利用HLA‑G分子及其抗原片段製備預防腫瘤和病毒病的廣譜疫苗及其應用的製作方法
2023-05-18 18:15:21
本發明屬於生物醫藥技術領域。具體涉及利用HLA-G胺基酸序列的抗原片段製備廣譜疫苗的應用及方法，該廣譜疫苗可用於預防人體或動物體的腫瘤和病毒引起的疾病。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康和生命的主要疾病之一，其發病率逐年增高並且趨向年輕化。據世界衛生組織1997年報告，當時全球腫瘤患者每年死亡人數高達660萬，預計到2020年全球腫瘤患者將達到1500萬。最新統計資料顯示，近20年來，中國每4至5個死亡者中就有一個死於癌症，癌症已成為人類第一殺手。
腫瘤來勢洶湧，人心惶惶，在治療腫瘤有效藥物研製成功之前，預防腫瘤成為極大的健康需求。然而目前全世界尚未有效的預防腫瘤的技術，研發預防腫瘤先進的方法和技術是及其迫切的任務。
新的病毒或未知病毒不斷出現，一次又一次地給人類帶來嚴重災害。雖然人類尚未研製出治療病毒感染的有效藥物，但是如何預防病毒感染，特別是預防未知病毒或所有病毒的感染更為重要。儘管人類研製出預防某些病毒的疫苗，但是研製預防未知病毒或所有病毒的廣譜疫苗尤其重要，至今未人涉足。如果能研製出預防未知病毒或所有病毒的疫苗，將能抗拒未知病毒或所有病毒對人類的襲擊。人類期盼預防未知病毒或所有病毒的疫苗早日問世。
HLA-G是非經典的HLA I類分子。HLA-G於1987年由Geraghty等克隆並證實。HLA-G分子具有直接抑制多種免疫活性細胞的生物功能，是機體一個重要的免疫耐受分子，在母胎免疫、腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫、及感染免疫中發揮十分重要的作用。研究證實，在腫瘤免疫中，HLA-G能夠抑制NK細胞、T細胞和樹突狀細胞，使機體的免疫系統處於抑制狀態。由於HLA-G對機體的免疫抑制作用，使腫瘤細胞能夠逃脫機體對腫瘤細胞的免疫監控，實現了腫瘤細胞免疫逃逸，腫瘤細胞獲得了自由瘋狂生長的機會。
腫瘤切片的免疫組化染色結果表明，在喉癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等多種惡性腫瘤組織中都能表達HLA-G。另外，在HBsAg、HCAg、HIV、SARS、伊波拉、寨卡等病毒攜帶者的血液樣本中，HLA-G的檢測結果均呈陽性。說明HLA-G在腫瘤組織和病毒性疾病的血液中的表達具有普遍性，使得HLA-G有望成為所有腫瘤細胞和病毒的共同靶標，並有望作為免疫原在預防腫瘤和病毒性疾病方面發揮作用。但是，採用HLA-G全分子製備廣譜疫苗需要經過基因雜交、表達、純化等多道複雜工序，上遊工作量大且成本高昂，不利於疫苗的普及生產和應用。
免疫原的決定簇部位決定著抗原物質在免疫應答中的特異性，每個免疫原分子中均存在有多種或多個決定簇，這些源自腫瘤或病毒性疾病相關的HLA-G分子的決定簇均有望以多肽片段的形式作為免疫原性肽被應用於肽疫苗的活性藥物成分之中。但是，由於免疫應答細胞對不同特定部位的決定簇具有不同程度的親和性，並且免疫原性肽的多肽片段在形成疫苗的過程中也可能隨著結構複雜性的降低而導致免疫原性降低，目前已知的HLA-G分子抗原決定簇並不能為製備廣譜疫苗提供準確有效的應用信息。
技術實現要素：
本發明首先提供了一種抗原片段，包括下述至少一種胺基酸序列：
(1)YW EEE TRN TKA HA(SEQ ID NO:1)；
(2)RGY YNQ SEA SSH TL(SEQ ID NO:2)；
(3)PPK THV THH PVFD(SEQ ID NO:3)；
(4)PLM LRW KQS SL(SEQ ID NO:4)。
其中，所述抗原片段與HLA-G胺基酸序列中任意一段包含至少一種上述胺基酸序列(SEQ ID NO:1-4)的多肽片段、或該多肽片段的同源物、類似物或衍生物的序列相同。該抗原片段的序列可以是人工合成的；也可以優選的是將HLA-G胺基酸序列通過各種方式的縮短剪切而獲得的，該HLA-G胺基酸序列可以是對天然序列經人工分離、或通過基因重組及表達的人工合成等方式而獲得。
進一步，所述HLA-G胺基酸序列包括HLA-G分子各異構體胺基酸序列、以及該HLA-G分子各異構體胺基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物。目前，已知的HLA-G天然分子具有7種異構體，這7中異構體中具有4種不同的胺基酸序列(SEQ ID NO:5-8)，該4種不同的胺基酸序列(SEQ ID NO:5-8)均可作為所述HLA-G胺基酸序列的一種優選的選擇。
