模，0.37g樹脂。將Fmoc-(3-I)-Tyr-OH(11)(0.26g，0.5mmol，2.5eq)、PyBOP(0.26g，0.5mmol，2.5eq)、HOBt(0.07g，0.5mmol，2.5eq)、和DIEA(0.17ml，1.0mmol，5eq)在DMF(20ml)中混合，並加到脫保護肽-樹脂上。由此得到的混合液是乳白色的，因為胺基酸並非完全可溶。儘管存在這個問題，然而這種模塊的偶聯是成功的。將樹脂由反應容器轉移到閃爍瓶中，並將偶聯進行過夜。由閃爍瓶中取出樹脂，在布氏漏鬥上用DMF和DCM清洗數次，然後轉移回到反應容器中用於後續偶聯。使用Kaiser測試來評估反應的完成情況，並用DMF(4×20ml)和DCM(2×20ml)和DMF(4×20ml)再次清洗樹脂。照常繼續肽鏈的構建。添加的最後一個胺基酸是在存在PyBOP(0.42g，0.5mmol，2.5eq)、HOBt(0.12g，0.5mmol，2.5eq)、和DIEA(0.21ml，0.5mmol，5eq)時在20ml DMF中預活化的Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH(0.25g，0.5mmol，2.5eq)。這個殘基偶聯18小時。為了環化，只使用5eq碘(0.25g，1.0mmol)達3小時，以預防芳香族殘基的碘化。然後如一般流程和注意一節中所述徹底清洗肽-樹脂，並在乾燥器中在高度真空下乾燥2小時以消除最小痕量的碘。使用20％溶於DMF的哌啶除去側鏈Fmoc保護基團達1小時。徹底清洗肽-樹脂，並在乾燥器中乾燥過夜，為最後的脫保護/切除樹脂做準備。TFA/H2O/苯甲醚(9.5/2.5/2.5ml)的最後處理和常規工作產生237.7mg粗製肽(定量的)。使用等度條件25％B純化一部分(23mg)粗製產品，於λ210nm和220nmUV檢測，產生了8.1mg純的產品。分析條件如下梯度10-90％B，30min，Rt＝18.04min；等度26％B，Rt＝16.45min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H67IN12O10S2計算[MH]+，預期1187.3662，實測1187.378；計算[M+Na]+，預期1209.3481，實測1209.3533。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(6)是如上所述構建的，0.2mmol規模，但是只使用90mg肽-樹脂來偶聯最後一個胺基酸。偶聯混合液在10ml DMF中含有Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)(0.044g，0.11mmol，1.5eq)、DIC(0.017ml，0.11mmol，1.5eq)、和HOBt(0.017g，0.11mmol，1.5eq)，並容許反應進行10小時。用碘(0.16g，2.0mmol，10eq)進行環化達3小時，如上文關於5所述小心清洗並乾燥肽-樹脂。在1小時中完成最後的脫保護/切割流程，並且在凍幹後得到30.6mg(53％)粗製的肽。以等度模式用24％B完成純化。產量是9.9mg(13％，根據樹脂的理論負載水平)。分析性HPLC梯度10-90％B，於λ220nmUV檢測，Rt＝18.9min；等度25％B，Rt＝9.32min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H67IN12O10S2計算[MH]+，預期1187.3662，實測1187.3689；[M+Na]+，預期1209.3481，實測1209.3470。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(7)是以與化合物6相同的方式合成的。將一部分(90mg)肽-樹脂用於偶聯最後一個模塊，得到19.4mg(37％)粗製的肽。用24％B純化肽，於λ220nmUV檢測。產量是4.1mg(7％)。分析性HPLC梯度10-90％B，30min，Rt＝18.74min；等度22％B，Rt＝10.65min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H65IN12O11S2計算[MH]+，預期1201.3454，實測1201.3542；[M+Na]+，預期1223.3274，實測1223.3296。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(8)是如上所述合成的，使用90mg肽-樹脂。如上所述進行非常用模塊的偶聯。粗品的產量是41mg(64％)。用30分鐘的25-50％B進行純化，於λ220nmUV檢測。產量是4.1mg(7.4％)。分析條件如下梯度10-90％B，30min，Rt＝20.4min；等度25％，Rt＝16.77min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H66I2N12O10S2計算[MH]+，預期1313.2628，實測1313.2644；[M+Na]+，預期1335.2448，實測1335.2471。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(9)是如上所述通過手工SPPS合成的，得到了38.7mg(60％)粗品。純化條件如下25-40％B，30min，於λ220nmUV檢測。產量是5mg(7.8％)。分析條件如下梯度10-90％B，40min，Rt＝17.62min；等度25％B，Rt＝10.41min。MALDI-FTMS(m/z)為C50H64I2N12O11S2計算[MH]+，預期1327.2421，實測1327.2423；[M+Na]+，預期1349.224，實測1349.2274。
使用Vydac Protein Peptide C18柱通過RP-HPLC純化和分析目標分子。分析用柱的尺寸是4.5×250mm(90矽石，5μm)，而製備性HPLC是22×250mm(90矽石，10μm)。檢測220nm(在有些情況中是280nm)的UV吸光度。整個過程使用水(A)和乙腈(B)的二元系統，二者都含有0.1％TFA。在兩臺不同儀器上進行製備性HPLC，流速10ml/min。一臺儀器是由兩個Waters 510泵和一臺雙波長UV吸光度檢測儀組成的系統。如下文所述還用於分析目的的另一臺儀器是Waters Millenium2010系統，由兩個Waters 510泵、一個715Ultra WISP樣品注射器、和一臺996光電二極體陣列檢測儀(PDA)組成，由NecStar PC兼容計算機運作。在Waters Millenium PDA系統上得到純化合物的兩份分析性HPLC圖譜，其中使用常用的30分鐘的溶於水(A)的10-90％乙腈(B)線性梯度和流速1ml/min的等度洗脫。
在Varian HG-400(400MHz)和Bruker AMX 500(500MHz)分光計上得到NMR光譜。化學位移(δ)表述成相對於作為內部參考的殘餘不合氘溶劑的每百萬份數(ppm)。使用如下縮寫來解釋峰裂數s＝單峰，d＝雙峰，t＝三峰，q＝四峰，dd＝雙重雙峰，m＝多峰，b＝寬。
在Perkin-Elmer 241旋光計上記錄旋光度。
在Nicolet-Magna-IR 550Series II分光計上記錄IR光譜。質譜分析(ESI，MALDI-FTMS)是由Scripps研究院(拉霍亞，加利福尼亞州)的Scripps Center for Mass Spectrometry進行的。
構象分析-NMR和分子建模研究。通過DMSO中500MHz的1D和2D1HNMR確認了所有化合物的結構。
NMR光譜學。將樣品溶於DMSO-d6。在以500MHz運行的Bruker AMX500分光計上得到NMR光譜，並使用FELIX2000(Biosym/MSI公司)進行加工。
表3和4(化學位移)、表5和6(相關主鏈NOE)、以及表7和8(偶聯常數JNH-CαH、計算的φ角、偶聯常數JCαH-CβH1/JCαH-CβHh、計算的側鏈群、和溫度係數)列出了1H NMR數據。注意如下符號CαH和Hα可互換使用，指與αC原子相連的質子。Hα3指與殘基3的αC原子相連的質子。下標1和h分別指低場和高場共振。
表3化合物1、3、5、8、10的化學位移

表4化合物2、4、6、7、9的化學位移

表5化合物1、2、3、4、和5的觀測到的主鏈NOEa