進一步，所述HLA-G胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO:5-8之一具有至少15％的同源性，優選為至少具有35％的同源性，還優選為至少具有60％、70％、80％或90％的同源性，更優選為至少具有95％、96％、97％、98％、99％的同源性。
進一步，所述抗原片段優選為序列SEQ ID NO:1-4之一。
進一步，所述抗原片段優選為序列SEQ ID NO:9-12之一。
本發明還要求保護上述抗原片段在製備預防腫瘤和病毒病的廣譜疫苗中的應用。
其中，所述腫瘤和病毒病包括能夠表達HLA-G的所有腫瘤和病毒性疾病，包括未知腫瘤和病毒。這些腫瘤包括：(1)來源於上皮組織的鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、惡性多形性腺瘤和移行上皮癌等；(2)來源於間葉組織的纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞癌、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤和惡性間皮瘤等；(3)來源於淋巴造血組織的淋巴瘤和白血病等；(4)來源於神經組織的神經纖維肉瘤、惡性神經鞘瘤、惡性膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤等；(5)來源於消化道的食管鱗癌細胞瘤、食管腺癌細胞瘤、胃癌腺瘤、胃鱗癌、肝細胞瘤、直腸癌、結腸癌、胰腺癌；(6)來源於呼吸道的非小細胞肺癌；(7)來源於其他組織的黑色素瘤、絨毛膜上皮癌、卵巢癌細胞瘤、喉癌、乳腺癌、精原細胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、無性細胞瘤、胚胎性癌和惡性畸胎瘤等。這些病毒包括：(1)雙鏈DNA病毒中痘病毒科、虹彩病毒科、杆狀病毒科、皰疹病毒科、腺病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、多DNA病毒科、囊泡病毒科、非州豬瘟病毒科等；(2)單鏈DNA病毒中的聯體病毒科、環病毒科、細小病毒科等；(3)DNA和RNA逆轉錄病毒中的嗜肝DNA病毒科、逆轉錄病毒科、假病毒科、轉座病毒科等；(4)雙鏈RNA病毒中的呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科、減毒病毒科等；(5)裸露RNA病毒中的裸露RNA病毒科；(6)負單鏈RNA病毒中的副粘病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、博爾納病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙拉病毒科等；(7)正單鏈RNA病毒中的輕小噬菌體科、動脈炎病毒科、冠狀病毒科、小RNA病毒科。
優選的，這些腫瘤包括：喉癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌；這些病毒包括：HBsAg、HCAg、HIV、SARS、伊波拉、寨卡、登革熱病毒、禽流感病毒。
進一步，所述疫苗通過所述抗原片段在生物體內產生能夠與HLA-G結合的HLA-G抗體而發揮作用。
本發明還提供了製備預防腫瘤和病毒病的廣譜疫苗的方法，包括採用上述抗原片段作為免疫原的步驟。
進一步，所述方法還包括將所述抗原片段與載體蛋白結合成複合物，然後將複合物進行純化的步驟。
進一步，所述抗原片段與載體蛋白的複合物可以通過採用偶聯試劑進行結合而獲得，如採用碳化二亞胺、戊二醛和二異氰酸化合物等，也可以通過構建融合基因經生物體表達而獲得。
其中，所述載體蛋白優選為血藍蛋白，所述偶聯試劑優選為戊二醛。
本發明提供的抗原片段(胺基酸序列SEQ ID NO:1-4及至少包含SEQ ID NO:1-4其中之一的其他抗原片段)，具有高度的結構保守性和較高的免疫活性，能夠通過生物體免疫反應產生HLA-G抗體(HLA-G特異性抗體)，該HLA-G抗體通過與HLA-G結合，能夠阻止HLA-G對機體的免疫抑制作用，切斷腫瘤及病毒免疫逃逸，使腫瘤細胞及病毒易被人體免疫系統清除和消滅。本發明提供的抗原片段僅含有低至10個左右的胺基酸殘基，在保持其免疫活性的前提下極大地降低了合成成本和疫苗製備的上遊工作量，且由於結構的高度保守性使得其具有不亞於、甚至優於一般免疫決定簇序列的結合效果，從實驗數據來看，選用本發明胺基酸序列SEQ ID NO:1-4之一作為疫苗原材料製備的疫苗，經免疫動物後所得抗體的滴度可達1比10萬以上(ELISA法)。
本發明說明書和權利要求書中使用的下列術語，除非另外說明具有下述一般含義，且下述含義被認為在本領域技術人員的知識範圍之內：