a與距離≤2.5對應的NOE歸類為強(s)；與距離＞2.5且≤3.5對應的NOE歸類為中(m)；與距離＞3.5且≤4.5對應的NOE歸類為弱(w)。
表6化合物6、7、8、9、和10的觀測到的主鏈NOE

a與距離≤2.5對應的NOE歸類為強(s)；與距離＞2.5且≤3.5對應的NOE歸類為中(m)；與距離＞3.5且≤4.5對應的NOE歸類為弱(w)。
表7化合物1、2-5中醯胺質子b的偶聯常數JNH-CαH、計算的φ值a、偶聯常數JCαH-CβH、側鏈群a、和溫度係數(-ppb/K)


a見NMR光譜學實驗部分。
b在DMSO溶液中，認為溫度係數(-δppb/K)在0-2.0-ppb/K範圍內的醯胺質子參與分子內氫鍵或是溶劑屏蔽的。認為大於4.0-ppb/K的數值是完全暴露於溶劑的。
表8化合物6-10中醯胺質子b的偶聯常數JNH-CαH、計算的φ值a、偶聯常數JCαH-CβH、側鏈群a、和溫度係數(-ppb/K)



a，b與表7相同表7和8顯示了使用三態旋轉異構體模型根據測量得到的JCH-CH偶聯常數計算得出的χ1旋轉異構體群。與促生長素抑制素樣結合活性有關的側鏈構象是D-Phe1、D-Trp4、和Lys5的那些。對於化合物1、2、3、6、7、8、9、和10中的第1位殘基而言，最佔優的χ1旋轉異構體一致地是反式的。這種構象容許D-Phe1的芳香族側鏈位於二硫鍵區域附近。這些類似物在D-Phe1芳香族側鏈相對於二硫鍵的取向方面存在一些微小差異。在大多數類似物中，該側鏈採取反式取向，導致二硫鍵與芳香環在空間上密切接近。這種取向還報導於Sandostatin。在位置8中Cα處具有D構型的類似物中，側鏈偏愛g+取向，導致位置1的芳香環遠離二硫鍵。
至於D-Trp4和Lys5的側鏈，生物活性化合物中的χ1旋轉異構體分別是反式和g-，如表7和8中所示。這些旋轉異構體容許D-Trp4和Lys5的側鏈密切接近，這得到了對Lys5的CγH共振觀測到的由D-Trp4芳香環電流引起的高磁場位移的確認。這些構象偏愛性與在親本化合物Sandostatin中發現的非常相似。
這些研究證明所有類似物採取彼此非常相似的構象。另外，這些化合物的構象與Sandostatin及其活性類似物所採取的構象非常相似。主鏈構象可以描述成含有一個D-Trp位於i+1位置的II′型β-轉角的反向平行β-摺疊，而且大多數結構在Phe3和Val6附近摺疊。
在含有碘的分子中，似乎存在對芳香族側鏈自己彼此接近的偏愛。這種趨勢可能產生大塊疏水區域，它可能與受體上的特定疏水區結合。或者，大個疏水碘的存在可能誘導有利於結合受體hsst2和hsst5而非hsst3的構象。
構象分析數據顯示所研究的類似物彼此及與Sandostatin相比具有極大相似性。Val6與Lys5的NH質子之間的中等強度NOE及Lys5與D-Trp4的NH質子之間的NOE缺失說明這些化合物具有D-Trp位於i+1位置的II′型β-轉角。這與Val6NH質子的低溫度係數以及Lys5NH與D-Trp4Hα之間的強順序NOE、Val6NH與Lys5Hα之間的中等強度NOE、和Lys5NH與Lys5Hα之間的中等強度NOE是一致的。
對主鏈其它部分發現的β-摺疊樣構象與對NH4和NH7共振測量的JNH-CαH偶聯常數以及高溫度係數一致(表7和8)。這些溫度係數完全吻合對反向平行β-摺疊結構中NH4和NH7質子預期的溶劑暴露。β-摺疊樣構象還得到了強順序CαH-NH NOE(見H2α-NH3、Hα3-NH4、Hα6-NH7、和Hα7-NH8NOE)和Hα2-Hα7NOE(表5和6)的支持。Hα2-Hα7NOE還指示二硫鍵很好的模擬了β-VI轉角，因為觀察到這種典型的H-H NOE。
Sandostatin的構象分析說明該分子採取多種構象，諸如β-摺疊結構和在C端部分中含有螺旋摺疊的構象。所研究的所有類似物顯示與β-摺疊結構一致的NH6-NH3NOE，只有位置8為Asp的類似物顯示特徵為該區域部分螺旋摺疊的NH7-NH8NOE。這些NOE指示部分螺旋結構在含有Asp殘基的化合物中比在位置8為Thr的化合物更加佔優。
NMR光譜學。使用1H NMR、TOCSY(整體相關性光譜學)、和ROESY(旋轉結構核Overhauser)實驗進行共振賦值。TOCSY實驗用於評估旋轉系統，而ROESY實驗容許根據觀測到的順序NOE連同性dCαH-HN或dHN-HN或可能是dCβH-HN給胺基酸旋轉系統順序賦值。