「HLA-G胺基酸序列」做廣義理解，不僅理解為包括HLA-G天然分子各異構體的胺基酸序列(如SEQ ID NO:5-8)，還理解為包括HLA-G分子各異構體胺基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物，該HLA-G分子各異構體胺基酸序列的保守性變體、生物活性片段或衍生物中包含有序列SEQ ID NO:1-4中至少一種；這些廣義理解的HLA-G胺基酸序列本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均能夠成為本發明抗原片段的來源，或者，這些廣義理解的HLA-G胺基酸序列本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均具有與本發明抗原片段相同的胺基酸序列。
「胺基酸序列」僅涉及胺基酸殘基排列的一級結構(蛋白質一級結構)，不擴大理解為包含胺基酸序列空間排列的二級及三級結構。
「多肽」泛指具有胺基酸序列的肽鏈，包括寡肽、肽、狹義的多肽(20個胺基酸殘基以上的肽)或蛋白質序列及其片段或部分，可以是糖基化或非糖基化的，胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基可以被修飾或未被修飾。當其胺基酸序列涉及一種天然存在的蛋白質分子的胺基酸序列時，這種「多肽」或「蛋白質」不意味著將胺基酸序列限制為與該天然存在的蛋白質分子相關的完整的或完全一致的天然胺基酸或其序列。
「同源」包括完全同源和部分同源，在本發明具有相對較為廣泛的含義，在描述抗原片段、多肽或胺基酸序列時，指具有相同或相似的結構或功能，或具有相似的胺基酸序列，包括序列的變體、類似物及衍生物；在涉及百分數時，指序列胺基酸殘基的排列上具有一定百分比的相同性。
「類似物」指基本上保持本發明抗原片段活性的多肽，只要該類似物能夠通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產生能夠與HLA-G結合的HLA-G抗體。本發明的多肽「類似物」可以包括：(I)在序列中連續或間隔地插入、缺失、替換一個或多個胺基酸殘基，且所述一個或多個胺基酸殘基的插入、缺失、替換在同一序列中可同時或不同時存在；(II)序列中一個或多個胺基酸殘基的基團被其他基團替換或缺失；(III)序列中一個或多個胺基酸殘基被修飾。
「衍生物」在描述多肽、蛋白質或胺基酸序列時，指由原多肽、蛋白質或胺基酸序列衍生而來的關聯多肽、蛋白質或胺基酸序列。本發明的多肽、抗原片段或胺基酸序列包含這樣的衍生物：能夠通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產生能夠與HLA-G結合的HLA-G抗體。本發明「衍生物」的非限定性例子可以包括：(IV)成熟多肽與另一種化合物融合，或者(V)在胺基酸序列中融合或插入附加的胺基酸序列(linker、蛋白質純化標識序列、酶切位點等)。
「保守」指所涉及的胺基酸序列與原始序列具有較高的相似性或同一性，能夠維持其原始序列基本的結構、生物學活性或功能，一般可以通過相似的胺基酸殘基替換等獲得，例如，賴氨酸和精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間的替換等。
「變體」指具有一個或多個胺基酸改變的胺基酸序列，所述改變可包括胺基酸序列或核酸序列中胺基酸或核苷酸的插入、缺失或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的胺基酸與原胺基酸具有相似的結構或化學性質，如亮氨酸和異亮氨酸之間的替換，也可具有非保守性改變。
「生物活性片段」指該片段能夠基本維持其在生物分子中原有的活性和功能，該片段可以同原始片段相同，也可以在原始片段的基礎上發生改變，改變的部位一般情況下在原始片段的非功能區或非決定簇區域(如linker區)的保守性改變(保守性變體)，但不排除發生非保守性改變的非原始片段，該非原始片段能夠作為通過SEQ ID NO:1-4中至少一種產生HLA-G抗體的本發明抗原片段的來源，或者，該非原始片段本身或其任意一段包含序列SEQ ID NO:1-4中至少一種的片段均具有與本發明抗原片段相同的胺基酸序列。
「活性」在描述本發明的抗原片段或序列SEQ ID NO:1-4之一時，指該抗原片段或序列SEQ ID NO:1-4之一能夠通過人體或動物的免疫反應產生可以與HLA-G結合的HLA-G抗體。
具體實施方式
除有定義外，以下實施例中所用的技術術語具有與本發明創造所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下面結合實施例來詳細說明本發明創造。下述實施例中，製備疫苗用的免疫原均市購或通過商用的合成法進行合成而獲得。
實施例1