由1D光譜和DQF-COSY光譜的交叉峰部分得到JNH-CαH和JCαH-CβH偶聯常數。測量得到的NH-CαH和CαH-CβH偶聯常數容許我們估算φ和χ1扭轉角的範圍。鄰近偶聯常數JNH-CαH與扭轉角φ(它表示圍繞骨架單鍵NH-CαH的旋轉狀態)通過Karplus型方程式相關JNH-CαH＝Acos2|φ±60°|-Bcos|φ±60°|+C其中(+)用於D構型而(-)用於L構型，係數是A＝8.6，B＝1.0，和C＝0.4。
偶聯常數JNH-CαH的數值和相應的估算φ角值列於表7和8。
可以使用如下常規表達式來估算各個構象異構體f1(χ1)的分數(a)針對L殘基f(g-)＝(JHα-Hβ1-JG)/(JT-JG)，用於鄰位交叉(-)構象f(t)＝(JHα-Hβ2-JG)/(JT-JG)，用於反式構象f(g+)＝1-[f(g-)+f(t)]，用於鄰位交叉(+)構象(b)針對D殘基f(t)＝(JHα-Hβ2-JG)/(JT-JG)，用於反式構象f(g+)＝(JHα-Hβ1-JG)/(JT-JG)，用於鄰位交叉(+)構象f(g-)＝1-[(f(g-)+f(t))，用於鄰位交叉(-)構象使用反式和旁式的偶聯數值JT＝13.56Hz和JG＝2.60Hz來計算非芳香族殘基的旋轉異構體群，而使用數值JT＝13.85Hz和JG＝3.55Hz來計算芳香族殘基。
來自ROESY光譜的醯胺-β質子NOE和α-β質子NOE的不同強度容許給非對映的β質子賦值。一旦給非對映的亞甲基β質子賦值，可以使用上文方程式計算旋轉異構體群f(t)、f(g+)、f(g-)。然而，在有些情況中，由於β質子的重疊或重要NOE的缺失，因而不能進行非對映異構體賦值。在這些情況中，不可能辨別兩種可能的旋轉異構體群。
分子建模。在SGI IRIX 6.5工作站和Challenge計算機(SiliconGraphics)上進行計算機模擬。將InsightII和DISCOVER程序用於分子機制、動力學計算、和圖形顯現。
首先，使用DGII/InsightII生成200個結構，然後用CVFF91力場和Newton-Ralphson VA09A算法進行約束最小化，其中收斂判據設為0.001Kcal/mol。所有計算在真空中進行，並且使用距離依賴性介電常數來考慮溶劑效應。在模擬中，肽鍵維持反式構象。
將這些結構的扭轉角、NOE距離、和氫鍵樣式與衍生自NMR測量的數值進行比較。使用Karplus型方程式計算與測量得到的JNH-CH偶聯常數一致的扭轉角，並且容忍±30°的誤差。在根據氫鍵進行選擇的情況中，保留其中認為溫度係數大於2.0-ppb/K的NH質子參與氫鍵的結構。放棄與這些實驗約束不一致的結構。使用超過最低能量構象異構體10Kcal/mol的截止值來分揀出剩餘結構中能量高得不切實際的構象。
如下進行聚簇分析首先由調查的所有構象中取出能量最低的構象異構體。使用這些構象異構體作為「種子」擴大成簇，只要選擇的扭轉在30°間隔內。然後重複搜索下一個高能量簇直至找到最高族。在每一次分子動力學模擬前，用3ps初始化動力學平衡系統。在進行徹底搜索可接近構象空間的嘗試中，對簇中能量最低的構象進行1000K的500ps受限分子動力學，步長1fs。將與實驗數據一致的構象異構體如上所述進行相同聚簇分析。最後，選擇每個簇中能量最低的結構作為促生長素抑制素類似物在溶液中的優選構象。
為了調查這些優選構象之間的平衡，進行300K的無限制分子動力學模擬，其中距離依賴性介電常數為1。首先將選擇的構象異構體進行3ps平衡，然後是步長1fs的5ns模擬。每10ps採集結構。在此過程中，觀測構象相互交換。
生物學活性可以在來自經單個人促生長素抑制素受體亞型轉染的CC531細胞(hsst2)和CHO-K1細胞(hsst1、3、和5)的膜上執行結合測定法。可以用分散的大鼠垂體細胞執行抑制生長激素和催乳素分泌的功能測定法。
在人工照明室(08:30-20:30)中飼養體重180-200g的雌性Wistar大鼠(Harlan，荷蘭)，隨意供應食物和水。在09:00-10:00之間通過斷頭術處死動物。處死後5分鐘內切除垂體腺，丟棄神經-中間體葉(neuro-intermediate lobe)，並採集前葉，置於補充了1％胎牛血清(FCS)、青黴素(100U/ml)、鏈黴素(100μg/ml)、兩性黴素B(0.5μg/ml)、和碳酸鈉(0.4μg/L終濃度)的鈣鎂-Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。
用分散酶分離雌性垂體前葉細胞(參閱例如Oosterom等，J.Endocrinol.100(3)353-60，1984)。將散開的細胞以0.5-1×105個細胞/孔的密度接種多孔板。培養基是含Earle氏鹽的Eagle氏極限必需培養基，補充1倍過量的非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、2mML-穀氨醯胺、青黴素(100U/ml)、鏈黴素(100μg/ml)、兩性黴素B(0.25μg/ml)、和10％胎牛血清(Invitrogen，布萊達，荷蘭)。培養基和補充物購自Gibco Bio-Cult Europe(Invitrogen，布萊達，荷蘭)。容許細胞附著至少3天。然後，更換培養基，在含有或不含生長激素釋放抑制因子(SRIF)類似物的條件下保溫4小時，並在1ml完全培養基中加入10nMGH釋放激素(GHRH)，每個處理組使用約四個培養皿。每個實驗的結果表述成激素釋放相對於對照未處理培養皿的變化百分數。通過商業性大鼠GH和PRL測定法(Amersham，英國)來測定大鼠GH和PRL的濃度。
至於促生長素抑制素受體亞型sst2和sst1、3、5分別在大鼠結腸癌(CC531)細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)-K1細胞中的表達，由pBluescript(pBS)切除pBS中的人sst1、sst2、sst3、或sst5cDNA，並插入逆轉錄病毒表達載體pCi-neo的Nhe-1/Sali克隆位點。通過遺傳黴素抗性基因(G418)進行選擇。將此載體用於穩定轉染(使用DOTAP)CC531和CHO-K1細胞。選擇得到穩定轉染的CC531和CHO-K1細胞，並分別在補充了青黴素(100U/ml)、鏈黴素(100μg/ml)、兩性黴素(0.25μg/ml)、和10％FCS+遺傳黴素(0.5mg/ml)的RPMI 1640培養基或營養混合物F12(HAM)培養基中進行培養。
使用由表達各自人促生長素抑制素受體亞型的CC531(sst2)和CHO-K1(sst1、3、5)細胞製備的膜進行競爭性結合實驗(參閱例如Reubi，Life Sci.36(19)1829-36，1985)。將培養細胞的膜製品(對應於約25-50μg蛋白質)在總體積100μl中於室溫保溫45分鐘，其中含有40.000cpm125I標記的[Tyr11]-促生長素抑制素-14(2000Ci/mmol)和數量漸增的未標記類似物。保溫結束時，添加1ml冰冷的Hepes緩衝液(10mMHepes、5mM MgCl2、和0.02g/L桿菌肽pH7.6)，並通過在Eppendorf微離心機中以14,000rpm離心2分鐘將膜結合的放射性與未結合的分開。在冰冷的Hepes緩衝液中清洗剩餘的沉澱，並在γ計數器中對最後的沉澱計數。特異結合定義為結合的放射性配體的總量減去存在1μM未標記類似物時結合的放射性配體。
關於生物學測定法的進一步描述請參閱Hofland和Lamberts，Front Horm Res.32235-52，2004；Hofland等，J.Clin.Endocr inol.Metab.89(4)1577-85，2004；Ferone等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283(5)E1056-66，2002；以及Hofland等，Endocrinology 136(9)3698-706，1995。
這些實驗研究RC-121的特性，並使用這些信息來改進對hsst2和hsst5受體的效力和選擇性特性以及對酶促降解的抵抗力。這些工作導致了對位置1和8的殘基通過與位於跨膜螺旋VI與VII之間的胞外環III(ECLIII)相互作用來控制受體選擇性的作用的興趣增加。