用HLA-G 1、HLA-G 5、HLA-G 7分別作為免疫原製備廣譜疫苗。HLA-G 1、HLA-G5、HLA-G 7為HLA-G分子的三個異構體，具有相同的胺基酸序列(SEQ ID NO:5)，其製備疫苗的過程相同，以HLA-G 1為例，疫苗的製備過程如下。
取33mg HLA-G 1溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 1的濃度為660mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 1溶液。然後緩緩加入3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存。
實施例2
用HLA-G 2、HLA-G 6分別作為免疫原製備廣譜疫苗。HLA-G 2、HLA-G 6為HLA-G分子的兩個異構體，具有相同的胺基酸序列(SEQ ID NO:6)，其製備疫苗的過程相同，以HLA-G 2為例，疫苗的製備過程如下。
取24mg HLA-G 2溶於50ml pH7.4,，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 2的濃度為480mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 2溶液。然後緩緩加入2.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.72ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存備用。
實施例3
利用HLA-G 3(SEQ ID NO:7)作為免疫原製備廣譜疫苗：取14mg HLA-G 3溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 3的濃度為279mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 3溶液。然後緩緩加入1.3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.42ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存備用。
實施例4
利用HLA-G 4(SEQ ID NO:8)作為免疫原製備廣譜疫苗：取23mg HLA-G 4溶於100ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。HLA-G 4的濃度為459mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌HLA-G 4溶液。然後緩緩加入2.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.7ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存備用。
實施例5
如果採用兩種或兩種以上HLA-G的異構體作為聯合免疫原製備廣譜疫苗，其操作在實施例1的基礎上把33mg HLA-G 1和3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液和1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液中的33mg、3ml、1ml均乘以n，n代表應用HLA-G異構體的種類數目。例如兩種異構體聯合作為免疫原，n＝2，三種異構體作為聯合免疫原，n＝3。以此類推。
實施例6
採用SEQ ID NO:1的多肽(小肽)作為免疫原製備廣譜疫苗。把33mg血藍蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋後的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日製備的溶液過sephadex-G25層析柱，收取280納米吸收峰，去掉未參加結合的戊二醛及免疫原小肽。然後再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結合免疫原小肽的血藍蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩衝液解吸血藍蛋白與免疫原小肽結合的複合物，並立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經適當濃縮後再經過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽製備成的廣譜疫苗。
實施例7
採用SEQ ID NO:2的多肽(小肽)作為免疫原製備廣譜疫苗。把33mg血藍蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋後的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日製備的溶液過sephadex-G25層析柱,收取280納米吸收峰，去掉未參加結合的戊二醛及免疫原小肽。然後再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結合免疫原小肽的血藍蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩衝液解吸血藍蛋白與免疫原小肽結合的複合物，並立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經適當濃縮後再經過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽製備成的廣譜疫苗。
實施例8
採用SEQ ID NO:3的多肽(小肽)作為免疫原製備廣譜疫苗。由於SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:1的胺基酸數目相同，均為13個胺基酸，二者分子量相差無幾，因此具體操作同實施例6。
實施例9
採用SEQ ID NO:4的多肽(小肽)作為免疫原製備廣譜疫苗。把33mg血藍蛋白溶解在50ml pH7.4，0.01mol的PBS溶液中，在電磁攪拌下，再溶入3.3mg免疫原小肽，繼續攪拌10分鐘，取5％的戊二醛水溶液，用上述PBS溶液稀釋1000倍，取稀釋後的戊二醛溶液0.15ml，在電磁攪拌器的攪拌下逐滴加到上述溶液中，再繼續攪拌30分鐘，放置4℃冰箱過夜。
次日將前日製備的溶液過sephadex-G25層析柱,收取280納米吸收峰，去掉未參加結合的戊二醛及免疫原小肽。然後再過anti-HLA-G親和層析柱，去掉未結合免疫原小肽的血藍蛋白，用pH3.5，0.05Mol的甘氨酸-HCL緩衝液解吸血藍蛋白與免疫原小肽結合的複合物，並立刻用0.05Mol NaOH中和該解吸液，經適當濃縮後再經過實施例1的方法處理得到由免疫原小肽製備成的廣譜疫苗。
實施例10
採用SEQ ID NO:9的多肽作為免疫原製備廣譜疫苗。取3.3mg免疫原多肽溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為66mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽的溶液。然後緩緩加入0.3ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.1ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存。
實施例11
採用SEQ ID NO:10的多肽作為免疫原製備廣譜疫苗。取5.3mg免疫原多肽溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為106mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然後緩緩加入0.48ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.16ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存。
實施例12
採用SEQ ID NO:11的多肽作為免疫原製備廣譜疫苗。取5.9mg免疫原多肽溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為119mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然後緩緩加入0.54ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.18ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存。
實施例13
採用SEQ ID NO:12的多肽作為免疫原製備廣譜疫苗。取11.6mg免疫原多肽溶於50ml pH7.4，0.01M/L PBS溶液中。免疫原多肽的濃度為231mg/L。將該溶液置於電磁攪拌器上，在溶液中放置一個攪拌子，打開電磁攪拌器令攪拌子緩緩攪拌免疫原多肽溶液。然後緩緩加入1.1ml濃度為1mMol/L的KAL(SO4)2-12H2O溶液，在不停地攪拌下滴加0.35ml濃度為1mMol/L的NaOH溶液，繼續攪拌10分鐘，停止攪拌，用0.1Mol/L的HCL調整溶液的pH值到7.4，經無菌過濾後置4℃保存。
實施例14致敏家兔預防腫瘤實驗