由此，如上所述合成了RC-121的一系列類似物，並如本文所述進行了表徵。例如，[D-Phe1-Asp8](3)的生物學結果將展示對受體hsst2和hsst5的選擇性。
類似物的殘基8保持為Thr或Asp，D和L異構體二者皆可，並且修飾位置1的D-Phe。選擇Asp作為殘基8的修飾。為了修飾位置1，製備了具有疏水性和鹼性二者特徵的非天然胺基酸(4-氨基甲基)-苯丙氨酸。認為在位置1具有芳香族側鏈的弱鹼性胺基酸殘基，諸如胺基酸模塊(4-氨基)-D-Phe-OH，可能增強類似物的效力。因此，在RC-121即D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2SEQ ID NO1中用(4-氨基)-D-Phe-OH取代殘基1即H-D-Phe-OH。據此測定了這組目標結構的結合親和力和功能測定法結果。
位置1具有(4-氨基)-D-Phe-OH的化合物預期展示對受體hsst2和hsst5的有力和選擇性結合。化合物[(4-氨基)-D-Phe1-Thr8](2)預期對hsst2受體的選擇性比hsst5受體高一個數量級。這些化合物可以擔當GH和PRL釋放的抑制物。
為了研究類似物的結合親和力，可以進行碘化測定法。放射性碘化是測定促生長素抑制素受體的組織分布和將有毒水平的放射性投遞至促生長素抑制素受體陽性腫瘤的有用工具，因為數種類型的癌症表達高密度的促生長素抑制素受體。碘已經廣泛用於肽和蛋白質的放射性標記或化學修飾。激素的放射性碘化類似物被用於置換研究的結合測定法(競爭性結合測定法)。
本發明的肽具有兩個芳香族殘基，即Tyr和(4-氨基)-D-Phe-OH。下一修飾聚焦於含芳香族側鏈的殘基的碘化。使用單碘化模塊11和12，合成並鑑定了數種碘化肽模擬物。
合成了酪氨酸上有碘的化合物[(4-氨基)-D-phe1-(3-碘代)Tyr3-Thr8](6)和4-氨基-D-苯丙氨酸上有碘的化合物[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-Thr8](7)。另外，還可以檢驗在分子中添加兩個單碘化殘基的效果。由此，製備了化合物[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Thr8](9)和(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Asp8](10)，前者位置8是Thr，後者位置8是Asp。比較了含有或不含碘的目標分子的活性，並將它們的活性與構象聯繫起來。
肽[(4-氨基-3-碘代)-D-phe1-Thr8](7)和[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Thr8](9)預期展示對hsst2和hsst5受體的有力和選擇性結合，以及抑制GH和PRL二者的能力提高。
本發明的促生長素抑制素類似物具有對受體hsst2和hsst5的選擇性，且對GH和PRL的抑制活性與促生長素抑制素相當。
對映選擇性合成了Trp的β-甲基化類似物，並摻入環六肽類似物L-363，301。測定了c[Pro-Phe-(2R，3S)-β-MeTrp-Lys-Thr-Phe]和c[Pro-Phe-(2R，3R)-β-MeTrp-Lys-Thr-Phe]對促生長素抑制素受體hsst1-5的結合效力和選擇性以進一步檢驗結果。在那些研究中，(2R，3S)類似物比親本肽更有效力，而(2R，3R)類似物的活性低得多。兩種化合物都在納摩爾範圍內結合受體hsst2。證明該類似物對hsst2具有高度選擇性，這與標準化合物L-363，301相反，後者與兩種受體hsst2和hsst5的結合都很好。
含有(2R，3s)-β-MeTrp非對映異構體的肽擁有容許它與hsst2很好結合的「正確」特色組合。這一發現導致後來hsst2選擇性促生長素抑制素類似物的設計。
統計學分析。使用單向方差分析(ANOVA)測定了平均值之間差異的統計學顯著性。當通過這種方法觀測到顯著的整體效果時，使用Newman-Keuls多重比較測試進行比較。數據表述成平均值±sem。小於0.05的P值認為是顯著的。使用GraphPad Prism(聖地牙哥，加利福尼亞州)電腦程式，進行125I-標記[Tyr11]-促生長素抑制素-14取代的IC50值計算。
已經描述了本發明的許多實施方案。然而，應當理解，可以做出多種修改而不違背本發明的精神和範圍。因此，其它實施方案也屬於下文權利要求的範圍之內。
權利要求
1.選自SEQ ID NO1-10之任一的化合物。
2.權利要求1的化合物，其中所述化合物包含二或多碘化芳香族修飾。
3.權利要求1的化合物，其中類似物與放射性元素相連。
4.權利要求3的化合物，其中所述放射性元素選自下組188Re、186Re、鈧-47、銅-67、鎵-72、釔-90、碘-125、碘-131、釤-153、釓-159、鏑-165、鈥-166、鐿-175、鑥-177、錸-186、錸-188、砹-211、和鉍-212。
5.權利要求1的化合物，其中該類似物與胞毒分子相連。
6.權利要求5的化合物，其中所述胞毒分子選自下組紫杉醇、多柔比星、或喜樹鹼。
7.權利要求1的化合物，還包含製藥學可接受載體。
8.在受試者中顯現惡性細胞的方法，包括對受試者施用權利要求3的化合物。
9.在受試者中治療細胞增殖性疾病的方法，包括對受試者施用權利要求1-7之任一項的化合物。
10.權利要求9中的方法，其中所述細胞增殖性疾病包括腫瘤、肢端肥大症、和/或糖尿病。
11.與SS受體2(SST2)和/或SS受體5(SST5)發生選擇性結合的化合物，其中所述化合物具有選自下組的結構(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2、(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2、(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2、(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2、(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2、(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2、(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2、(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2、(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2、和D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2。
12.權利要求11的化合物，還包含放射性核素或用於連接細胞毒素的綴合劑。
13.包含權利要求1或11的化合物和至少一種製藥學可接受載體的混合物的藥物組合物。
14.包含有效量的依照權利要求1的化合物或其製藥學可接受鹽和製藥學可接受載體的藥物組合物。
15.在有所需要的哺乳動物中引發促生長素抑制素受體效應的方法，包括對所述哺乳動物施用有效量的依照權利要求1或11的化合物或其製藥學可接受鹽。
16.在有所需要的哺乳動物中治療催乳素分泌腺瘤、再狹窄、糖尿病、高脂血症、胰島素不敏感、X症候群、血管病、增殖性視網膜病、黎明現象、腎病、胃酸分泌、消化性潰瘍、腸皮膚和胰腺皮膚瘻管、腸應激症候群、傾倒症候群、水瀉症候群、AIDS相關腹瀉、化療誘發的腹瀉、急性或慢性胰腺炎、胃腸激素分泌性腫瘤、癌、肝癌、血管發生、炎性疾病、關節炎、慢性同種異體移植排斥、血管成形術、移植血管出血或胃腸出血的方法，包括對所述哺乳動物施用依照權利要求1或11的化合物或其製藥學可接受鹽。
17.在有所需要的哺乳動物中抑制幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)繁殖的方法，包括對所述哺乳動物施用依照權利要求1或11的化合物或其製藥學可接受鹽。
全文摘要
本發明提供了治療性和診斷性促生長素抑制素類似物，包括放射性治療劑和放射性診斷劑，及其生產和使用方法。
文檔編號C07K14/655GK1852742SQ200480026944
公開日2006年10月25日 申請日期2004年8月20日 優先權日2003年8月20日
發明者M·谷德曼, S·B·摩爾 申請人:加利福尼亞大學董事會