實驗組取健康成年家兔9隻，分a，b，c3組，每組3隻，對照組取正常成年家兔9隻，也分成a，b，c3組，每組3隻。實驗組用廣譜疫苗免疫。a組用實施例1獲得的疫苗免疫，b組用實施例6獲得的疫苗免疫，c組用實施例10獲得的疫苗免疫，免疫劑量20微克/kg，每10天免疫1次皮下注射，共免疫3次，檢查抗體滴度達到1:1萬以上(ELISA法)停止免疫。對照組用pH7.4，0.01mol/L PBS對照免疫。每次1毫升，共注射3次。
接種腫瘤細胞試驗：分別給實驗組和對照組皮下多點接種相同數量的卵巢癌細胞株A2780，2000個/ml，3點注射0.5ml。經過1-2個月觀察，發現實驗組均未生長腫瘤，保護率100％，而對照組卻全部生長了腫瘤。實驗證明利用HLA-G廣譜疫苗對預防癌症有效。
實施例15
採用同實施例14相同的方法對其他腫瘤進行預防實驗。實驗過程以及試劑用量可以依據不同腫瘤模型建立的需要而進行常規調整，這對於本領域技術人員是容易實現的。本發明實施例1-13中獲得的各種疫苗均參與不少於5種腫瘤模型的預防實驗，實驗結果均顯示採用本發明的疫苗免疫後，實驗組家兔均未發現腫瘤生長，而對照組家兔均產生腫瘤。
這些腫瘤包括：(1)來源於上皮組織的鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、惡性多形性腺瘤和移行上皮癌等；(2)來源於間葉組織的纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞癌、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤和惡性間皮瘤等；(3)來源於淋巴造血組織的淋巴瘤和白血病等；(4)來源於神經組織的神經纖維肉瘤、惡性神經鞘瘤、惡性膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤等；(5)來源於消化道的食管鱗癌細胞瘤、食管腺癌細胞瘤、胃癌腺瘤、胃鱗癌、肝細胞瘤、直腸癌、結腸癌、胰腺癌；(6)來源於呼吸道的非小細胞肺癌；(7)來源於其他組織的黑色素瘤、絨毛膜上皮癌、卵巢癌細胞瘤、喉癌、乳腺癌、精原細胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、無性細胞瘤、胚胎性癌和惡性畸胎瘤等。
實施例16致敏家兔預防病毒攻擊實驗
實驗組取健康成年家兔9隻，分a，b，c3組，每組3隻，對照組取正常成年家兔9隻。實驗組用廣譜疫苗免疫，其中，a組用實施例2獲得的疫苗免疫，b組用實施例7獲得的疫苗免疫，c組用實施例11獲得的疫苗免疫，檢查抗體滴度達到1:5萬以上(ELISA法)停止免疫。對照組用pH7.4，0.01mol/L PBS對照免疫。
實驗組和對照組分別接種相同劑量的禽流感病毒(0.05-1.0微克/kg/次)通過滴眼或滴鼻進行感染，每日一次，共感染2次，觀察5-20天。統計實驗組和對照組發病家兔只數。實驗結果，實驗組9隻家兔全部未能患病保護率100％，對照組9隻家兔全部患病。實驗結果證實本疫苗具有預防禽流感病毒感染的功能。
實施例17
採用同實施例16相同的方法對其他病毒進行預防實驗。實驗過程以及試劑用量可以依據不同病毒感染模型建立的需要而進行常規調整，這對於本領域技術人員是容易實現的。本發明實施例1-13中獲得的各種疫苗均參與不少於5種病毒感染模型的預防實驗，實驗結果均顯示採用本發明的疫苗免疫後，實驗組家兔均未發現感染病毒，而對照組家兔均感染病毒性疾病。
這些病毒包括：(1)雙鏈DNA病毒中痘病毒科、虹彩病毒科、杆狀病毒科、皰疹病毒科、腺病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、多DNA病毒科、囊泡病毒科、非州豬瘟病毒科等；(2)單鏈DNA病毒中的聯體病毒科、環病毒科、細小病毒科等；(3)DNA和RNA逆轉錄病毒中的嗜肝DNA病毒科、逆轉錄病毒科、假病毒科、轉座病毒科等；(4)雙鏈RNA病毒中的呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科、減毒病毒科等；(5)裸露RNA病毒中的裸露RNA病毒科；(6)負單鏈RNA病毒中的副粘病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、博爾納病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙拉病毒科等；(7)正單鏈RNA病毒中的輕小噬菌體科、動脈炎病毒科、冠狀病毒科、小RNA病毒科。
以上所述僅為本發明創造的較佳實施例而已，並不用以限制本發明創造，凡在本發明創造的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明創造的保護範圍之內。